Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-05-27T20:39:23Z No. of bitstreams: 1 LILIAN AZEVEDO FIGUEIREDO.pdf: 510722 bytes, checksum: 7d19a1025be105a28bb3694687343801 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-05-31T17:39:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LILIAN AZEVEDO FIGUEIREDO.pdf: 510722 bytes, checksum: 7d19a1025be105a28bb3694687343801 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-31T17:39:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LILIAN AZEVEDO FIGUEIREDO.pdf: 510722 bytes, checksum: 7d19a1025be105a28bb3694687343801 (MD5) Previous issue date: 2009 / Os herpesvírus bovinos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são vírus de DNA de fita dupla, com envelope glicoprotéico, que pertencem à subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. A principal propriedade biológica dessa subfamília é a capacidade de estabelecer latência após a infecção aguda, quando não é possível sua detecção, exceto quando são utilizadas técnicas moleculares de hibridização in situ e a reação em cadeia pela polimerase (PCR). O BoHV-1 é principalmente atribuído a problemas respiratórios e reprodutivo e raramente à encefalite, como o BoHV-5. Dificuldades de isolamento do BoHV-5 têm sido descritas, o que torna a PCR um importante meio de diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a importância da técnica da PCR para a detecção do BoHV-5 e do BoHV-1 em SNC de bovinos com encefalite por BoHV-5, com outras encefalopatias e normais. Foram utilizadas amostras de SNC de bovinos atendidos nos Hospitais Veterinários da Universidade de Brasília (HV-UnB) e da Universidade Estadual de Londrina (HV-UEL), além de amostras de matadouros. Nenhuma amostra apresentou resultado positivo para o BoHV-1. Das amostras positivas para o BoHV-5, foram 21 das 68 (30,88%) provenientes do HV-UnB, 2 das 30 (7%) provenientes do matadouro e 2 de 17 (11,76%) provenientes do HVUEL. Dos 21 animais positivos do HV-UnB 3 casos foram de amostras de animais sem diagnóstico conclusivo, 7 casos de animais com diagnóstico confirmado de raiva, 7 casos com encefalite por BoHV-5, 1 caso de animal com polioencefalomalácia, 1 caso de animal com botulismo, 1 caso de animal com encefalite bacteriana e 1 caso de animal com carbúnculo sintomático. Das amostras positivas provenientes do HV-UEL todas eram de animais com diagnóstico de encefalite por BoHV-5 e do matadouro eram de animais sadios. A PCR para detecção do genoma do BoHV-5 em bovinos com encefalopatia não deve ser utilizada isoladamente no diagnóstico, e sim associada aos sinais clínicos, histopatologia, isolamento e imunoistoquímica. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bovine herpesvirus 1 and 5 are enveloped double-stranded DNA viruses belonging to the Herpesviridae family, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. This family major property is to establish a lifelong latent infection after acute infection, when it is not possible to detect the virus, except when molecular techniques as situ hybridization and polymerase chain reaction are used. BoHV-1 is primarily associated with respiratory and reproductive disease in cattle, while BoHV-5 is commonly associated to encephalitis. Difficulties in isolation of BoHV-5 have been described, which makes PCR an important tool of diagnosis. The aim of this study was to evaluate the applicability of PCR assay for the detection of BoHV-1 and BoHV-5 in CNS of bovines with meningoencephalitis, other encephalitis and healthy animals. For the present study, brain fragments samples of bovines were obtained from necropsy routine at Veterinary Hospital of University of Brasília (Hv-UnB) and State University of Londrina (HV-UEL), besides slaughterhouse samples. All CNS fragments were negative for BoHV-1. In 21 of 68 (30,88%) samples from Hv-UnB, 2 of 30 (7%) samples from slaughterhouse and 2 of 17 (11,76%) samples from HV-UEL the results were positive for BoHV-5. Among the 21 positive animals from HV-UnB, 3 where from samples of non-conclusive diagnosis cases, 7 from confirmed rabies diagnosis, 7 from animals with BoHV-5 encephalitis, 1 case of polioencephalomalacia, 1 animal with botulism, 1 with bacterial encephalitis and 1 animal with carbunculus. All positive samples from HV-UEL were from animals with BoHV-5 encephalitis diagnosis and from the slaughterhouse all animals were healthy. The PCR detection of BoHV-5 genome in bovines with encephalopathies must not be used alone as diagnosis but associated with clinical signs, histopathological findings, isolation and immunohistochemistry.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) são responsáveis por uma série de patologias em bovinos. A diferenciação entre tipos e subtipos desses vírus é importante para a compreensão da epidemiologia das infecções associadas a eles, assim como para permitir a tomada de medidas de controle adequadas. No presente estudo foram efetuadas análises antigênicas utilizando anticorpos monoclonais (AcMs) preparados contra antígenos específicos de herpesvírus bovinos. Quarenta e cinco amostras virais foram examinadas com um painel de 36 AcMs previamente preparados, em testes de imunoperoxidase em monocamada. Quatro amostras virais, sendo três BoHV-1 e uma BoHV-5, não apresentaram reatividade frente a nenhum dos AcMs avaliados. Oito dos 36 AcMs reagiram com todas as demais 41 amostras de herpesvírus bovinos. Por outro lado, oito amostras virais (três BoHV-5 e cinco BoHV-1) reagiram com todos os AcMs testados. Um AcM foi capaz de diferenciar o subtipo “c” do BoHV- 5 das demais amostras. Os demais resultados obtidos sugerem que não há uma clara correlação entre tipos e subtipos genomicamente determinados de herpesvírus bovinos e os AcMs aqui avaliados. / Bovine herpesvirus 1(BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are associated to different clinical conditions of cattle. The differentiation between types and subtypes of these viruses maybe important for a better understanding of the epidemiology of bovine herpesvirus infections, as well as to provide support for adequate control measures. In the present study, antigenic analyses were performed with monoclonal antibodies (Mabs) prepared to bovine herpesviruses specific antigens. Fourty five virus isolates/strains were examined with a panel of 36 previously prepared Mabs, immunoperoxidase monolayer assays. Four virus isolates, of which three BoHV-1 and one BoHV-5, did not react with any of the Mabs tested. Eight of the 36 Mabs reacted with all other 41 bovine herpeviruses. On the other hand, eight viruses (three BoHV-5 and five BoHV-1) reacted with all Mabs tested. One Mab was capable of distinguishing BoHV-5 subtype “c” from the other subtypes. Additional results revealed that no clearcut correlation could be established between bovine herpesviruses types and subtypes determinated by molecular methods and the Mabs here evaluated.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) são responsáveis por uma série de patologias em bovinos. A diferenciação entre tipos e subtipos desses vírus é importante para a compreensão da epidemiologia das infecções associadas a eles, assim como para permitir a tomada de medidas de controle adequadas. No presente estudo foram efetuadas análises antigênicas utilizando anticorpos monoclonais (AcMs) preparados contra antígenos específicos de herpesvírus bovinos. Quarenta e cinco amostras virais foram examinadas com um painel de 36 AcMs previamente preparados, em testes de imunoperoxidase em monocamada. Quatro amostras virais, sendo três BoHV-1 e uma BoHV-5, não apresentaram reatividade frente a nenhum dos AcMs avaliados. Oito dos 36 AcMs reagiram com todas as demais 41 amostras de herpesvírus bovinos. Por outro lado, oito amostras virais (três BoHV-5 e cinco BoHV-1) reagiram com todos os AcMs testados. Um AcM foi capaz de diferenciar o subtipo “c” do BoHV- 5 das demais amostras. Os demais resultados obtidos sugerem que não há uma clara correlação entre tipos e subtipos genomicamente determinados de herpesvírus bovinos e os AcMs aqui avaliados. / Bovine herpesvirus 1(BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are associated to different clinical conditions of cattle. The differentiation between types and subtypes of these viruses maybe important for a better understanding of the epidemiology of bovine herpesvirus infections, as well as to provide support for adequate control measures. In the present study, antigenic analyses were performed with monoclonal antibodies (Mabs) prepared to bovine herpesviruses specific antigens. Fourty five virus isolates/strains were examined with a panel of 36 previously prepared Mabs, immunoperoxidase monolayer assays. Four virus isolates, of which three BoHV-1 and one BoHV-5, did not react with any of the Mabs tested. Eight of the 36 Mabs reacted with all other 41 bovine herpeviruses. On the other hand, eight viruses (three BoHV-5 and five BoHV-1) reacted with all Mabs tested. One Mab was capable of distinguishing BoHV-5 subtype “c” from the other subtypes. Additional results revealed that no clearcut correlation could be established between bovine herpesviruses types and subtypes determinated by molecular methods and the Mabs here evaluated.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) são responsáveis por uma série de patologias em bovinos. A diferenciação entre tipos e subtipos desses vírus é importante para a compreensão da epidemiologia das infecções associadas a eles, assim como para permitir a tomada de medidas de controle adequadas. No presente estudo foram efetuadas análises antigênicas utilizando anticorpos monoclonais (AcMs) preparados contra antígenos específicos de herpesvírus bovinos. Quarenta e cinco amostras virais foram examinadas com um painel de 36 AcMs previamente preparados, em testes de imunoperoxidase em monocamada. Quatro amostras virais, sendo três BoHV-1 e uma BoHV-5, não apresentaram reatividade frente a nenhum dos AcMs avaliados. Oito dos 36 AcMs reagiram com todas as demais 41 amostras de herpesvírus bovinos. Por outro lado, oito amostras virais (três BoHV-5 e cinco BoHV-1) reagiram com todos os AcMs testados. Um AcM foi capaz de diferenciar o subtipo “c” do BoHV- 5 das demais amostras. Os demais resultados obtidos sugerem que não há uma clara correlação entre tipos e subtipos genomicamente determinados de herpesvírus bovinos e os AcMs aqui avaliados. / Bovine herpesvirus 1(BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are associated to different clinical conditions of cattle. The differentiation between types and subtypes of these viruses maybe important for a better understanding of the epidemiology of bovine herpesvirus infections, as well as to provide support for adequate control measures. In the present study, antigenic analyses were performed with monoclonal antibodies (Mabs) prepared to bovine herpesviruses specific antigens. Fourty five virus isolates/strains were examined with a panel of 36 previously prepared Mabs, immunoperoxidase monolayer assays. Four virus isolates, of which three BoHV-1 and one BoHV-5, did not react with any of the Mabs tested. Eight of the 36 Mabs reacted with all other 41 bovine herpeviruses. On the other hand, eight viruses (three BoHV-5 and five BoHV-1) reacted with all Mabs tested. One Mab was capable of distinguishing BoHV-5 subtype “c” from the other subtypes. Additional results revealed that no clearcut correlation could be established between bovine herpesviruses types and subtypes determinated by molecular methods and the Mabs here evaluated.

As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula. / The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell.

As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula. / The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell.

As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula. / The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell.

Membros da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) tem sido associados a diferentes condições clínicas em bovinos. Assim, diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 é uma valiosa informação objetivando um melhor entendimento da patogenia e epidemiologia destes vírus no rebanho bovino. Contudo, métodos para diferenciação são escassos devido às reações cruzadas originadas da alta homologia genômica e antigênica entre estes vírus. O presente estudo concentrou-se na análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (nucleotídeos 16763 - 17337 em BoVH-1 e 17671 - 18242 em BoHV-5), uma vez que tal região apresentou características potenciais que permitissem a diferenciação entre estes vírus. Assim, no primeiro capítulo do presente trabalho a região carboxi-terminal da gC foi utilizada como alvo para o desenvolvimento de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguida da Análise da Restrição Enzimática (REA) do fragmento amplificado, capaz de diferenciar entre isolados de BoHV-1 ou BoHV-5, gerando fragmentos com tamanhos de 575 pares de base (pb) frente a BoHV-1 e 572 pb frente a BoHV-5. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi obtida após a digestão dos amplicons com a enzima de restrição Bgl I. No segundo capítulo, a região carboxi-terminal de 23 amostras Sul-Americanas de BoHV-1 ou BoHV-5 foram amplificadas e sequenciadas. A análise filogenética realizada com as sequências de nucleotídeos revelou identidade variando entre 98,7 a 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 a 92% (BoHV-1/ BoHV-5) e 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). Alinhamentos realizados com sequências de aminoácidos revelaram identidade variando entre 97,5 a 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 a 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) e 92,1 a 99,5% (BoHV-5/ BoHV-5). Análises filogenéticas revelaram, ainda, que: i) alguns isolados de BoHV-5 apresentaram um padrão diferente daqueles até o presente reconhecidos; ii) uma amostra isolada no Uruguai (BoHV-1.2) apresentou um padrão de agrupamento distinto quando comparado com as outra amostras de BoHV-1.2. O terceiro capítulo apresenta o primeiro relato de detecção de BoHV-5 de sêmen bovino através da análise antigênica, amplificação diferencial da região amino-terminal do gene da gC de BoHV-1 e 5, seguida da caracterização por REA do isolado em estudo. Em síntese, através da utilização da gC foi possível avaliar a homologia entre as amostras Sul- Americanas estudadas; desenvolver uma PCR/REA diferencial entre estes vírus e relatar a detecção de uma amostra de BoHV-5 isolada à partir de sêmen contaminado. / Members of the Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily bovine herpesvirus types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) have been associated to different clinical conditions of cattle. Thus, differentiation has become an important tool for a better understanding of the pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in cattle. However, currently available methods for such differentiation are hampered by cross-reactions from high genomic and antigenic homology between these viruses. The present work focused on the analysis of the carboxy-terminal portion of glycoprotein C (gC), corresponding to nucleotides 16763 - 17337 on BoHV-1 and 17671 - 18242 on BoHV-5 once such region showed characteristics that would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5. In view of that, in the first chapter, the carboxy-terminal region of gC was the target for the development of a Polymerase Chain Reaction followed by a Restriction Enzyme Analysis (PCR/REA) for differentiation between BoHV-1 and 5. The PCR/REA was designed to amplify a segment on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving rise to amplicons of 575 base pairs (bp) for BoHV- 1, and 572 bp for BoHV-5. The amplicons were digested with the Bgl I for differentiation between BoHV-1 and 5. In the second chapter the region previously described of 23 South American isolates of BoHV-1 and BoHV-5 were amplified and sequenced. Nucleotide sequence alignments revealed identity ranged from 98,7 to 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92% (BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). The identity deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV- 5) . Phylogenetic analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some BoHV-5 isolates seem to be “non a non b” subtype and ii) there is a Uruguayan BoHV-1.2 strain that has a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others BoHV-1.2 strains. The third chapter of the present work contains the first report of a BoHV-5 strain isolated from the bovine semen by antigenic characterization, differential amplification of the N-terminal region of gC gene from BoHV-1 and 5 followed by genomic characterization by REA and antigenic characterization of the isolate analyzed.

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) e o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) apresentam como característica comum a indução de infecções latentes em seus hospedeiros. Estes agentes estão associados a diferentes enfermidades em bovinos, embora na maioria dos animais infectados a infecção primária ocorra com poucos ou sem sinais clínicos evidentes. Eventualmente, hospedeiros suscetíveis podem apresentar quedas na produtividade, perdas reprodutivas ou mesmo sofrer doença fatal. Esta tese compreende dois estudos independentes, que visam contribuir para um maior conhecimento sobre infecções por herpesvírus em bovinos. O primeiro capítulo reporta os achados de uma pesquisa sobre a presença do DNA de BoHV-2, BoHV-4 e OvHV-2 em gânglios trigêmeos (GT) de bovinos. Fragmentos de 200 GT (de 100 animais) foram coletados e submetidos à extração de DNA. Um conjunto de PCRs, duas das quais “semi-nested”, foi padronizado para amplificar parte do gene que codifica a glicoproteína B de BoHV-2 e BoHV-4. Outra PCR foi desenhada tendo como alvo o gene que codifica a proteína FGAM-sintase de OvHV-2. Controles internos foram construídos e utilizados para determinar a sensibilidade dos testes. Genomas de BoHV-2 foram encontrados em 2% (2/100) das amostras analisadas; genomas de BoHV-4 e OvHV-2 não foram detectados. No segundo capítulo desta tese, na busca de um imunógeno capaz de minimizar as perdas decorrentes de encefalites causadas por BoHV-5, o potencial imunogênico de uma amostra recombinante de BoHV-5, da qual os genes que codificam as glicoproteínas I, E e a proteína US9 foram deletados (BoHV5 gI/gE/US9-), em uma formulação vacinal inativada. Para a avaliação da vacina, oito terneiros (grupo vacinado; GV) foram vacinados com 3 ml da preparação por via subcutânea nos dias 0 e 28. Outros quatro terneiros foram vacinados com a preparação vacinal sem antígeno (grupo controle; GC). Após o desafio com o vírus parental selvagem (EVI 88/95), os animais do GV apresentaram sinais leves de infecção respiratória, enquanto que os animais do GC desenvolveram doença respiratória e encefalite grave, o que levou à eutanásia de dois dos quatro animais controle. A vacina conferiu proteção contra encefalite nos animais do GV após o desafio, porém não impediu a reativação do vírus selvagem. Os estudos aqui realizados permitiram demonstrar pela primeira vez a ocorrência de co-infecções com BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5, mas não com BoHV-4 e OvHV-2, em gânglios trigêmeos de bovinos. No segundo capítulo, foi demonstrada a eficácia do recombinante BoHV5 gI/gE/US9-, na proteção de bovinos contra encefalites causadas por BoHV-5 selvagem. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) and ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2) are known to induce latent infections in their natural hosts. These agents are associated with different diseases in cattle, although in the majority of infected animals, primary infections occur with few or no evident clinical signs. Eventually, susceptible hosts may display decreased productivity, reproductive losses or undergo fatal disease. This thesis comprises two studies intended to increase the knowledge on herpesvirus infections in cattle. The first chapter reports the findings of a search for DNA of BoHV-2, BoHV-4 and OvHV-2 in trigeminal ganglia (TG) of cattle. Fragments of 200 TG (from 100 animals) were collected and submitted to DNA extraction. A set of PCRs, two of which "semi-nested" was standardized to amplify a portion of the gene encoding the BoHV-2 and BoHV-4 glycoprotein B. Another PCR was designed targeting the gene coding for the FGAM-synthase of OvHV-2. Internal controls were constructed and used to determine the sensitivity of the tests. BoHV-2 genomes were found in 2% (2/100) of the examined samples. Genomes of BoHV-4 and OvHV-2 were not detected. In the second chapter of this thesis, a recombinant BoHV-5 in which the genes encoding glycoproteins I, E and protein US9 were deleted (BoHV5 gI/gE/US9-) was evaluated in its potential to protect cattle against BoHV-5 encephalitis in an inactivated vaccine. Eight calves were subcutaneously vaccinated with 3 ml of the vaccine on days 0 and 28 (vaccinated group; VG). Another four calves were mock vaccinated with the vaccine diluent (control group, CG). After challenge with wild type virus (EVI 88/95), the VG animals showed mild clinical signs of respiratory infection, whereas animals CG developed severe respiratory disease and encephalitis, which led to euthanasia of two of the four CG animals. The inactivated vaccine conferred protection against encephalitis in animals after challenge, but did not prevent viral reactivation. The studies conducted here demonstrate for the first time the occurrence of co-infections with BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5, but not with BoHV-4 and OvHV-2 in TG of cattle. In the second chapter, demonstrated the efficacy of an inactivated vaccine prepared with the recombinant BoHV5 gI/gE/US9- in the protection of cattle against encephalitis caused by wild-type BoHV-5.

Membros da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) tem sido associados a diferentes condições clínicas em bovinos. Assim, diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 é uma valiosa informação objetivando um melhor entendimento da patogenia e epidemiologia destes vírus no rebanho bovino. Contudo, métodos para diferenciação são escassos devido às reações cruzadas originadas da alta homologia genômica e antigênica entre estes vírus. O presente estudo concentrou-se na análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (nucleotídeos 16763 - 17337 em BoVH-1 e 17671 - 18242 em BoHV-5), uma vez que tal região apresentou características potenciais que permitissem a diferenciação entre estes vírus. Assim, no primeiro capítulo do presente trabalho a região carboxi-terminal da gC foi utilizada como alvo para o desenvolvimento de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguida da Análise da Restrição Enzimática (REA) do fragmento amplificado, capaz de diferenciar entre isolados de BoHV-1 ou BoHV-5, gerando fragmentos com tamanhos de 575 pares de base (pb) frente a BoHV-1 e 572 pb frente a BoHV-5. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi obtida após a digestão dos amplicons com a enzima de restrição Bgl I. No segundo capítulo, a região carboxi-terminal de 23 amostras Sul-Americanas de BoHV-1 ou BoHV-5 foram amplificadas e sequenciadas. A análise filogenética realizada com as sequências de nucleotídeos revelou identidade variando entre 98,7 a 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 a 92% (BoHV-1/ BoHV-5) e 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). Alinhamentos realizados com sequências de aminoácidos revelaram identidade variando entre 97,5 a 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 a 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) e 92,1 a 99,5% (BoHV-5/ BoHV-5). Análises filogenéticas revelaram, ainda, que: i) alguns isolados de BoHV-5 apresentaram um padrão diferente daqueles até o presente reconhecidos; ii) uma amostra isolada no Uruguai (BoHV-1.2) apresentou um padrão de agrupamento distinto quando comparado com as outra amostras de BoHV-1.2. O terceiro capítulo apresenta o primeiro relato de detecção de BoHV-5 de sêmen bovino através da análise antigênica, amplificação diferencial da região amino-terminal do gene da gC de BoHV-1 e 5, seguida da caracterização por REA do isolado em estudo. Em síntese, através da utilização da gC foi possível avaliar a homologia entre as amostras Sul- Americanas estudadas; desenvolver uma PCR/REA diferencial entre estes vírus e relatar a detecção de uma amostra de BoHV-5 isolada à partir de sêmen contaminado. / Members of the Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily bovine herpesvirus types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) have been associated to different clinical conditions of cattle. Thus, differentiation has become an important tool for a better understanding of the pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in cattle. However, currently available methods for such differentiation are hampered by cross-reactions from high genomic and antigenic homology between these viruses. The present work focused on the analysis of the carboxy-terminal portion of glycoprotein C (gC), corresponding to nucleotides 16763 - 17337 on BoHV-1 and 17671 - 18242 on BoHV-5 once such region showed characteristics that would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5. In view of that, in the first chapter, the carboxy-terminal region of gC was the target for the development of a Polymerase Chain Reaction followed by a Restriction Enzyme Analysis (PCR/REA) for differentiation between BoHV-1 and 5. The PCR/REA was designed to amplify a segment on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving rise to amplicons of 575 base pairs (bp) for BoHV- 1, and 572 bp for BoHV-5. The amplicons were digested with the Bgl I for differentiation between BoHV-1 and 5. In the second chapter the region previously described of 23 South American isolates of BoHV-1 and BoHV-5 were amplified and sequenced. Nucleotide sequence alignments revealed identity ranged from 98,7 to 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92% (BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). The identity deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV- 5) . Phylogenetic analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some BoHV-5 isolates seem to be “non a non b” subtype and ii) there is a Uruguayan BoHV-1.2 strain that has a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others BoHV-1.2 strains. The third chapter of the present work contains the first report of a BoHV-5 strain isolated from the bovine semen by antigenic characterization, differential amplification of the N-terminal region of gC gene from BoHV-1 and 5 followed by genomic characterization by REA and antigenic characterization of the isolate analyzed.