Resumo: Dos 27 microrganismos recém isolados, A. fumigatus M.7.1 e Myceliophthora sp M.7.7 foram os melhores produtores de FPase (0,8 e 2,0 U/g de substrato) e xilanase (1040 e 1292 U/g de substrato), quando cultivados por fermentação em estado sólido (FES) em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). As produções máximas de xilanase (7237,9 U/g de substrato) e endoglucanase (46,2 U/g de substrato) por A. fumigatus M.7.1 foram observadas pelo cultivo do fungo em palha de milho e farelo de trigo (9:1 p/p) e bagaço de cana e farelo de trigo (9:1 p/p), respectivamente. Em relação ao isolado Myceliophthora sp M.7.7, os picos de produção de ambas as enzimas (xilanase: 1044,6 U/g de substrato; endoglucanase 53,7 U/g de substrato) foram obtidos quando este foi cultivado em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (9:1 p/p). A endoglucanase e xilanase produzida por A. fumigatus M.7.1 apresentaram atividade ótima em pH 4,5, a 70 e 60 ºC, respectivamente. Nos ensaios com a linhagem Myceliophthora sp M.7.7, ambas as enzimas apresentaram maior atividade em pH 5,0 a 65-70 ºC. Ambas as enzimas de Myceliophthora sp M.7.7 e a endoglucanase de A. fumigatus M.7.1 mantiveram aproximadamente 70-100% da atividade inicial na faixa de pH entre 3,5 a 9,0 e nas temperaturas de 35 a 65 ºC. A xilanase de A. fumigatus M.7.1 manteve-se estável em pH entre 5,5 e 10,5 e 40 e 50 ºC, respectivamente. Dos tratamentos ao qual o bagaço foi submetido, o que mostrou maior eficiência na liberação de açúcares redutores (0,09%) e compostos fenólicos (0,74%), foi a solução de glicerol em microondas por 5 min. O bagaço de cana pré tratado com glicerol foi incubado com o preparado enzimático de A. fumigatus M.7.1 a 55 ºC. Após 24 h de incubação, foram liberados 0,7 mg/mL de açúcar redutor. As mesmas condições foram utilizadas na sacarificação do bagaço utilizando o extrato enzimático... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The microorganisms A. fumigatus M.7.1 and Myceliophthora SP M.7.7 were the best producers of FPase (0,8 and 2,0 U/g of substrate) and xylanase (1040 and 1292 U/g of substrate) of the 27 isolated microorganisms, when cultivated by solid state fermentation (SSF) in a mixture of cane bagasse and wheat bran (1:1). The greatest production of xylanase (7237,9 U/g of substrate) and endoglucanase (46,2 U/g of substrate) by A. fumigatus M.7.1 were noted by the fungi cultivation in corn straw and wheat bran (9:1 p/p) and cane bagasse and wheat bran (9:1 p/p), respectively. In the isolated Myceliophthora sp M.7.7, the peak production of the both enzymes (xylanase: 1044,6 U/g of substrate; endoglucanase 53,7 U/g of substrate) were obtained when the microorganism were cultivated in a mixture of cane bagasse and wheat bran (9:1 p/p). The endoglucanase and the xylanase produced by A. fumigatus M.7.1 showed higher activity in pH 4,5, at 70 and 60 oC, respectively. In the essays with the Myceliophthora sp M.7.7 strains, the both enzymes showed higher activity in pH 5,0, at 65-70 oC. The both enzymes of Myceliophthora sp M.7.7 and the endoglucanase of A. fumigatus M.7.1 maintained approximately 70-100% of the initial activity between pH 3,5 and 9,0 and between 35 and 65 oC. The xylanase of A. fumigatus M.7.1 was stable between the pH 5,5 and 10,5 and the temperature 40 and 50 oC. About the treatments of the bagasse, the most efficient in the liberation of reducing sugars (0,09%) and phenolic compounds (0,74%) was the glycerol solution in microwave for 5 minutes. The cane bagasse pretreated with glycerol was incubated with the enzymatic solution of A. fumigatus M.7.1 at 55 oC. After 24 hours of incubation, 0,7mg/mL of reducing sugar was liberated. The same conditions were used in the saccharification of the bagasse using the enzymatic extract produced by Myceliophthora sp. M.7.7, with a reducing sugar... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Daniela A. Bocchini-Martins / Banca: Beatriz Vahan Kilikian / Banca: Mauricio Boscolo / Mestre

Estudos recentes indicam que os peptídeos obtidos pela hidrolise enzimática da caseína podem apresentar atividades antioxidantes. Neste trabalho, previamente obteve-se os peptídeos através de hidrolise da caseína utilizando as enzimas Alcalase e Flavourzyme (4h, a 50ºC e pH 8), selecionando os que apresentaram as melhores características, in vitro, relativas à atividade antioxidante. A hidrolise enzimática utilizando a enzima Flavourzyme mostrou melhores resultados, com alto valor de proteína solúvel e conteúdo de aminoácidos livres, além de peptídeos de menor peso molecular do que com a Alcalase, como observado nas análises de cromatografia de permeação em gel e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os peptídeos de caseína obtidos com a Flavourzyme também apresentaram melhores resultados utilizando o método ABTS na determinação da capacidade antioxidante. O hidrolisado obtido a partir da enzima Flavourzyme foi aplicado em produtos cárneos e em chocolate branco. Em produtos cárneos, os peptídeos de caseína (2.0%) inibiram, efetivamente, a peroxidação lipídica em carne moída (100%) e em carne mecanicamente separada de ave (CMS) (cerca de 20%) indicando que estes peptídeos podem ser utilizados nestes produtos, auxiliando na prevenção da formação de flavor desagradável e aumentando sua vida útil. Relativamente a sua aplicação em chocolate branco, esta adição teve o intuito de inibir escurecimento deste produto, fator considerado como limitante na sua vida-útil sendo conseqüência tanto de reações de escurecimento não enzimático quanto da oxidação de lipídeos. Os parâmetros que indicaram alteração lipidica e reações não enzimáticas foram mensurados em três diferentes amostras de chocolate branco: uma amostra com 0,2%, de manteiga de cacau, de antioxidante sintético Grindox 562, outra com 0,2%, de manteiga de cacau, dos peptídeos de caseína e a terceira amostra sem qualquer tipo de antioxidante. As amostras foram expostas a duas temperaturas diferentes: 20 ± 2 e 28 ± 2ºC. Os resultados das análises realizadas indicaram que as amostras armazenadas à temperatura de 20ºC apresentaram resultados significativamente melhores àqueles das amostras armazenadas à temperatura de 28ºC, relativos ao índice de acidez, à atividade de água, ao índice de peróxido, à cor e às substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), indicando melhor conservação deste produto. Também foi observado que a adição de quaisquer dos antioxidantes empregados não influenciou de forma significativa os resultados obtidos, evidenciandose assim, que o principal parâmetro responsável pelas alterações do chocolate branco em sua vida útil refere-se à temperatura de armazenamento a qual as amostras foram submetidas. / Recent studies indicate that peptides obtained by casein hydrolysis may have antioxidant activity. In this work, previous casein peptides were obtained by enzymatic hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme (4h, at 50ºC and pH 8), selecting the ones that showed the best characteristics in vitro, related to the antioxidant activity. The enzymatic hydrolysis using Flavourzyme showed the best results, with higher soluble protein and free amino acid content and producing lower molecular weight peptides than Alcalase, as observed by gel permeation chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis. Related to its application in meat products, casein peptides obtained with Flavourzyme also exhibited greater antioxidant capacity using the ABTS method. The casein hydrolyzed from Flavourzyme enzyme was applicated in ground beef homogenates, mechanically deboned meat (MDM) of poultry and white chocolate. In meat products, casein peptides (2.0%) effectively inhibited lipid peroxidation in ground beef homogenates (100%) and mechanically deboned meat (about 20%) of poultry. Casein peptides may be useful in meat processing as another naturally occurring antioxidant, helping to prevent off-flavor formation in meat products and increasing shelf life. In the use for white chocolate, the goal was to inhibit its browning, the main problems that limit the white chocolate’s shelf-life. Non-enzymatic browning reaction and lipid oxidation were involved directly in the browning of white chocolate. Thus, parameters which indicated fat alteration and non-enzymatic reactions were measured in three different samples of white chocolate. One sample with 0,2% of cocoa butter, with the synthetic antioxidant Grindox 562, other with 0,2% of cocoa butter, with the natural antioxidant and the third sample without any kind of antioxidant. The samples were exposed to two different temperatures: 20 ± 2 and 28 ± 2ºC. The results of the analysis made indicated that the samples stored at the temperature of 20ºC showed results significantly better to those samples stored at the temperature of 28ºC, related to the conservation of the white chocolate. Besides, the results indicated that the addition of any antioxidants employees has not influenced in a significant way the results obtained. Thus, it was evidenced that the main responsible parameter for the alterations of the white chocolate’s shelf-life is related to the storage temperature to which the samples were submitted.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana Cristina Veit.pdf: 1542833 bytes, checksum: 8515e8ff458d06b822dcc387d9d4d96a (MD5) Previous issue date: 2012-02-14 / Fundação Araucária / The Nile tilapia is a specie that has been highlighted in recent years for various reasons, however, during their filleting there is a sub use of its chips, resulting in very rich protein sources waste that could be used in food. An alternative for these waste can be the development of protein hydrolyzed, which are constructed using enzymes that hydrolyze proteins into small peptides and free amino acids, that can be used in diets for patients with difficult or disability in the absorption of intact protein, as hypoallergenic food for liver diseases, as protein supplements and as a flavoring in foods. In this sense, this present study aimed to develop protein hydrolyzed of Nile tilapia V cuts and breaded fish with partial inclusion of hydrolyzed and characterized them with respect to chemical composition, microbiological and sensory. The raw material used to obtain the protein hydrolyzed were Nile tilapia V cuts and commercial enzymes, one obtained from Bacillus (H1) and other extracted from papaya latex (H2). The hydrolyzed were prepared in a simulator reactor consists of a mechanical stirrer and an electrical heater. For the hydrolyze condition control were monitored the pH and temperature until that were optimal enzymatic condition. After some times of hydrolyze, the process ended with the thermal enzyme inactivation and filtration of the obtained products. After that, were determined the hydrolysis degree of each hydrolyzed. To verify their application, three breaded formulation were developed, one without hydrolyzed, one with 8% of hydrolyzed (H1) inclusion and one with 8% of hydrolyzed (H2) inclusion. Were realized moisture, protein, lipids, ash and carbohydrate analysis of the hydrolyzed and breaded. To control the hygienic and sanitary conditions of the final products were carried out microbiological analysis of positive Staphylococcus coagulase, Salmonella sp, thermotolerant coliforms, molds, yeasts, mesophilic and psychrotophic. To verify the breaded acceptation, was carried out the sensorial analysis with 35 volunteer tasters. The determined hydrolysis degrees were 14,76% for H1 and 13,17% for H2. The hydrolyzed showed 81,42 and 70,98% for moisture, 13,61 and 14,62% for protein, 3,45 and 2,78% for lipids and 2,68 and 2,03% for ash, respectively for H1 and H2. The breaded showed 62,32; 64,18 and 65,05% for moisture, 12,36; 12,69 and 13,02% for protein, 2,93; 2,84 and 2,79% for lipids, 1,28, 1,46 and 1,49% for ash and 21,11; 18,83 and 17,65% for carbohydrates, respectively for H1 hydrolyzed, H2 hydrolyzed and without hydrolyzed. With relation to microbiological results, for both as a hydrolyzed as well breaded had values below to the current Brazilian legislation allows. According to sensory analysis all of breaded were good acceptance. So, the enzymatic hydrolysis showed as an efficient process to obtain hydrolyzed protein from a low value added raw material, showing excellent nutritional quality and great hydrolysis degrees which allow its use both as a flavoring in foods such as to treat specific diseases. Moreover, the inclusion of fisheries protein hydrolyzed in fish breaded formulation is a great alternative to partial substitution of meat, as it keeps its nutritional value and are well accepted by consumers and presents good sanitary quality. / A tilápia do Nilo é uma espécie que vem se destacando nos últimos anos por diversos motivos, no entanto, durante sua filetagem há um sub aproveitamento de suas aparas, o que resulta no desperdício de riquíssimas fontes protéicas que poderiam ser utilizadas na alimentação humana. Uma alternativa para esses resíduos pode ser o desenvolvimento de hidrolisados protéicos, os quais são elaborados utilizando-se enzimas que hidrolisam as proteínas em pequenos peptídeos e aminoácidos livres, podendo ser utilizados em dietas para pacientes com dificuldade ou incapacidade na absorção de proteínas intactas, como alimentos hipoalergênicos, para o tratamento de doenças hepáticas, como suplementos protéicos e também como flavorizante em alimentos. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo, desenvolver hidrolisados protéicos de cortes em V de tilápia do Nilo e empanados de peixe com inclusão parcial dos hidrolisados e caracterizá-los com relação à composição centesimal, microbiológica e sensorial. A matéria prima utilizada para a obtenção dos hidrolisados protéicos foram cortes em V da filetagem de tilápias do Nilo e enzimas comerciais, uma obtida de Bacillus (H1) e a outra extraída do látex do mamão papaia (H2). Os hidrolisados foram preparados em um simulador de reator composto por um agitador mecânico e um aquecedor elétrico. Para controle das condições de hidrólise foram monitorados o pH e a temperatura até que estivessem nas condições ótimas enzimáticas. Após determinado tempo de hidrólise, encerrou-se o processo com a inativação térmica das enzimas e filtração dos produtos obtidos. Posteriormente foram determinados os graus de hidrólise de cada hidrolisado. Para a verificação de sua aplicação, foram desenvolvidas três formulações de empanados, uma sem inclusão de hidrolisado, outra com a inclusão de 8% do hidrolisado (H1) e a outra com inclusão de 8% do hidrolisado (H2). Foram realizadas análises de umidade, proteína, extrato etéreo, matéria mineral e carboidratos dos hidrolisados e dos empanados. Para controle das condições higiênicas e sanitárias dos produtos finais realizou-se análises microbiológicas de Staphylococcus coagulase positiva, Salmonella sp, coliformes termotolerantes, bolores, leveduras, mesófilos e psicrotróficos. Para a verificação da aceitação dos empanados, realizou-se análise sensorial com 35 provadores voluntários. Os graus de hidrólise determinados foram de 14,76% para H1 e 13,17% para H2. Os hidrolisados apresentaram 81,42 e 70,98% de umidade, 13,61 e 14,62% de proteína, 3,45 e 2,78% de extrato etéreo e 2,68 e 2,03% de matéria mineral, respectivamente para o H1 e H2. Já os empanados obtiveram 62,32, 64,18 e 65,05% de umidade, 12,36, 12,69 e 13,02% de proteína, 2,93, 2,84 e 2,79% de extrato etéreo, 1,28, 1,46 e 1,49% de matéria mineral e 21,11, 18,83 e 17,65% de carboidratos respectivamente para os empanados com o hidrolisado H1, com o hidrolisado H2 e os sem hidrolisado. Com relação aos resultados microbiológicos, tanto os hidrolisados quanto os empanados apresentaram valores bem abaixo do que a legislação brasileira vigente permite. Quanto à análise sensorial todos os empanados foram muito bem aceitos pelos provadores. Portanto, a hidrólise enzimática mostrou-se como um processo eficiente na obtenção de proteínas hidrolisadas a partir de uma matéria prima de baixo valor agregado, apresentando ótima qualidade nutricional e bons graus de hidrólise que permitem sua utilização tanto como flavorizantes em alimentos como para o tratamento de doenças específicas. Além disso, a inclusão de hidrolisados protéicos de pescado na formulação de empanados de peixe é uma boa alternativa para substituição parcial da carne, já que mantiveram seu valor nutricional além de serem bem aceitos pelos consumidores e apresentarem boa qualidade sanitária.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-05-04T19:26:38Z No. of bitstreams: 1 lucasfagundesesteves.pdf: 10750065 bytes, checksum: 8871e6f0092a5a329a1cc8099f9a0382 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-17T13:33:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lucasfagundesesteves.pdf: 10750065 bytes, checksum: 8871e6f0092a5a329a1cc8099f9a0382 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T13:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lucasfagundesesteves.pdf: 10750065 bytes, checksum: 8871e6f0092a5a329a1cc8099f9a0382 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Esta tese propõe uma investigação teórica do mecanismo de quebra hidrolítica de um modelo para diésteres de fosfato, o íon BDNPP [bis(2,4-dinitrofenil)fosfato], catalisada por um complexo dinuclear de cobre(II) (R1). Esse complexo metálico foi originalmente planejado para mimetizar a estrutura e as propriedades catalíticas do sítio ativo das catecóis oxidases (COs), revelando um caso interessante de promiscuidade catalítica em sistemas biomiméticos. As possibilidades de mecanismo foram cuidadosamente avaliadas através de cálculos de Teoria do Funcional da Densidade (DFT) em fase gás e em fase aquosa com cálculos no ponto dentro do modelo contínuo polarizável (PCM). Dois mecanismos principais foram encontrados. O Mecanismo 1 (Concertado) corresponde a uma reação do tipo SN2 que envolve o ataque da ponte µOH, situada entre os íons Cu(II), ao centro fosfórico da molécula de BDNPP, enquanto que o Mecanismo 2 (Associativo) ocorre através de sucessivas transferências de próton entre o átomo de oxigênio desta mesma ponte com o átomo de oxigênio terminal do grupo fosfato, passando pela formação de um intermediário pentacoordenado estável. O Mecanismo 1 envolve dois possíveis caminhos reacionais para a liberação do íon DNPP [(2,4-dinitrofenil)fosfato] gerado após a quebra hidrolítica. O primeiro caminho reacional (p1) envolve uma transferência de próton – que ocorre entre o átomo de oxigênio que compunha a ponte µ-OH e o átomo de oxigênio terminal do grupo fosfato – imediatamente após a quebra hidrolítica, seguido pela entrada de duas moléculas de água, sendo a etapa de transferência de próton determinante da velocidade. O segundo caminho reacional (p2) envolve a entrada de duas moléculas de água imediatamente após a quebra hidrolítica sem que haja a reação de transferência de próton, sendo a etapa de quebra hidrolítica a etapa determinante da velocidade. Dentre as propostas de mecanismo estudadas o caminho reacional p2 dentro do Mecanismo 1 corresponde ao mais provável, uma vez que possui a menor barreira de reação (ΔG‡ = 23,7 kcal mol-1, em solução aquosa). A constante de velocidade observada experimentalmente, Kobs, vale 1,7 × 10-5 s-1, indicando que o valor calculado teoricamente (K1 = 2.6 × 10-5 s-1) está em excelente acordo com o valor experimental. O efeito isotópico cinético (KIE) foi avaliado para o caminho reacional p2 dentro do Mecanismo 1 com o intuito de entender as alterações estruturais envolvidas na formação do TS1-i (Estado de transição para o Mecanismo 1), caracterizando perfeitamente o mecanismo descrito. O efeito explícito da inclusão de moléculas do solvente foi avaliado de maneira preliminar para apenas uma estrutura do ciclo catalítico para a quebra hidrolítica de ésteres de fosfato, através da utilização do método de Monte Carlo. Os resultados permitem uma análise detalhada da organização das moléculas de solvente ao redor do complexo, podendo servir de ponto de partida para uma análise mais elaborada dos mecanismos reacionais utilizando modelos explícitos para o solvente. O mecanismo de oxidação de catecóis – representado pelo substrato modelo, o 3,5-di-tercbutilcatecol (DTBC) – no sítio ativo do complexo R1 foi avaliado através de cálculos quanto-mecânicos. Embora não tenham sido obtidos resultados conclusivos acerca da cinética da reação, os aspectos estruturais das principais espécies envolvidas no ciclo catalítico foram analisados. / In this thesis the theoretical investigation of the hydrolytic cleavage mechanism of a phosphate diester, BDNPP [bis(2,4-dinitrophenyl)phosphate] in the active site of the dinuclear copper complex, labelled as R1, has been proposed. The metal complex was originally designed to mimic the active site structure as well the catalytic properties of catechol oxidase, revealing an interesting case of catalytic promiscuity in biomimetic systems. The mechanistic possibilities have been carefully evaluated through Density Functional Theory (DFT) calculations in gas phase and in aqueous solution using continuum solvation models with single point calculations within the Polarizable continuum model (PCM). Two reaction mechanisms have been proposed. The Mechanism 1 (Concerted) is a SN2 type mechanism which involves the direct attack of the µ-OH bridge between the two copper(II) ions towards the phosphorus center whereas, the Mechanism 2 (Associative) occurs through two successive proton transferences between the oxygen atom of the bridging hydroxo ligand and another oxygen atom of the phosphate model forming a stable pentacoordinate intermediate. There are two reactions paths for Mechanism 1 to release the DNPP (2,4-dinitrophenylphosphate) ion generated after the hydrolytic cleavage. The first reaction path (p1) involves a proton transfer immediately after the hydrolytic cleavage, being the proton transfer the rate-determining step, followed by the entry of two water molecules. The second reaction path (p2) comprises the entry of two water molecules just after the hydrolytic cleavage without any proton transfer, being the hydrolytic cleavage the rate limiting step. The most probable catalytic path occurs via Mechanism 1, following the second reaction path (p2) once it involves the lowest free energies activation barrier (ΔG‡ = 23.7 kcal mol-1, in aqueous solution). The experimental rate constant, Kobs is 1.7 × 10-5 s-1, indicating that the calculated value, (K1 = 2.6 × 10-5 s-1) is in a very good accordance with the experimental value. Kinetic Isotope Effect (KIE) analysis for the second reaction path (p2) within the Mechanism 1 has also been considered in order to understand the changes taking place in TS1-i (transition state of Mechanism 1) and perfectly characterize the mechanism here described. The solvent effect using explicit water molecules were evaluated in a preliminary fashion for one structure within the catalytic cycle of hydrolytic cleavage of phosphate ester, using the Monte Carlo method. The obtained results allows a detailed analysis of the water molecules organization around the complex, serving as a starting point for an more elaborated study of the reaction mechanisms by using explicit solvent models. The oxidation of catechols – represented herein by the model substrate, 3,5-di-tercbuthylcatechol (DTBC) – in the active site of the R1 complex were evaluated by using quantum-mechanical calculations. The results are not conclusive for the kinetic, but the structural aspects for the main species in the catalytic cycle were studied.