Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal. / Recognized in 1982 as a human pathogen, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) causes bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). EHEC belonging to serotype O157:H7 are mostly important in North America, United Kingdom and Japan. Shiga toxin (Stx) is the critical factor of STEC. Stx is capable to interrupt the protein synthesis of the eukaryotic cell. Two subgroups of Stx are known, Stx1 and Stx2. Two variants of Stx1 are known (Stx1c and Stx1d), but several Stx2 variants have been described. Epidemiological studies suggest that STEC/EHEC strains carrying the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are more frequently associated to HUS. Besides the expression of Stx, EHEC O157:H7 colonize the intestinal mucosa inducing the formation of characteristic histopathological lesions denominated attaching/effacing (A/E). To the production of A/E lesions, it is necessary the presence of a pathogenicity island called LEE (locus of enterocyte effacement), composed by five operons, LEE 1 to LEE5. An outer membrane adhesin (intimin) and its receptor Tir, which is translocated by a type three secretion sytem (TTSS), are both codified in LEE5 while the secreted proteins EspA, B and D, that constitute part of the SSTT, are codified in LEE4. Cattle are the main reservoir of this pathogen and foods of bovine origin and products contamined with bovine feces are common causes of epidemic outbreaks. In Brazil, EHEC O157:H7 can be isolated from the animal reservoir . Stx2c prevails among the bovine strains, while the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are found among the human strains. Concerning the bacterial interaction with human enterocytes cultivated in vitro (Caco-2) we verified that both bovine and human strains showed almost identical ability to invade and to persist in the intracellular compartment of the Caco-2 cells. However, in comparison with the human strains, the bovine strains showed a reduced capacity to produce A/E lesions according to the FAS test. A quantitative FAS test confirmed the relative inefficiency of bovine strains to induce A/E lesions. We also used qPCR to follow the transcription of three genes (eae, espA and tir) of selected bovine and human strains, during the infection of Caco-2 cells. We verified differences in the gene expression, especially for espA, between bovine and human strains and these latter showed a larger expression, in line with the findings of the actin-aggregation tests. Through cloning and expression of recombinant proteins, we purified the Eae, EspA and Tir proteins and obtained specific antibodies, employed to follow the expression of those proteins, by immunofluorescence, along the infection of Caco-2 cells. We found that all proteins are detected both in bovine and human strains, but on these protein labeling occurs early and becomes more intense with the progress of the infection. Our results indicate that EHEC O157:H7 strains isolated from the bovine reservoir in Brazil shows, in comparison to strains isolated from human disease, important differences in relation to the toxigenic profile and the ability to induce A/E lesions. Our findings concerning the ability of the microorganism to invade and to multiply inside enterocytes can explain the persistence of the pathogen in the animal reservoir and its ability of horizontal transmission.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal. / Recognized in 1982 as a human pathogen, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) causes bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). EHEC belonging to serotype O157:H7 are mostly important in North America, United Kingdom and Japan. Shiga toxin (Stx) is the critical factor of STEC. Stx is capable to interrupt the protein synthesis of the eukaryotic cell. Two subgroups of Stx are known, Stx1 and Stx2. Two variants of Stx1 are known (Stx1c and Stx1d), but several Stx2 variants have been described. Epidemiological studies suggest that STEC/EHEC strains carrying the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are more frequently associated to HUS. Besides the expression of Stx, EHEC O157:H7 colonize the intestinal mucosa inducing the formation of characteristic histopathological lesions denominated attaching/effacing (A/E). To the production of A/E lesions, it is necessary the presence of a pathogenicity island called LEE (locus of enterocyte effacement), composed by five operons, LEE 1 to LEE5. An outer membrane adhesin (intimin) and its receptor Tir, which is translocated by a type three secretion sytem (TTSS), are both codified in LEE5 while the secreted proteins EspA, B and D, that constitute part of the SSTT, are codified in LEE4. Cattle are the main reservoir of this pathogen and foods of bovine origin and products contamined with bovine feces are common causes of epidemic outbreaks. In Brazil, EHEC O157:H7 can be isolated from the animal reservoir . Stx2c prevails among the bovine strains, while the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are found among the human strains. Concerning the bacterial interaction with human enterocytes cultivated in vitro (Caco-2) we verified that both bovine and human strains showed almost identical ability to invade and to persist in the intracellular compartment of the Caco-2 cells. However, in comparison with the human strains, the bovine strains showed a reduced capacity to produce A/E lesions according to the FAS test. A quantitative FAS test confirmed the relative inefficiency of bovine strains to induce A/E lesions. We also used qPCR to follow the transcription of three genes (eae, espA and tir) of selected bovine and human strains, during the infection of Caco-2 cells. We verified differences in the gene expression, especially for espA, between bovine and human strains and these latter showed a larger expression, in line with the findings of the actin-aggregation tests. Through cloning and expression of recombinant proteins, we purified the Eae, EspA and Tir proteins and obtained specific antibodies, employed to follow the expression of those proteins, by immunofluorescence, along the infection of Caco-2 cells. We found that all proteins are detected both in bovine and human strains, but on these protein labeling occurs early and becomes more intense with the progress of the infection. Our results indicate that EHEC O157:H7 strains isolated from the bovine reservoir in Brazil shows, in comparison to strains isolated from human disease, important differences in relation to the toxigenic profile and the ability to induce A/E lesions. Our findings concerning the ability of the microorganism to invade and to multiply inside enterocytes can explain the persistence of the pathogen in the animal reservoir and its ability of horizontal transmission.