京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21255号 / 医博第4373号 / 新制||医||1029(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 柳田 素子, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Amphiphilic kanamycin is one of the promising class of compounds for the treatment of fungal infections in plants and animal. Factor that lead to the restricting of compounds for commercialization includes, the higher cost of production and poor stability of the compound. However, the new lead, identified from the synthesis and biological testing, can be synthesized on a large scale with a cost comparable to commercial antifungals. The newly reported lead is stable at the acidic and basic conditions. Additionally, this compound has an excellent activity towards Candida auris, a multidrug-resistant superbug. Heart disease is the leading cause of death in the United States most of which are caused by cardiac ischemia and arrhythmias. Abnormal opening of Cx43 hemichannel can damage the heart muscles and lead to these conditions. A compound which can selectively inhibit the opening of Cx43 hemichannel may pave the way to reducing the mortality rate of heart disease. A selective inhibitor towards Cx43 hemichannel is explored from the synthesis and biological testing of kanamycin derivatives. The synthesis of the new inhibitor is scalable and cost-effective.

Les bourgeons du goût contiennent 50 à 100 cellules gustatives. Parmi elles, on distingue les cellules de type 2 et 3, capables d’émettre des potentiels d’action. Les cellules réceptrices (type 2), qui détectent les stimulus sapides dans la salive, ne possèdent pas de synapse. Les cellules présynaptiques (type 3), équipées d’une synapse, transmettent l’information aux neurones gustatifs. Nous avons réalisé des enregistrements électrophysiologiques (patch-clamp) de cellules de bourgeons du goût de papilles fongiformes in situ, dans un épithélium lingual isolé de souris.L’analyse des courants d’action en configuration cellule-attachée, permet de distinguer des impulsions courtes et longues. Dans ce dernier cas, la phase initiale rapide de dépolarisation est suivie d’une dépolarisation maintenue et d’une repolarisation lente. Ceci dénote l’activation de canaux dépolarisants autres que ceux réglant habituellement le décours temporel du potentiel d’action.Les enregistrements en patch-perforé gramicidine, qui n’altèrent pas le milieu intracellulaire, ont permis de perfuser l’intérieur de la cellule avec du césium, bloqueur des canaux potassiques. Le césium permet de distinguer les cellules de type 2 des cellules de type 3 par la présence d’un courant césium-résistant qui correspondrait, selon la littérature, à un courant résultant de l’ouverture d’hémicanaux permettant la sortie d’ATP. Nos observations sont globalement en accord avec les données de la littérature, mais ne supportent pas totalement la classification proposée actuellement en trois types cellulaires bien définis.Les hémicanaux joueraient donc un rôle central dans la communication intercellulaire au sein du bourgeon du goût. Nous avons, à notre connaissance pour la première fois, enregistré des canaux à grande conductance dans les cellules gustatives, en absence d’ion divalents dans la pipette d’enregistrement. Ces canaux, non spécifiques, présentent un fonctionnement complexe avec, outre l’état fermé et l’état de plus haute conductance (700pS), de nombreux états d’ouvertures intermédiaires et un état de conductance résiduel proche du niveau fermé.Au bilan, nos résultats confortent l’hypothèse de l’ouverture de canaux dont la grande conductance laisserait passer l’ATP dans les cellules réceptrices. / Taste buds contain 50 to 100 taste cells. Among those cells, type 2 and type 3 cells are able to produce action potentials. Receptor cells (type 2) detect sapid stimulus in the saliva, but do not possess synapses. Presynaptic cells (type 3) with synapse deliver information to the taste neurons. We performed electrophysiological (patch-clamp) recordings of fungiform taste bud cells in situ, from a mouse isolated lingual epithelium.Analysis of action currents in cell-attached configuration allows discrimination of short and long impulses. In the long ones, the rapid initial depolarizing phase is followed by a slow and a maintained repolarization. This suggests the activation of depolarizing channels other than the ones implied in usual action potential time decay. Gramicidin perforated-patch recordings, which do not alter the inside of the cell, allowed cells perfusion with cesium, a potassic channel blocker. Cesium allows to distinguish type 2 from type 3 cells by the presence of a cesium-resistant current, that may correspond, according to the literature, to the current flowing through hemichannels responsible for ATP release. Our observations mostly agree with data from the literature, but do not fully support the actual classification in only three defined cell types.Hemichannels have a key role in intercellular communication within the taste bud. Thus, and to our knowledge for the very first time, we recorded large conductance channels from taste cells, using a divalent-free pipet. Those non-specific channels have a complex opening mechanism, which, besides closed and upper conductance states (700pS), present many intermediate opening levels and residual states close to the closed state. Our results support the hypothesis that large conductance channels responsible for ATP release open in receptor cells.

Adjacent cells communicate through gap junctions (GJs). These GJs are formed by head to head docking of two hemichannels (HCs) from two adjacent cells. HCs are connexin hexamer proteins. Connexin mutation is the most frequent cause of childhood hearing loss. This hearing impairment affects 2 in every 2000 children. Inhibition of the HCs might be the key factor to treat such disorders. A library of amphiphilic kanamycins was synthesized to be tested as HC inhibitors. These compounds showed excellent inhibition activity in comparison with the parent compound (kanamycin A) with less toxicity. A library of monosaccharide esters with varying carbon chain lengths (acetyl (C2) to hexadecyl (C16)) were synthesized, characterized, and tested for bioactivity. Carbohydrate esters showed low toxicity while remaining active against bacteria and fungi. The compound 6-O-tetradecanoyl-D-mannopyranose (MAN014), a mannose ester with a fourteen-carbon chain, showed the greatest antibacterial and antifungal properties. A mode of action study was tested against Staphylococcus aureus (bacteria) and Fusarium graminearum (fungus) and found the compound perturbed the cell membrum.

Depuis plusieurs décennies, la communication intercellulaire par jonctions gap (CIJG) est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse. Cette implication semble complexe par le fait que les connexines pourraient augmenter la capacité d’invasion des cellules cancéreuses tout en diminuant leur prolifération. Ceci était particulièrement observé pour la connexine 43 (Cx43) dans le cas de cellules de gliomes. Or, les propriétés d’invasion des gliomes de haut grade, les glioblastomes multiformes (GBM), les rendent difficiles à supprimer par résection chirurgicale et favorisent leur récidive.<br/> Afin de préciser le rôle de la Cx43 dans le contrôle des capacités invasives de cellules de GBM, nous avons utilisé une lignée de cellules de glioblastome humaine U251 exprimant par shRNA des niveaux, en ARNm et protéiques, de Cx43 réduits. Ces clones shRNA des cellules U251 montrent une corrélation entre le niveau d’expression de la Cx43 et le processus d’invasion. Au cours de ce travail, nous avons montré, pour la première fois, que la Cx43 est localisée dans les structures protéolytiques permettant l’invasion, les invadopodes. Nous avons démontré aussi que, par sa localisation, la Cx43 favorise la formation des invadopodes en agissant comme une protéine d’échafaudage qui permet l’interaction de Src de la Cortactine. De plus, l’activité hémicanal de la Cx43, probablement inhibée par le Bisphénol A, possède des effets négatifs sur la cinétique de développement des invadopodes. Une étude du protéome et du sécrétome des cellules U251 et des clones shRNA a permis l’identification des protéines impliquées dans l’invasion et la formation et fonction des invadopodes.<br/> En conclusion, la Cx43 participe au processus invasif des cellules de GBM en favorisant la formation et la fonction des invadopodes. Cette nouvelle fonction de la Cx43 semble être la conséquence de ses propriétés de protéines d’échafaudage et hémicanal, et non de son rôle principalement décrit dans la CIJG. / Since several decades, the gap junction intercellular communication (GJIC) is known to be involved in carcinogenesis. This involvement seems complicated by the fact that connexins could increase cancer cells invasion ability while decreasing their proliferation. This was especially observed for connexin 43 (Cx43) in the case of glioma cells. But high-grade gliomas, glioblastoma multiform (GBM) has invasion properties that make it difficult to remove surgically and promote their recurrence.<br/> To clarify the Cx43 role in the control of GBM cells invasive capacities, we used the GBM U251 cell line expressing Cx43 levels, mRNA and protein, reduced by shRNA strategy. Through this approach, we confirmed that Cx43 expression level is associated with the invasive capacity of GBM cells. Furthermore we have shown, for the first time, that Cx43 is localized in invasive proteolytic structures, the invadopodia. We also show that, by its location, Cx43 promotes invadopodia formation by acting as a scaffolding protein that allows Src and Cortactin interaction. Moreover, Cx43 hemichannel activity, probably inhibited by Bisphenol A, has negative effects on invadopodia kinetics development. A proteome and secretome study of U251 cells and shRNA clones allowed the identification of proteins involved in invasion and invadopodia formation and function.<br/>In conclusion, Cx43 participates in the invasive process of GBM cells by promoting invadopodia formation and function. This new function of Cx43 seems to be the result of its scaffold proteins and hemichannel properties, but not its role described mainly in CIJG.