Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T14:23:59Z No. of bitstreams: 1 Nivea Farias Luz Ativação...2015.pdf: 10567971 bytes, checksum: 1479b4bbd75d3db2ffcf895208002d81 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T14:24:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Nivea Farias Luz Ativação...2015.pdf: 10567971 bytes, checksum: 1479b4bbd75d3db2ffcf895208002d81 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-04T14:24:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nivea Farias Luz Ativação...2015.pdf: 10567971 bytes, checksum: 1479b4bbd75d3db2ffcf895208002d81 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Leishmaniose visceral (LV) apresenta ampla distribuição geográfica e é fatal caso não seja tratada. As manifestações hematológicas são constantes na LV e em casos não tratados os pacientes evoluem à óbito por sangramento maciço ou anemia grave. Neste cenário, mecanismos ligados à morte celular, hemólise, metabolismo do heme e atividade da enzima heme oxigenase podem estar envolvidos na imunopatogênese da LV. A heme oxigenase (HO) tem importantes propriedades regulatórias e está envolvida em processos fisiológicos e patofisiológicos como citoproteção e inflamação. Nesse projeto testamos a hipótese de que a ativação da enzima heme oxigenase-1 (HO-1) favorece a infecção por Leishmania infantum chagasi, principal agente etiológico da LV humana no Brasil e de que mecanismos de morte celular inflamatória induzida por heme estão associados com a resistência ao parasita. Nossas observações nesse trabalho indicam que a enzima HO-1 é induzida em macrófagos durante a infecção por L. chagasi e que a indução farmacológica da HO-1, pela CoPP aumenta a carga parasitária de macrófagos infectados por L. chagasi e reduz a produção de mediadores próinflamatórios. Além disso, a HO-1 favorece um ambiente anti-inflamatório onde prevalece a presença de IL-10 sobre a de TNF. Macrófagos derivados de medula óssea de camundongos deficientes no gene HO-1 têm menor carga parasitária, quando infectados por L. chagasi em comparação aos macrófagos de camundongos selvagens. Além disso, pacientes com LV apresentam maiores níveis de heme-oxigenase 1 e de heme no soro. Nossas observações indicam que heme é capaz de induzir necroptose em macrófagos humanos, e de que moléculas da via da necroptose estão associadas com a resistência na infecção por Leishmania. A molécula RIPK1 controla a replicação de Leishmania por um mecanismo independente da produção de IL-1β, enquanto que a molécula PGAM5 depende de IL-1βpara controlar o crescimento do parasita. Por fim, encontramos que essas proteínas participam do controle da replicação por Leishmania em um modelo experimental de Leishmaniose cutânea. Esses achados indicam um potencial deletério para a HO-1 na infecção por L. chagasi, e um papel protetor da necroptose na infecção porLeishmania. / Visceral leishmaniasis (VL) is a widespread disease and is fatal if left untreated. Hematological manifestations are common in VL and untreated patients evolve to death from massive bleeding and severe anemia. In this scenario, mechanisms related to cell death pathways, hemolysis, heme metabolism and enzymatic activity of heme oxygenase may be involved in the immunopathogenesis of the disease. Heme oxygenase (HO) has important regulatory properties and is involved in patho-physiological processes such as cytoprotection and inflammation. This project tested the hypothesis that heme oxygenase- 1 (HO-1) activation favors Leishmania infantum chagasi infection, the main etiologic agent of human VL in Brazil, we also tested whether heme induced inflammatory cell death pathways are involved in resistance to Leishmania infection. Our observations indicate that HO-1 is induced in macrophages infected with L. infantum chagasi and pharmacological induction for HO-1 by CoPP increases parasite load of infected macrophages and reduces production on inflammatory mediators. In addition, HO-1 contributes to the anti inflammatory pathway that favors L. chagasi replication through a higher IL-10/TNF-α ratio in macrophages. We also observed that bone marrow derived macrophages knockout to HO-1 gene have a significant lower parasite load when infected by L. infantum chagasi than their wild type counterparts. Beyond this, we found that patients with VL presented higher systemic concentrations of HO- 1 and heme than healthy individuals. We found that heme is able to induce programmed necrosis “necroptosis” in human cells and that molecular players from necroptosis pathway contribute to resistance to Leishmania infection. RIPK1 controls Leishmania replication through a mechanism independent of IL-1β production, while PGAM5 requires IL-1β to control Leishmania replication. Finally, we found that RIPK1 and PGAM5 play an important role in controlling Leishmania replication in a cultaneous leishmaniasis experimental model. Our findings argue that HO-1 has a critical role in L. chagasi replication and necroptosis pathway is involved in resistance against Leishmania infection.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo / Trypanosoma cruzi, the ethiologic agent of Chagas disease, is transmitted through triatomine vectors during their blood-meal on vertebrate host. These hematophagous insects ingest blood about 6 to 12 times its original weight, reaching in a single meal about 10 mM heme bound to hemoglobin. Heme (iron protoporphyrin IX) is an important molecule in metabolism of all living organisms. One important intracellular mechanism to control heme homeostasis is its enzymatic degradation by heme oxygenase (HO). HO catalyzes the degradation of heme to biliverdin (Bv), carbon monoxide and iron. HO is absent in T. cruzi genome, thus we have been investigating the presence of a functional HO in this parasite, since our previous results showed a presence of biliverdin in heme-treated epimastigotes. In the present work, we evaluated the effect of SnPPIX, a HO-1 inhibitor, CoPPIX, a HO inducer, and Bv upon T. cruzi epimastigotes proliferation. The addition of SnPPIX decreased the parasite proliferation in the absence or in the presence of heme. When Bv was added to the culture this effect was reversed; Bv increases the parasite proliferation in the presence of heme. On the other hand, CoPPIX did not interfered on proliferation. Furthermore, we showed through immunoblotting, using an anti-HO-1 monoclonal antibody, an increase in the protein expression in heme-treated epimastigotes. Differently of described HO-1 that has a mass molecular of a 32 kDa, we showed a 45 kDa protein, the only band recognize by the HO-1 antibody. HO-1 expression analysis in the presence of CoPPIX, SnPPIX and biliverdin, showed that only CoPPIX was able to modulate its expression level. Ultrastructural immunocytochemistry analysis suggests a higher expression of the enzyme in heme-treated epimastigotes, and that T. cruzi HO-1 might have a dual distribution, since the anti-HO-1 antibody labeled both cytosol and glycosomes. In order to investigate the T. cruzi HO-1 gene sequence, we isolated genomic DNA from T. cruzi for PCR amplification using primers designed as from the parasite genome. Unfortunately, the two pairs of the designed oligonucleotides tested were unable to amplify a sequence equivalent to a HO-1. In order to isolate the target protein, immunoprecipitation was performed and subsequently immunoblotted with anti-HO-1 antibody. The immunocomplex level was two-fold higher in heme-treated cells. Following the attempt to identify a HO-1 in T. cruzi, we used mass spectrometry from unidimensional electrophoresis. We showed a significant protein profile modification in heme-treated epimastigotes, but further experiments will be necessary, such as mass spectrometry from bidimensional electrophoresis, for identification of the target protein

A enzima heme oxigenase I cataliza a reação de clivagem da molécula heme, gerando como produtos ferro, monóxido de carbono e biliverdina. Essa enzima pode ser induzida por diversos estímulos, tais como heme, metais pesados, xenobióticos, UV, fatores endócrinos e metaloporfirinas. HO-1 tem sido descrita como protetora uma vez que remove as moléculas de heme livre, extramente danosas para a célula quando em excesso, liberando em troca produtos com alta capacidade antioxidante. As diversas funções desempenhadas pelo grupo heme dentro da célula fazem da atividade da enzima HO-1 uma etapa fundamental para o controle da homeostase celular. A primeira parte do presente trabalho tem por objetivo a análise da expressão da HO-1 durante a diferenciação de células eritróides. Obstante ao fato dessas células possuírem uma alta taxa de síntese de heme, nada se sabe sobre o comportamento da HO-1 durante o processo de diferenciação das células vermelhas. Através de uma série de experimentos, demonstramos de forma clara que a enzima HO-1 tem sua expressão regulada de forma positiva durante o processo de diferenciação. Além disso, demontramos que a modulação da expressão dessa enzima pode interferir no processo de hemoglobinização. Por fim, na segunda parte desse trabalho, elaboramos uma hipótese sustentando que alelos específicos da enzima HO-1 estariam sendo selecionados em regiões endêmicas de malária. Alelos diferentes para HO-1 resultam em uma atividade catalítica maior ou menor da enzima, o que em ultima análise estaria interferindo na remoção do excesso de heme acumulado em patologias caracterizadas por alta hemólise. Portanto, o presente trabalho destaca importância da enzima HO-1 em aspectos até então pouco observados na literatura, sempre destacando a importância da molécula heme, uma vez que a mesma desempenha inúmeras funções em nível celular. / The enzyme heme oxygenase I catalyzes the reaction of heme cleavage generating iron, carbon monoxide and biliverdin. This enzyme is induced by a wide variety of stimuli such as heme, heavy metals, xenobiotics, UV, endocrine factors and metaloporphirins. HO-1 is described as a protector factor once it removes potentionally toxic free heme and releasing in exchange products with high antioxidant proprieties. The heme molecule has multiple celullar functions and, as a consequence, the reaction catalyzed by HO-1 plays a fundamental role controlling cellular homeostasis. The first part of the present study has the objective to analyze the expression of HO-1 during the erythroid differentiation. Although red blood cells show the highest rate of heme synthesis in the organism, nothing is known about HO-1 pattern of expression during the differentiation of these cells. Our results clearly show HO-1 being positively regulated during red blood cell developing. Furthermore, modulation in the HO-1 expression resulted in alterations of the hemoglobinization process. Finally, in the second part of this study, we elaborate a hipothesis supporting that HO-1 specific alleles are being selected on malaria endemic regions. HO-1 allelic variants confer different enzymatic activities, which in turn interfer on the clearance of the heme accumulated during the development of certain pathologies like hemolitic disorders. Therefore, our study stress the importance of HO-1 regarding aspects poorly investigated in the literature so far, always considering the HO-1 substrate, heme, as the main responsible for the wide variety of functions displayed by this enzyme in the organism.

As heme oxigenases catalisam a degradação do grupo heme produzindo bileverdina, monóxido de carbono (CO) e ferro. A heme oxigenase I (HO-1) é a isoforma indutível e está dentro do grupo das proteínas de choque térmico. A expressão dessa enzima é desencadeada como resultado de diversos estímulos de estresse. Evidências presentes na literatura sugerem um papel fundamental da HO-1 no crescimento e morte celular. Apesar da maioria das evidências confirmarem o efeito citoprotetivo (anti-apoptótico) da HO-1, ainda existem muitas controvérsias a esse respeito. Já foi demonstrado que a HO-1 pode exercer diferentes efeitos na sobrevivência celular incluindo a indução de apoptose, dependente dos níveis de expressão da enzima bem como do tipo celular. A linhagem célular pré-monocítica, U937, e a linhagem celular linfoblástica, Jurkat, foram submetidas a restrição de soro mais hemina 20μM (grupo heme oxidado, indutor de HO-1), durante diferentes tempos, e a quantidades crescentes de hemina durante 24h sem restrição de soro. Após 12h, ambas as linhagens celulares demonstraram, no tratamento envolvendo restrição de soro mais hemina, um aumento significativo (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 135 pmol/min/mg proteina, e Jurkat, 384 pmol/min/mg proteina) quando comparado aos controles. A adição do inibidor específico de HO-1, zinco II protoporfirina IX (ZnPP), resultou em um diminuição significativa (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 70 pmol/min/mg proteina, and Jurkat, 150 pmol/min/mg proteína), demonstrando um papel ativo da HO-1 na apoptose induzida pelo tratamento que empregou restrição de soro mais hemina. As linhagens celulares mostraram comportamentos distintos quando tratadas com quantidades crescentes de hemina, de forma que não se atingiu a super-expressão da enzima HO-1. A linhagem celular Jurkat apresentou uma regulação negativa na expressão de HO-1 em quantidades crescentes de hemina, resultado esse sem precedentes na literatura, indicando uma regulação diferenciada dessa enzima nessa linhagem celular. Esses resultados indicam que a atividade de HO-1 é importante para manter os altos níveis de caspase 3/7. Portanto, no sistema de estresse gerado pela restrição de soro mais hemina, a HO-1 estaria agindo como um regulador positivo da apoptose.

A enzima heme oxigenase I cataliza a reação de clivagem da molécula heme, gerando como produtos ferro, monóxido de carbono e biliverdina. Essa enzima pode ser induzida por diversos estímulos, tais como heme, metais pesados, xenobióticos, UV, fatores endócrinos e metaloporfirinas. HO-1 tem sido descrita como protetora uma vez que remove as moléculas de heme livre, extramente danosas para a célula quando em excesso, liberando em troca produtos com alta capacidade antioxidante. As diversas funções desempenhadas pelo grupo heme dentro da célula fazem da atividade da enzima HO-1 uma etapa fundamental para o controle da homeostase celular. A primeira parte do presente trabalho tem por objetivo a análise da expressão da HO-1 durante a diferenciação de células eritróides. Obstante ao fato dessas células possuírem uma alta taxa de síntese de heme, nada se sabe sobre o comportamento da HO-1 durante o processo de diferenciação das células vermelhas. Através de uma série de experimentos, demonstramos de forma clara que a enzima HO-1 tem sua expressão regulada de forma positiva durante o processo de diferenciação. Além disso, demontramos que a modulação da expressão dessa enzima pode interferir no processo de hemoglobinização. Por fim, na segunda parte desse trabalho, elaboramos uma hipótese sustentando que alelos específicos da enzima HO-1 estariam sendo selecionados em regiões endêmicas de malária. Alelos diferentes para HO-1 resultam em uma atividade catalítica maior ou menor da enzima, o que em ultima análise estaria interferindo na remoção do excesso de heme acumulado em patologias caracterizadas por alta hemólise. Portanto, o presente trabalho destaca importância da enzima HO-1 em aspectos até então pouco observados na literatura, sempre destacando a importância da molécula heme, uma vez que a mesma desempenha inúmeras funções em nível celular. / The enzyme heme oxygenase I catalyzes the reaction of heme cleavage generating iron, carbon monoxide and biliverdin. This enzyme is induced by a wide variety of stimuli such as heme, heavy metals, xenobiotics, UV, endocrine factors and metaloporphirins. HO-1 is described as a protector factor once it removes potentionally toxic free heme and releasing in exchange products with high antioxidant proprieties. The heme molecule has multiple celullar functions and, as a consequence, the reaction catalyzed by HO-1 plays a fundamental role controlling cellular homeostasis. The first part of the present study has the objective to analyze the expression of HO-1 during the erythroid differentiation. Although red blood cells show the highest rate of heme synthesis in the organism, nothing is known about HO-1 pattern of expression during the differentiation of these cells. Our results clearly show HO-1 being positively regulated during red blood cell developing. Furthermore, modulation in the HO-1 expression resulted in alterations of the hemoglobinization process. Finally, in the second part of this study, we elaborate a hipothesis supporting that HO-1 specific alleles are being selected on malaria endemic regions. HO-1 allelic variants confer different enzymatic activities, which in turn interfer on the clearance of the heme accumulated during the development of certain pathologies like hemolitic disorders. Therefore, our study stress the importance of HO-1 regarding aspects poorly investigated in the literature so far, always considering the HO-1 substrate, heme, as the main responsible for the wide variety of functions displayed by this enzyme in the organism.

As heme oxigenases catalisam a degradação do grupo heme produzindo bileverdina, monóxido de carbono (CO) e ferro. A heme oxigenase I (HO-1) é a isoforma indutível e está dentro do grupo das proteínas de choque térmico. A expressão dessa enzima é desencadeada como resultado de diversos estímulos de estresse. Evidências presentes na literatura sugerem um papel fundamental da HO-1 no crescimento e morte celular. Apesar da maioria das evidências confirmarem o efeito citoprotetivo (anti-apoptótico) da HO-1, ainda existem muitas controvérsias a esse respeito. Já foi demonstrado que a HO-1 pode exercer diferentes efeitos na sobrevivência celular incluindo a indução de apoptose, dependente dos níveis de expressão da enzima bem como do tipo celular. A linhagem célular pré-monocítica, U937, e a linhagem celular linfoblástica, Jurkat, foram submetidas a restrição de soro mais hemina 20μM (grupo heme oxidado, indutor de HO-1), durante diferentes tempos, e a quantidades crescentes de hemina durante 24h sem restrição de soro. Após 12h, ambas as linhagens celulares demonstraram, no tratamento envolvendo restrição de soro mais hemina, um aumento significativo (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 135 pmol/min/mg proteina, e Jurkat, 384 pmol/min/mg proteina) quando comparado aos controles. A adição do inibidor específico de HO-1, zinco II protoporfirina IX (ZnPP), resultou em um diminuição significativa (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 70 pmol/min/mg proteina, and Jurkat, 150 pmol/min/mg proteína), demonstrando um papel ativo da HO-1 na apoptose induzida pelo tratamento que empregou restrição de soro mais hemina. As linhagens celulares mostraram comportamentos distintos quando tratadas com quantidades crescentes de hemina, de forma que não se atingiu a super-expressão da enzima HO-1. A linhagem celular Jurkat apresentou uma regulação negativa na expressão de HO-1 em quantidades crescentes de hemina, resultado esse sem precedentes na literatura, indicando uma regulação diferenciada dessa enzima nessa linhagem celular. Esses resultados indicam que a atividade de HO-1 é importante para manter os altos níveis de caspase 3/7. Portanto, no sistema de estresse gerado pela restrição de soro mais hemina, a HO-1 estaria agindo como um regulador positivo da apoptose.

Myoglobin (Mb) is a well characterized hemeprotein found in skeletal muscle. The dimethylester heme-substituted derivative of equine Mb (DME-Mb) was prepared to evaluate the involvement of the heme propionate groups in the electron transfer reactions of Mb. To achieve this goal, an efficient procedure to reconstitute and purify DME-Mb in high yield was developed. The near UV-visible absorption spectra of DME-Mb in various states of ligation and oxidation did not change significantly relative to those of native Mb. The ¹H NMR spectra obtained for native metMb (heme Fe(III) oxidation state) and metDME-Mb showed differences in the electromagnetic environment of their respective heme groups. The reactivity of DME-Mb was different from that of native Mb. For example the water ligand of metDME-Mb (Fe-H₂O) has a lower pKa than that of native metMb as determined by spectroscopic pH titrations. The autoxidation rate of oxyDME-Mb (Fe(II)-O₂) is faster than that of native oxyMb. MetDME-Mb apparently has a binding affinity for ferricyanide not evident in native metMb. Compared to native Mb, DME-Mb has decreased susceptibility to the oxidant hydrogen peroxide. The oxidation-reduction equilibrium of DME-Mb has been studied under a variety of solution conditions. At standard conditions (pH 7, I=0.1 M and 25°C) the midpoint reduction potential (Em) of DME-Mb is 100.0(2) mV vs. SHE, which is 39 mV higher than the Em of native Mb. Analysis of the pH dependence of Em showed differences in the identity or pKa between titratable groups found in native and DME-Mb. The ionic strength dependence of Em showed a higher net positive charge estimate for DME-Mb than native Mb consistent with the nature of the chemical modification involved. The temperature dependence of Em showed that DME-Mb has a greater difference in stability between oxidation states than native Mb. The kinetics of metDME-Mb reduction by Fe(EDTA)²⁻were also studied under a variety of conditions. At standard conditions, metDME-Mb reacted with the reductant Fe(EDTA)²⁻ at a second order rate constant (k₁₂) two orders of magnitude greater than that of native metMb. After correcting for the differences in reduction potential between reactants, metDME-Mb still reacted at a significantly faster rate than native metMb, indicating differences in their reaction mechanisms. The pH, temperature and ionic strength dependences of k₁₂ for DME-Mb and Fe(EDTA)²⁻ showed that DME-Mb had electrostatic and thermodynamic properties significantly different from that of native Mb. The functional differences between DME-Mb and native Mb can be attributed to the structural and electrostatics properties of the heme propionate groups. The interactions of these groups within the surrounding protein and the external environment are discussed with reference to the structure of Mb available from x-ray crystallographic studies. As a result, it is concluded that the heme propionate groups are involved in the structural stability, electron transfer specificity and reactivity of Mb. / Medicine, Faculty of / Biochemistry and Molecular Biology, Department of / Graduate

Heme proteins, also termed cytochromes, are a widespread class of metalloproteins containing an Fe-protoporphyrin IX cofactor. They perform numerous functions in nature such as oxygen-transport by hemoglobin, monooxygenation reactions catalyzed by Cytochrome P-450, and electron transfer reactions during photosynthesis. The differences between proteincofactor binding characteristics and the cofactor environment greatly influence the extensive range of functions. In this dissertation, proteins from the Mtr pathway of Shewanella oneidensis are characterized. These c-type cytochromes contain multiple heme cofactors per protein molecule that covalently attach to the protein amino acid sequence and are involved in electron transfer to extracellular metal oxides during anaerobic conditions. Successful recombinant expression of pathway components MtrC and MtrA is achieved in Escherichia coli. Heme-dependent gel staining and UV/Vis spectroscopy show characteristic c-type cytochrome characteristics. Mass spectrometry confirms that the correct extensive post-translational modifications were performed and the ten heme groups were incorporated per protein of MtrC and MtrA and the correct lipid-anchor was attached to extracellular MtrC. Raman spectroscopy measurements of MtrA provide intriguing structural information and highlight the strong influence of the heme cofactors within the protein structure. Next, an Arabidopsis thaliana protein is analyzed. It was previously identified via a motif search of the plant genome, based on conserved residues in the H4 NOX pocket. Here, the incorporation of a heme b cofactor is confirmed. UV/Vis spectroscopy under anaerobic conditions demonstrates reversible binding of nitric oxide to the heme iron and depicts the previously published characteristic absorption maxima for other H-NOX proteins.

Note:

Heme oxygenase (HO) is an enzyme that facilitates the oxidative breakdown of free heme into equi-molar concentrations of carbon monoxide (CO), the bile pigment biliverdin IX and free iron. These products have immuno-modulatory and antioxidative properties, which may be useful in the treatment of diseases characterised by low-grade inflammation and oxidative stress, such as insulin resistance and hyperglycaemia in type 2 diabetes. In fact, HO-1 protein levels and carbon monoxide generation are down-regulated in murine models of obesity and type 2 diabetes. Two independent research teams have reported that pharmacological induction of HO activity by protoporphyrin-based compounds, such as hemin and cobalt (III) protoporphyrin IX chloride (CoPP), exerts anti-diabetic effects, including protection from weight gain, systemic inflammation and peripheral insulin resistance, in various experimental models of type 2 diabetes. However, the relative insolubility and instability of hemin in solution and the multiple side-effects of CoPP, including weight loss, preclude their use for the treatment of patients in clinic. Heme arginate (HA) is a stable and soluble composition of hemin and L-arginine (LA) in a solution containing propylene glycol, ethanol and water. Furthermore, HA is licensed for the treatment of acute porphyria in several European countries. Therefore, HA may potentially be used in clinical trials. The current PhD thesis tests the hypothesis that the heme component of HA ameliorates hyperglycaemia via induction of HO activity in the leptin receptor deficient db/db (db/db) mouse model of type 2 diabetes. A preliminary in vivo study demonstrates that the heme but not the LA component of HA exerts an anti-hyperglycaemic effect in db/db mice. In a separate in vivo study, concomitant treatment of HA with stannous (IV) mesoporphyrin IX dichloride (SM), an inhibitor of HO activity, further improves the glycaemic control despite complete abrogation of the HA-mediated increase in HO activity in db/db mice. This result is in contrast to the above stated hypothesis, and demonstrates that the antihyperglycaemic effect of HA is due to a HO activity independent mechanism. Furthermore, the ameliorative effect of HA and HA+SM treatment on hyperglycaemia in db/db mice coincides with a gain in body and visceral fat weight, a reduction in islet β-cell inflammation and the preservation of islet β-cell function. Subsequent in vitro experiments demonstrate that HA exerts anti-inflammatory effects by a HO activity independent mechanism in pro-inflammatory in vitro models such as in cytokine mix-stimulated MIN6 β-cells and in classically activated bone marrow derived macrophages (BMDMs). In conclusion, the current thesis demonstrates the novel finding that the heme component of HA can exert anti-inflammatory and anti-diabetic effects via a HO activity independent mechanism. Future work should focus on studies to test the hypothesis that the interaction of heme with the nuclear receptor Rev-erb-α is responsible for the anti-inflammatory and anti-diabetic effects of HA.