Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont un ensemble de pathologies rétiniennes incurable provoquant la cécité. Les DRH sont caractérisées par le dysfonctionnement/dégénérescence des photorécepteurs et le remodelage de la structure de la rétine. Une des approches thérapeutiques envisagées pour traiter les DRH est la thérapie génique spécifique, c’est à dire le remplacement du gène défectueux par un gène sain. Cependant, bien qu’efficace, la thérapie génique spécifique n’est pas toujours applicable, en particulier quand la dégénérescence est trop avancée ou quand le gène muté n’est pas connu. Afin de traiter tous les cas de DRH quelle que soit leur origine génétique et leur stade de progression, une approche de thérapie génique d’addition est envisagée : Le transfert d’optogène. Cela consiste à convertir les cellules encore présentes dans la rétine malgré la dégénérescence, en cellule photosensible suite à l’expression d’un optogène (protéine photosensible). Mon projet de thèse a consisté dans un premier temps à évaluer le transfert de gène avec un vecteur AAV2/2 dans les cellules ganglionnaires rétiniennes de chien et de primate non-humain. Cette première partie a permis d’initier un second projet qui a eu pour objectif d’évaluer l’efficacité du transfert d’optogène (Channelrhodopsin-2) pour la restauration de la fonction visuelle dans un modèle canin de dystrophie rétinienne (le chien Rpe65- /-). / Inherited retinal dystrophies (IRD), a group of incurable retinal pathologies, are associated with visual impairments due to a malfunction and/or degeneration of photoreceptors and/or retinal pigment epithelium (RPE). Significant progress in the field of gene therapy has allowed the development and the characterization of an innovative tool to treat IRD patients: recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) that carry and deliver therapeutic nucleic acids. However, due to the heterogenic nature of IRD, gene supplementation will not allow to treat all forms of IRD because: (i) the numbers of mutated genes are unknown according to the state of art; (ii) the dominant forms of IRD in which mutations lead to negative effects are not eligible; (iii) the limit of AAV packaging excludes large-sized mutated genes and (iv) this approach is only applicable when photoreceptors are still alive. To treat all IRD patients, a novel therapeutic approach, independently of the mutated gene and the disease kinetic is suitable: the optogene transfer (light-sensitive protein) to restore photosensitivity in neurodegenerative retina by converting surviving retinal cells into photosensors. The primary goal of my research was to promote and characterize adeno-associated virus type 2-(AAV2) transduction in retinal ganglion cells of dog and non-human primate. A second aim was to investigate the feasibility of AAV2-mediated optogenes transfer in retinal ganglion cells as a therapeutic approach to restore visual function in RPE65 deficient dog, a canine model of IRDs.

Malgré l’avancée considérable des connaissances sur le génome humain, de nombreuses maladies génétiques restent mal comprises car nous ignorons encore quel gène porte la mutation responsable d’une pathologie spécifique. Notre travail s’intègre dans le cadre de l’étude des maladies génétiques héréditaires monogéniques récessives, maladies rares mais qui ensemble touchent près d’1% de la population globale.<p>Les maladies récessives sont des maladies génétiques dont le phénotype malade ne se déclare que lorsque les deux allèles d’un gène sont mutés, hérités chacun d’un parent porteur. L’approche que nous utilisons pour localiser le gène causal dans le génome est l’analyse de liaison génétique. Les familles consanguines sont le profil idéal pour ce type d’étude car l’hypothèse peut être faite que les enfants atteints ont hérité deux fois de la même mutation, chaque allèle malade provenant d’un parent porteur et hérité d’un ancêtre commun relativement proche Dans cette optique, nous établissons une cartographie d’homozygotie (homozygosity mapping) du génome des patients, c à d que nous recherchons à travers le génome complet des zones d’homozygotie indiquant une identité par descente à partir d’un ancêtre commun (1) en à testant systématiquement un grand nombre de marqueurs génomiques polymorphes (microsatellites d’ADN et SNPs) répartis sur tous les chromosomes dans l’ADN extrait de tous les membres de la famille, atteints et non atteints. Ensuite nous inspectons la région homozygote à la recherche des meilleures gènes candidats, que nous séquençons jusqu’à trouver une mutation dont le rôle causal de la pathologie soit convaincant.<p>Nous avons étudié une famille constituée de 2 boucles de consanguinité avec plusieurs enfants atteints d’épilepsie myoclonique progressive (PME). <p>Nous avons criblé le génome entier des patients au moyen d’un kit permettant l’analyse de 382 microsatellites et avons confronté ces résultats avec ceux d’une analyse sur puce de 10.000 SNPs. Cela nous a permis de mettre en évidence un nouveau locus de PME s’étalant sur une dizaine de cM sur la région centromérique du chromosome 7. La valeur maximale du LOD score que nous avons calculé atteint 4.0 rendant ce locus significatif. Dans cet intervalle, contenant environ 85 gènes annotés, nous avons séquencé le gène KCTD7 car il s’agit de l’acronyme pour K+ Channel Tetramerization Domain 7, spéculant sur une interaction potentielle avec un canal potassique. Ce séquençage a révélé une mutation non sens homozygote chez les atteints, hétérozygotes chez les parents, et totalement absente dans une série de 100 contrôles. Cette mutation, sur l’exon 2 de KCTD7, substitue une arginine par un codon stop, tronquant deux tiers de la protéine (289aa total). L’ensemble de ces résultats ont été repris dans une première publication au journal Annals of Neurology en 2007 (2). <p>Au début de ce travail, le gène KCTD7 était une simple annotation génomique. Son ADNc avait été cloné dans un effort systématique à haut débit et des ESTs (expressed sequence tag) en avaient été caractérisés. La famille des protéines KCTDs sont de petites protéines solubles caractérisées par un domaine d’interaction protéine-protéine appelé BTB/POZ. Ces protéines sont impliquées dans une grande variété de processus biologiques. Certaines sont des adaptateurs spécifiques du complexe multimèrique E3 Ubiquitine Ligase (2), d’autres sont impliquées dans l’assemblage des récepteurs GABAb (3), d’autres encore sont des protéines nucléaires, stimulant l’activité polymérase de l’ADN polδ2 (4).<p>Nous avons montré, en utilisant la technique du Northern Blot, que l’ARNm du gène KCTD7 était exprimé de manière ubiquitaire (cerveau, cœur, foie, poumon, intestin, colon, reins, rate, yeux, muscle). Ceci a été confirmé par PCR après transcription inverse à partir d’ARNs provenant des mêmes tissus chez la souris adulte. Nous avons également montré que ce gène était déjà exprimé durant la vie fœtale par PCR après transcription inverse à partir d’embryon de souris (E6.5 à E14.5).<p>Nos Western Blots ne nous ayant pas permis d’observer la protéine endogène dans les extraits tissulaires totaux, nous avons pensé que la protéine pouvait être rapidement dégradée. Nous avons donc mesuré la demi-vie de la protéine KCTD7 recombinante en cellules COS-7 traitées pour différents temps par la cyclohéximide comme inhibiteur de la synthèse protéique. Cette demi-vie a été évaluée à 6h, ce qui indique que KCTD7 n’est pas une protéine hyper-labile. <p>Puisque nous avions l’hypothèse que KCTD7 puisse interagir avec les canaux ioniques membranaire, nous avons cherché à comprendre sa distribution intracellulaire. Ainsi, nous avons déterminé par immuno-fluorescence que la protéine recombinant KCTD7, marquée par les tags GFP, HIS ou HA, avait une distribution essentiellement périnucléaire en cellules COS-7. Lors des immuno-détections, nous avons utilisé soit l’anticorps contre KCTD7, soit l’anticorps contre le tag, afin de renforcer la validité du marquage. Un signal à la membrane plasmique n’ayant pas été détecté, nous avons postulé que KCTD7 n’interagit sans doute pas directement à cette membrane, que ce soit avec des canaux ioniques membranaires ou des récepteurs de neurotransmetteurs (GABAb). Un modèle de régulateur direct de canaux potassiques associés au réticulum endoplasmique a déjà été proposé pour KCNRG, un membre des protéines KCTDs capable de réguler négativement l’activité des canaux Kv1.1 et Kv1.4 par un contrôle de leur expression à la membrane grâce à leur rétention dans le réticulum endoplasmique (6). <p>A l’instar d’autres protéines de la famille des KCTDs, nous avons montré, par des expériences de co-immunoprécipitation, que KCTD7 était capable de former des homodimères, très probablement grâce à son module d’interaction BTB/POZ comme cela à été montré pour d’autres protéines de la même famille (7). Nous avons également montré par co-immunoprécipitation que KCTD7 interagi avec la Cullin-3 alors qu’il ne lie pas la Cullin-1. Cette protéine fait partie d’un complexe protéique impliqué dans l’ubiquitination de certains substrats. Nous avons montré que KCTD7 n’est pas sujet à l’ubiquitination en cellules COS-7 co-transfectées par KCTD7 et l’ubiquitine-flag, ce qui n’exclu pas qu’il puisse l’être dans un autre système ou d’autres conditions expérimentales. L’ubiquitination, quand elle ne conduit pas son substrat à la dégradation par le protéasome, est un processus qui permet le contrôle de l’expression de nombreuses protéines, dont certains canaux ioniques membranaires (KCNQ2/3 et KNCQ3/5 (8), Kv1.3 (9), Kv1.5 (10) et KCNH2 (11)) et certaines enzymes métaboliques défectueuses dans certaines PME (dont Laforine et Maline (12), Cystatine B (13), β-hexosaminidase (14)). KCTD7 pourrait donc cibler la Cullin-3 vers son substrat et sans être ubiquitiné lui-même. <p>Nous avons étudié plus en détail l’expression de KCTD7 (ARN et protéine) dans le cerveau de souris adulte. Nous avons déterminé à la fois par des expériences d’hybridation in situ (ARN) et d’immunohistochimie (protéine) sur des coupes coronales de cerveau de souris adultes CD1 que KCTD7 semble être spécifiquement localisé dans trois régions distinctes :la couche de cellules mitrales des bulbes olfactifs, le gyrus denté et les régions CA1 et CA3 de l’hippocampe, et enfin la couche de cellules de Purkinje du cervelet. Il apparait que ces zones sont atteintes dans un modèle murin de la maladie d’Unverricht-Lundborg (15), la forme la plus fréquente d’épilepsie myoclonique progressive et très proche du phénotype de nos patients.<p>Enfin, nous avons montré en collaboration avec le laboratoire du professeur Schiffmann par des mesures électrophysiologiques (Patch Clamp en cellule entière) que KCTD7 diminue le potentiel de repos (accroît la polarisation) de la membrane cellulaire de neurones corticaux embryonnaires de souris en cultures primaires, diminuant l’excitabilité neuronale en augmentant la conductance de la membrane plasmique. Ces résultats sont compatibles avec l’idée qu’une perte de fonction de la protéine entraîne une augmentation de l’excitabilité neuronale qui est caractéristique de l’épilepsie. Ces données fonctionnelles sur KCTD7 ont fait l’objet d’un manuscrit actuellement en cours de soumission au journal Molecular and Cellular Neuroscience.<p>Les données que nous avons récoltées sur KCTD7 ont précisé un mécanisme probable d’action de la protéine. Malgré les limitations de nos modèles expérimentaux, nous postulons que le défaut de KCTD7 cause l’épilepsie en modifiant la conductance potassique et par là, le potentiel de repos et l’excitabilité de la membrane plasmique des neurones, peut-être par ubiquitination, via la Culline-3, d’un canal potassique. À notre connaissance, il s’agirait de la première PME dont le défaut primaire serait au niveau du potentiel membranaire. Cette hypothèse cadre bien avec l’observation clinique que les patients les plus atteints étaient ceux dont l’épilepsie était la moins bien contrôlée par le traitement, suggérant une dégénérescence secondaire excito-toxique. <p>La suite logique de notre travail serait la définition plus précise de l’expression sub-cellulaire de KCTD7 en microscopie confocale à fluorescence, de son expression spatiale et temporelle chez la souris et si possible chez l’homme, l’étude de l’ubiquitination de sous-unités de canaux potassiques, et le développement d’un modèle animal, poisson zèbre ou souris, afin, entre autres, d’y tester l’hypothèse que la sévérité de l’hyperexcitabilité neuronale elle-même aggrave le phénotype. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La découverte du défaut moléculaire en cause dans les maladies rares est une étape importante en vue d'un traitement spécifique ainsi que d'un meilleur diagnostic, ce qui permet de réduire le délai diagnostique, de mieux connaître l'histoire naturelle de la maladie, et ainsi d'améliorer les traitements symptomatiques et la prévention secondaire. Les gènes de plus de 1500 maladies rares monogéniques restent à découvrir. Beaucoup de maladies rares qui frappent les enfants de parents en bonne santé correspondent à des maladies génétiques récessives autosomiques. Certaines paraissent extrêmement rares mais, une fois le gène identifié dans une famille princeps, beaucoup d'autres cas s'avèrent dus à des défauts du même gène. Les patients que nous étudions sont issus de familles consanguines comptant souvent de nombreux sujets atteints. Une seule famille de ce type peut permettre l'identification du gène par cartographie d'homozygotie et clonage positionnel.<p>Nous avons recruté dans ce travail des cas familiaux ou sporadiques de six maladies autosomiques récessives rares de gène inconnu. <p>La stratégie de cartographie par homozygotie nous a permis de mettre en évidence de nouveaux loci morbides dans quatre de ces maladies (épilepsie myoclonique progressive EPM3 ;syndrome marfanoïde avec microsphérophakie ;atrophie optique isolée ;et syndrome de microcéphalie et diabète précoce) ou de réduire la taille de loci déjà connus (microcéphalies primaires MCPH2 et MCPH4 ;et syndrome de Harboyan CDPD1). Nous avons pu caractériser de nouvelles mutations dans les gènes déjà connus ASPM (microcéphalie primaire MCPH5) et SLC4A11 (syndrome de Harboyan) et corréler celles-ci aux données cliniques. Enfin nous avons identifié les gènes KCTD7 et LTBP2 comme responsables respectivement des maladies EPM3 et syndrome marfanoïde avec microsphérophakie, en y découvrant des mutations chez les malades.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les paraplégies spastiques héréditaires (PSH) font partie d’un groupe plus large de pathologies neurodégénératives associant une spasticité. J’ai exploré la variabilité clinique et moléculaire de ces pathologies à l’aide d’une cohorte de familles soudanaises. Nous avons recruté 41 familles soudanaises [337 individus/106 atteints de PSH]. J’ai extrait l’ADN génomique et constitué une banque. Le criblage de gènes candidats a été réalisé dans 4 familles en fonction du phénotype des patients. La technologie de séquençage de nouvelle génération (SNG) appliquée à 74 gènes de PSH a ensuite été appliquée aux 37 cas restants. Enfin, le séquençage de l’exome a permis de rechercher les gènes en cause dans les cas négatifs. Dans certains cas, des études fonctionnelles ont été utilisées afin de valider l’effet biologique des mutations. J’ai pu identifier la cause génétique dans 17 familles. Dans 12 familles, la mutation concernait un gène de PSH connu. Dans 3 familles, un nouveau gène a été identifié. 5 gènes candidats restent à départager dans 2 familles. Il est à noter que parfois, de multiple mutations ou maladies génétiques ségrégaient dans nos familles, dans la même branche ou dans des branches séparées. La complexité de ces familles fortement consanguines a rendu l’analyse des données du SNG difficile. Une autre particularité a été l’hétérogénéité clinique associée à des mutations du même gène entre patients de la même famille ou en comparaison avec la littérature. Ce travail est la première étude à grande échelle de patients soudanais avec PSH et rapporte de nouveaux gènes en cause, prérequis pour mieux comprendre dans le futur les mécanismes sous-jacents. / Hereditary spastic paraplegias (HSP), a heterogeneous group of spastic neurodegenerative disorders which impose diagnostic challenges. I explored the clinical varieties and genetic pathways of spastic neurodegeneration in a familial Sudanese cohort. We recruited 41 Sudanese families [337 individuals/106 HSP patients]. I have established a genomic DNA bank and when necessary, skin biopsies and fibroblasts were also obtained. A phenotype-based candidate gene approach was followed in 4 families. A targeted next generation sequencing (NGS) for 74 HSP-related genes was the main screening strategy in all-remaining 37 families. Whole exome sequencing (WES) was done in search for novel mutations in new genes in families with negative screening results. Occasionally, functional studies were conducted when feasible and relevant. I identified the genetic cause in 17/41 families. In 12 families, the mutated genes were known HSP genes. In 3 families, novel genes were identified mutated. 5 candidate genes segregated with disease in 2 other families with more experiments needed to conclude. Analysis of the NGS screening panel and of WES data imposed certain challenges as multiple genetic disorders were sometimes found running in parallel in the same/different branches of highly inbred families. We could expand the phenotypic heterogeneity of these disorders due to clinical differences observed between Sudanese patients and patients of other origins even when caused by mutations by the same gene/variant. This is the first genetic screening in a large set of HSP families in Sudan. It describes new causative genes, paving the way for further deciphering of the underlying mechanisms.

L’acétyl-coA occupe une place centrale dans le métabolisme intermédiaire. Il constitue le point de jonction de plusieurs voies métaboliques telles que la .-oxydation, la glycolyse, le catabolisme de certains acides aminés, la cétolyse, la cétogenèse et la synthèse d’acides gras. Il est également impliqué dans d’autres processus tels que l’acétylation des protéines. Au cours de mon travail de thèse, je me suis attachée à étudier différents aspects du métabolisme de l’acétyl-coA. La première partie de mon travail a porté sur la modulation pharmacologique de la .- oxydation dans le but de corriger des déficits de cette voie métabolique. L’intérêt de traitements par 400µM de bézafibrate ou 75µM de resvératrol dans les formes modérées de déficit en VLCAD et en CPT2 avait été montré précédemment. Par des méthodes de référence et grâce à la mise au point de nouvelles techniques, j’ai pu montrer sur des fibroblastes de patients déficitaires en LCHAD que des traitements par une combinaison de 35µM de bézafibrate et 30µM de resvératrol permettent d’augmenter les capacités d’oxydation du palmitate en stimulant la synthèse protéique. L’effet de cette combinaison était comparable à celui d’un traitement par 400µM de bézafibrate. Dans un second temps, je me suis intéressée à deux cofacteurs impliqués dans le métabolisme de l’acétyl-coA : l’acide lipoïque, cofacteur de quatre .-cétoacides déshydrogénases (PDHc, BCKDHc, .- KGDHc et GCS) et la riboflavine, cofacteur d’acyl-coA déshydrogénases de la .-oxydation et de déshydrogénases impliquées dans le catabolisme des acides aminés ramifiés. Ainsi, j’ai participé à la description d’anomalies du métabolisme de l’acide lipoïque, un nouveau groupe de maladies héréditaires du métabolisme caractérisé par un déficit combiné en .-cétoacides déshydrogénases. Par ailleurs, j’ai pu montrer qu’une hyperprolinémie constitue un biomarqueur intéressant pour le diagnostic d’acidurie glutarique de type II primaire ou secondaire, ces dernières pouvant se rencontrer en cas d’anomalie du métabolisme de la riboflavine. J’ai également évalué l’utilisation d’un mélange racémique de L,D-3-hydroxybutyrate afin de corriger les déficits énergétiques induits par un déficit en PDHc ou GLUT1. Via la cétolyse, le L,D-3- hydroxybutyrate génère de l’acétyl-coA. De façon surprenante, l’administration de ce composé s’est traduite par une amélioration de l’état clinique des patients atteints de déficits en PDHc, alors qu’une dégradation a été observée chez les patients atteints de déficits en GLUT1. Cette évolution différente pourrait souligner l’importance de l’anaplérose chez les patients déficitaires en GLUT1. Enfin, la dernière partie de mon travail de thèse porte sur la description d’un patient atteint d’une forme modérée de déficit en pyruvate carboxylase, cette enzyme étant régulée par l’acétyl-coA. Les difficultés diagnostiques rencontrées devant ces formes modérées sont rapportées, ainsi que des essais de traitement par des composés anaplérotiques et par le bézafibrate, malheureusement sans bénéfice net que ce soit in vitro ou in vivo. En conclusion, le métabolisme de l’acétyl-coA est altéré dans de nombreuses maladies héréditaires du métabolisme, dont certaines sont de description récente. Il peut être modulé par différentes approches pharmacologiques. Le développement de nouvelles techniques et notamment les analyses de flux métaboliques fournissent des outils utiles à son exploration et à l’étude de nouveaux traitements. / Acetyl-CoA is crucial for intermediary metabolism. It is at the crossroad of several metabolic pathways such as beta-oxidation, glycolysis, aminoacid catabolism, ketolysis, and fatty acid synthesis. It is also involved in other processes such as protein acetylation. In this document I studied different aspects of acetyl-CoA metabolism. First, I tried to correct fatty acid oxidation defects through pharmacological approach. Thanks to well- known methods and new ones, I showed that a combination of 30µM resveratrol and 35µM bezafibrate increased fatty acid oxidation capacities by increasing protein synthesis, as well as 400µM bezafibrate. Acetyl-CoA metabolism is also altered due to cofactors defects such as lipoic acid or riboflavine deficiency. I was involved in new diseases description and research for new biomarkers in this context. PDHc and GLUT1 deficiency are two different diseases with the same consequence : a defect in acetyl- CoA production from glucose. In order to improve patients’ quality of life, I evaluated the substitution of ketogenic diet with a racemic mix of L,D-3-hydroxybutyrate in PDHc and GLUT1 deficiency. The clinical evolution of patients was strikingly different, with an improvement in PDHc patients, whereas a degradation was noticed in GLUT1 patients. This difference might underline the role of anaplerosis in GLUT1 deficiency. Finally, I evaluated anaplerotic treatment and bezafibrate treatment in pyruvate carboxylase deficiency, an enzyme allosterically regulated by acetyl-CoA. To conclude, acetyl-CoA metabolism is altered in numerous inherited errors of metabolism, some of them being recently described. It can be modulated by pharmacological approaches. The development of new techniques such as metabolic flux analysis are useful for its study and for new treatments evaluation.

Les ciliopathies rétiniennes sont un groupe de maladies rares causés par des mutations de gènes ciliaires. Les défauts des gènes ciliaires peuvent causer des défauts de trafic de protéines et induit l'apoptose des cellules photoréceptrices causés par le stress du réticulum endoplasmique (RE). On a étudié ciliopathies rétiniennes par modèle mourin, amaurose congénitale de Leber, rétinopathie pigmentaire liée à l’X, syndrome de Bardet-Biedl, syndrome d’Alström. Les souris Bbs1-/- , Bbs10-/- et CEP290-/- ont monté une diminution de la fonction rétinienne et sont causée par ER stress. Les souris Rd9/y et Alms1foz/foz présentent une apparition tardive et avec un faible taux de dégénérescence rétinienne et ils pourrait être causée par d'autres mécanismes. Le traitement GV-Ret basé sur le stress du RE pourrait sauver à la fois la fonction de et la morphologie de la rétine dans souris BBS. / Retinal ciliopathies are a group of rare diseases caused by mutations of ciliary genes. Defects in ciliary genes can cause defects in proteins traffics and induces apoptosis of photoreceptor cells caused by stress of the endoplasmic reticulum (ER) .We studied retinal ciliopathies by mice models, Leber congenital amaurosis, Xlinked retinitis pigmentosa, Bardet-Biedl syndrome and Alström Syndrome. The Bbs1-/-, Bbs10-/- and CEP290-/- mice exhibited a decrease in retinal function caused by ER stress. Rd9/y and Alms1foz/foz mice showed a late onset and a low rate of retinal degeneration and they could be caused by other mechanisms. The GV-Ret treatment based on ER stress could save both the function and morphology of the retina in BBS mice .