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Triagem de enzimas associadas à biotransformação de hidrocarbonetos a partir de metagenoma de sedimentos contaminados com petroléo e metais pesados / Screening of Enzymes Related to Biotransformation of Hydrocarbons from Metagenome of Contaminated Sediments with Oil and Heavy Metals

Simões, Tiago Henrique Nogueira 08 July 2009 (has links)
A metagenômica trouxe novas perspectivas ao estudo de comunidades microbianas no ambiente, permitindo explorar tanto a diversidade taxonômica de microrganismos ainda não-cultivados, como o acesso direto a genes e vias metabólicas. Neste trabalho, foram construídas bibliotecas metagenômicas a partir de amostras de sedimentos de mangue da Baía de Guanabara (RJ), impactadas com hidrocarbonetos de petróleo e metais pesados. Proteobacteria (33,3%), bactérias afiliadas a redutoras-de-sulfato (29,7%) e Firmicutes (20%) representaram os grupos principais nas amostras ambientais, baseado em análises filogenéticas de rDNA 16S, ao passo que isolamentos seletivos utilizando diesel e naftaleno permitiram a recuperação preferencial de delta-Proteobacteria e actinomicetos. Bibliotecas metagenômicas dos sedimentos enriquecidos com óleo diesel, com insertos entre 25 e 35 Kb clonados em fosmídeos, foram triadas para detecção de genes catabólicos de monoxigenases (alkB1) e expressão de epóxido-hidrolases, esterases, lipases e monoxigenases em ensaios de alto desempenho (HTS, high throughput screening). Clones reativos a alkB1 foram detectados, porém não foram funcionais nas condições de HTS testadas. Nas bibliotecas de fosmídeos triadas, vários clones apresentaram atividade enzimática, sendo que dois apresentaram atividade de lipase-esterase com alta seletividade, elevada taxa de conversão de substratos e excesso enantiomérico (ee >99%). Os resultados de HTS comprovaram a eficiência do uso da clonagem direta de DNA ambiental na expressão de vias metabólicas de interesse com potencial de aplicação biotecnológica. / Metagenomics brought a new perspective to the study of microbial communities in the environment, enabling access to the taxonomic diversity of uncultured microorganisms, as well as direct access to genes and metabolic pathways. In the current study, metagenomic libraries were constructed from mangrove sediment samples of the Guanabara Bay (RJ, Brazil), impacted with oil hydrocarbons and heavy metals. Proteobacteria (33.3%), sulfate-reducing affiliated bacteria (29.7%) and Firmicutes (20%) represented the main groups in the environmental samples based upon 16S rDNA phylogenetic analysis, whereas selective isolation using diesel and naphtalene yielded delta-Proteobacteria and actinomycetes. Metagenomic libraries of diesel-enriched sediment samples, with 25 to 35 Kb fosmid inserts, were screened for detecting monooxigenase genes (alkB1) and expression of epoxide hydrolases, esterases, lipases and monooxigenases in high throughput screening (HTS) assays. Clones reactive to the alkB1 probe were detected, but were not functional under the HTS conditions used. Several functional clones were detected in the clone library, and two showed lipase-esterase activity with high rates of substrate conversion and enantiomeric ratio (ee >99%). The results obtained on HTS showed the efficiency of the direct cloning of environmental DNA for the expression of metabolic pathways with potential biotechnological application.
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Identification des nouvelles phospholipases A microbiennes : purification et caractérisation biochimique d’une phospholipase A2 fongique secrétée / Identification of novel microbial phospholipases A and the purification and biochemical characterization of a secreted fungal phospholipase A2

Sutto Ortiz, Priscila 05 October 2017 (has links)
Les phospholipases A catalysent sélectivement l'hydrolyse de la liaison ester des glycérophospholipides dans la position sn-1 (PLA1) et sn-2 (PLA2), libérant des acides gras et des lysophospholipides. Nous avons identifié des PLAs à partir des champignons/actinomycètes isolés des environnements du Mexique. Dans la 1ère partie, une méthode colorimétrique à haut débit pour la détection générale de l'activité PLA (cHTS-PLA) avec la PC comme substrat et le rouge crésol a été développée. L'analyse rRNA 16S des souches productrices des PLAs a démontrant qu'elles appartiennent aux genres Streptomyces et Aureobasidium. La production des PLAs a été mise en œuvre utilisant la fermentation en milieu solide avec la PC comme inducteur et la bagasse de canne à sucre comme support. Globalement, cette étude a contribué à la découverte des nouvelles PLA et au criblage des PLAs à haut débit dans les extraits microbiens / Phospholipase A are lipolytic enzymes that hydrolyze selectively the ester bond of glycerophospholipid substrates at the sn-1 (PLA1) and sn-2 (PLA2) position, respectively, releasing free fatty acids and lysophospholipids. We identified new PLAs from fungi and actinomycetes isolated from Mexican environments. Firstly, we implemented an agar-plate method containing rhodamine 6G and phosphatidylcholine (PC) for the primary screening. Then, a colorimetric high-throughput screening assay for general PLA activity detection (cHTS-PLA) using PC substrate and cresol red was developed. According to 16S rRNA analysis, PLA producing strains were mostly belonging to Streptomyces and Aureobasidium genus. Production of PLAs was implemented by solid-state fermentation with PC as inductor and sugar-cane bagasse as support. Overall, this study has contributed to the discovery of new microbial PLAs and to pave the way toward the HTS of PLA activity in microbial extracts
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New Methods for Chiral Cyanohydrin Synthesis

Wingstrand, Erica January 2009 (has links)
This thesis deals with method development in asymmetric catalysis and specifically syntheses of enantioenriched O-functionalized cyanohydrins. The first part describes the development of a method for the synthesis of O‑alkoxycarbonylated and O-acylated cyanohydrins. Ethyl cyanoformate and acyl cyanides were added to aldehydes in a reaction catalyzed by a chiral dimeric Ti-salen complex together with a tertiary amine. High yields and enantioselectivities were in most cases obtained. Mechanistic studies were performed and a reaction mechanism was proposed. ­ The second part describes a method in which the undesired minor enantiomer in a Lewis acid–Lewis base-catalyzed acylcyanation is continuously recycled into prochiral starting material. Close to enantiopure O‑acylated cyanohydrins were obtained in high yields. The third part deals with asymmetric acylcyanations of ketones. Acetyl cyanide was found to add to α‑ketoesters in a reaction catalyzed by a chiral Lewis base. Yields up to 77% and 82% ee were obtained. The final part describes an enzymatic method for high-throughput analysis of O‑acylated cyanohydrins. The enantiomeric excess and conversion were determined for products obtained from a number of aromatic and aliphatic aldehydes. / QC 20100818
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Kombinatorisches Compoundieren und mechanische Online-Prüfungen

Barth, Jan 21 May 2013 (has links) (PDF)
Durch das Einbringen von Additiven, Füll- und Verstärkungsstoffen in eine polymere Matrix oder durch das Blenden unterschiedlicher Polymere ist es möglich, die Eigenschaften von Kunststoffen gezielt auf den Anwendungsfall hin zu optimieren. Gerade durch diese „Einstellbarkeit“ der Eigenschaften und infolge ihrer vergleichsweise geringen Dichte verdrängen Kunststoffe zunehmend klassische Werkstoffe und erobern so neue Anwendungsgebiete. Die Entwicklung solcher innovativer Kunststoffrezepturen (Compounds) ist jedoch zeitaufwendig und kostenintensiv. Um die gewünschten Gebrauchseigenschaften des Endproduktes zu erreichen, ist oft eine Vielzahl unterschiedlicher Zusatzstoffe erforderlich; somit werden entsprechende Rezepturen schnell sehr komplex. Bei der klassischen Materialentwicklung wird zumeist nicht erfasst/ermittelt, welche Synergien die einzelnen Bestandteile - positiver oder negativer Art - untereinander haben. Eine gezielte systematische Untersuchung dieser Synergien mit klassischen Methoden ist aus Kosten- und Zeitgründen kaum möglich. Für eine zeitgemäße Materialentwicklung sind daher neue Methoden gefragt, die eine schnelle Rezepturvariation, gepaart mit einem schnellen Eigenschaftsscreening, ermöglichen. Mit der Entwicklung des kombinatorischen Compoundier und High Throughput Screening Systems (CC/HTS-Systems) wurde im Rahmen dieser Arbeit eine, auch industriell einsetzbare, Basisanlage für die schnelle Entwicklung von neuen und innovativen Compoundrezepturen erstellt und hinsichtlich der Übertragbarkeit der Ergebnisse verifiziert. Das CC/HTS-System besteht aus: • einem Doppelschneckenextruder (ZSK 18 MegaLab) Eine entscheidende Besonderheit dieses System resultiert aus der Möglichkeit, die Materialzufuhr und damit die Zusammensetzung über rechnergesteuerte Dosierwaagen kontinuierlich zu verändern. Die im Vergleich zur klassischen Vorgehensweise somit vorhandene schnelle Rezepturänderung ermöglicht es in kürzester Zeit, eine große Rezepturvielfalt abzuarbeiten. • einer Flachfolienanlage Durch die direkte Kopplung der Flachfolienanlage mit der Folienextrusion wird der Rezepturgradient in einer Folie, im Sinne einer 1-dimensionalen Library „eingefroren“. • integrierten Prüfeinrichtungen Durch den Einsatz von in das System zu integrierenden unterschiedlichen HTS-Methoden ist eine schnelle und aussagefähige Charakterisierung der so hergestellten Rezepturen direkt online möglich. Erst diese im Rahmen dieser Arbeit entwickelten und validierten mechanischen Online-Prüfungen, als neue HTS-Methoden, ermöglichen durch deren Integration in das Gesamtsystem ein schnelles Materialscreening, indem die im Rahmen des CC hergestellten Folien (Library) online auf ihre mechanische Performance hin geprüft werden. Die mechanische Online-Prüfeinrichtung wurde so konzipiert, dass drei unterschiedliche Tests simultan in einer Vorrichtung durchgeführt werden. Hierbei handelt es sich um: • einen Durchstoßversuch, • einen Weiterreißversuch (wahlweise in oder travers zur Folienabzugsrichtung), • einen modifizierten Zugversuch (wahlweise in oder travers zur Folienabzugsrichtung). Anhand dieser drei zeitgleich online gemessenen Werkstoffkennwerte sind Aussagen über die wichtigsten mechanischen Eigenschaften - Steifigkeit, Zähigkeit und Festigkeit - abhängig von der Werkstoffzusammensetzung möglich. Die Prüfeinrichtungen für den Zug- und den Weiterreißversuch sind so konstruiert, dass sie sich je nach Entwicklungsaufgabe in der Prüfeinrichtung um 90° drehen lassen, um auch mechanische Eigenschaften in und/oder travers zur Folienabzugsrichtung zu ermitteln. Durch das Entfernen der Kerbmesser in der Prüfeinrichtung des Weiterreißversuchs lässt sich dieser zu einem zweiten Online-Zugversuch umrüsten, um z. B. gleichzeitig in und travers zur Folienabzugsrichtung die Zugfestigkeit zu erfassen. Hierdurch ist es möglich, in einem Prozessdurchlauf das anisotrope Werkstoffverhalten rezeptur- und prozessabhängig zu charakterisieren. Die Entwicklung der mechanischen Online-Prüfeinrichtung wurde durch stetige Validierung der Prüfergebnisse abgesichert. Als Ergebnis dieser Validierungsschritte ist festzuhalten, dass die online und offline ermittelten mechanischen Eigenschaften gut miteinander korrelieren. Eine entscheidende Frage beim CC war neben der Korrelierbarkeit der mechanischen Eigenschaften die Zuordnung der Rezepturzusammensetzung - welche sich kontinuierlich infolge der Gradientendosierung verändert - zu den online ermittelten Materialeigenschaften. Hierbei ist das Verweilzeitverhalten des Gesamtsystems, bestehend aus Extruder und Flachfolienanlage, zu berücksichtigen. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden zunächst verschiedene theoretische Modelle auf ihre Anwendbarkeit hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das Double Backflow Cell Model die gewählte Versuchsanordnung am besten beschreibt. Als Ergebnis dieser theoretischen Überlegungen ist festzuhalten, dass für eine gute Korrelation von Rezepturzusammensetzung und online ermittelten Materialeigenschaften nur die System-Totzeit bei hinreichend langer Gradientenzeit zu berücksichtigen ist. Diese Arbeitshypothese konnte durch einen Versuch mittels Gradientenzugabe von Glasfasern von 0 w% auf 30 w% in Polypropylen und anschließender Glührückstandsbestimmung experimentell bestätigt werden. Im Anschluss an die Entwicklung und Validierung des Gesamtsystems (Gradientendosierung und mechanische Online-Prüfung) wurden die Möglichkeiten des CC/HTS-Systems anhand eines praxisrelevanten Zweistoffsystems, bestehend aus Polypropylen und verschiedenen POEs, welche sich im Viskositätsverhältnis zum Polypropylen und dem α-Olefin-Anteil unterscheiden, aufgezeigt. Durch das Blenden von Polypropylen mit einem Polyolefinelastomer (POE) lässt sich Polypropylen schlagzäh modifizieren. Bei einem solchen Blend aus zwei in der Regel nicht mischbaren Polymeren ist die sich einstellende Phasenmorphologie für das mechanische Werkstoffverhalten von entscheidender Bedeutung. Die Phasenmorphologie, also die Form und Größe der POE-Partikel, in der Polypropylenmatrix ist stark von der ausgewählten POE-Type abhängig. Um Aussagen zur Blendmorphologie zu erhalten, wurde im Rahmen dieser Untersuchungen die mechanische Online-Prüfung erstmals mit einer Online-Kleinwinkellichtstreuung als HTS-Methoden gekoppelt. Durch die Online-Kleinwinkellichtstreuung ist es möglich, simultan zu den mechanischen Eigenschaften auch online Rückschlüsse auf die Blendmorphologie zu erhalten. Diese Untersuchungen zeigten, wie die Morphologie und die mechanischen Eigenschaften korrelieren und welche Bedeutung der Auswahl der Blendpartner - des POEs – für das mechanische Werkstoffverhalten zukommt. Interessant war, dass die untersuchten Prozessparameter von untergeordneter Bedeutung für die Performance eines solchen Blends sind. Abschließend wurde die CC/HTS Methode auf eine industrielle Fragestellung - Dreistoffsystem bestehend aus Polypropylen/Glasfasern/Koppler – angewandt. Die Anwendbarkeit des Systems auch auf komplexere Werkstoffzusammensetzungen wurde dabei bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe dieser Methode / Versuchseinrichtung die Compoundentwicklung deutlich beschleunigt und ressourcenschonender durchgeführt werden kann und die Ergebnisse mit den klassisch erarbeiteten Werten korrelieren.
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Phosphatases and prolyl-isomerase in the regulation of the C-terminal domain of eukaryotic RNA polymerase II

Zhang, Mengmeng 29 January 2013 (has links)
In eukaryotes, the first step of interpreting the genetic information is the transcription of DNA into RNA. For protein-coding genes, such transcription is carried out by RNA polymerase II. A special domain of RNA polymerase II, called the C-terminal domain (CTD), functions as a master controller for the transcription process by providing a platform to recruit regulatory proteins to nascent mRNA (Chapter 1-2). The modifications and conformational states of the CTD, termed the 'CTD code', represent a critical regulatory checkpoint for transcription. The CTD, found only in eukaryotes, consists of 26--52 tandem heptapeptide repeats with the consensus sequence, Tyr₁Ser₂Pro₃Thr₄Ser₅Pro₆Ser₇. Phosphorylation of the serines and prolyl isomerization of the prolines represent two major regulatory mechanisms of the CTD. Interestingly, the phosphorylation sites are typically close to prolines, thus the conformation of the adjacent proline could impact the specificity of the corresponding kinases and phosphatases. Understanding how those modifying enzymes recognize and regulate the CTD is important for expanding our knowledge on the transcription regulation and deciphering the 'CTD code'. During my PhD study, I studied the function of CTD phosphatases and prolyl isomerase in the CTD regulation using Scp1, Ssu72 and Pin1 as model regulators. Scp1 and Ssu72 are both Ser5 phosphatases. However, Ssu72 is an essential protein and regulates the global transcription while Scp1 epigenetically silences the expression of specific neuronal genes. Pin1 is a highly conserved phosphorylation-specific prolyl isomerase that recognizes the phospho-Ser/Thr-Pro motif within the CTD as one of its primary substrates in vivo. Among these enzymes, Scp1 is the focal point of this dissertation, as it was studied from different angles, such as enzymatic mechanism (Chapter 3 describes the capture of phospho-aspartyl intermediate of Scp1 as a direct evidence for the proposed two-step mechanism), specific inhibition (Chapter 4 describes the identification and characterization of the first specific inhibitor of Scp1), and its non-active-site contact with the CTD (Chapter 5 describes the structural basis of this contact). These studies are of great importance towards understanding the molecular mechanism of the dephosphorylation process of the CTD by Scp1. / text
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Development of a Novel Pck-1: eGFP Reporter Zebrafish Line for the Discovery and Evaluation of Potential Anti-Diabetic Drugs

Hui, Wing 27 November 2013 (has links)
Overexpression of Phosphoenolpyruvate carboxykinase - cytosolic (PEPCK, encoded by Pck-1 gene) has been found to be associated with the prevalence of hyperglycemia in Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) patients. The Pck-1 enzyme catalyzes the rate limiting step in endogenous glucose production. The aims of this study are to develop a Pck-1:eGFP reporter zebrafish and validate it as a potential tool for the screening of novel anti-diabetic compounds. 3.6 kb zebrafish Pck-1 promoter fragment was cloned and a Pck-1:eGFP expression vector was constructed. After DNA microinjection, we generated Pck-1:eGFP reporter zebrafish with strong eGFP expression in developing liver. Validation studies confirmed that Pck-1:eGFP zebrafish embryos responded to treatment of glucose, cAMP and dexamethasone, metformin and rosiglitazone similarly to that of humans. This novel Pck-1:eGFP reporter fish line can serve as a tool for the screening and development of novel anti-diabetic drugs that may have potential in the treatment of T2DM.
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Development of a Novel Pck-1: eGFP Reporter Zebrafish Line for the Discovery and Evaluation of Potential Anti-Diabetic Drugs

Hui, Wing 27 November 2013 (has links)
Overexpression of Phosphoenolpyruvate carboxykinase - cytosolic (PEPCK, encoded by Pck-1 gene) has been found to be associated with the prevalence of hyperglycemia in Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) patients. The Pck-1 enzyme catalyzes the rate limiting step in endogenous glucose production. The aims of this study are to develop a Pck-1:eGFP reporter zebrafish and validate it as a potential tool for the screening of novel anti-diabetic compounds. 3.6 kb zebrafish Pck-1 promoter fragment was cloned and a Pck-1:eGFP expression vector was constructed. After DNA microinjection, we generated Pck-1:eGFP reporter zebrafish with strong eGFP expression in developing liver. Validation studies confirmed that Pck-1:eGFP zebrafish embryos responded to treatment of glucose, cAMP and dexamethasone, metformin and rosiglitazone similarly to that of humans. This novel Pck-1:eGFP reporter fish line can serve as a tool for the screening and development of novel anti-diabetic drugs that may have potential in the treatment of T2DM.
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Interferon, viruses and drug discovery

Gage, Zoe O. January 2017 (has links)
The interferon (IFN) response is a crucial component of cellular innate immunity, vital for controlling virus infections. Dysregulation of the IFN response however can lead to serious medical conditions including autoimmune disorders. Modulators of IFN induction and signalling could be used to treat these diseases and as tools to further understand the IFN response and viral infections. We have developed cell-based assays to identify modulators of IFN induction and signalling, based on A549 cell lines where a GFP gene is under the control of the IFN-β promoter (A549/pr(IFN-β).GFP) and the ISRE containing MxA promoter (A549/pr(ISRE).GFP) respectively. The assays were optimized, miniaturized and validated as suitable for HTS by achieving Z' Factor scores >0.6. A diversity screen of 15,667 compounds using the IFN induction reporter assay identified 2 hit compounds (StA-IFN-1 and StA-IFN-4) that were validated as specifically inhibiting IFNβ induction. Characterisation of these molecules demonstrated that StA-IFN-4 potently acts at, or upstream, of IRF3 phosphorylation. We successfully expanded this HTS platform to target viral interferon antagonists acting upon IFN-signalling. An additional assay was developed where the A549/pr(ISRE).GFP.RBV-P reporter cell line constitutively expresses the Rabies virus phosphoprotein. A compound inhibiting viral protein function will restore GFP expression. The assay was successfully optimized for HTS and used in an in-house screen. We further expanded this assay by placing the expression of RBV-P under the control of an inducible promoter. This demonstrates a convenient approach for assay development and potentiates the targeting of a variety of viral IFN antagonists for the identification of compounds with the potential to develop a novel class of antiviral drugs.
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Exploration de la diversité de Carnobacterium maltaromaticum en vue d'identifier des souches protectrices anti-Listeria monocytogenes à robustesse élevée / Exploration of the diversity of Carnobactrium maltaromaticum in order to identify highly robust anti-Listeria monocytogenes strains

El Kheir, Sara 12 December 2016 (has links)
L'industrie alimentaire cherche constamment à améliorer les processus de conservation des aliments. La biopréservation s’impose comme une alternative à l’utilisation de conservateurs dits «chimiques» et fait appel à des micro-organismes sélectionnés en tant que cultures protectrices pour leurs propriétés antimicrobiennes naturels. L'objectif de cette étude était de tirer profit de la diversité de Carnobacterium maltaromaticum afin d’identifier des souches capables d'inhiber la croissance du pathogène alimentaire Listeria monocytogenes. Pour cela, une méthode de typage moléculaire permettant la reconnaissance fine de souches a été établie, puis une méthode de criblage d’activités antibactériennes à robustesse élevée a été mise au point. La méthode de typage moléculaire est une méthode MLVA (Multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis) avec 3 loci de VNTR (VNTR-A, VNTR-B, VNTR-C) permet de discriminer 15 génotypes différents au sein d’une collection de 24 souches. Cela confirme la grande diversité génotypique et phénotypique présente au sein de la population de C. maltaromaticum et la performance de la méthode. La méthode de criblage est basée sur la réalisation d’essais de compétition à haut débit où chaque membre d’une collection de C. maltaromaticum a été co-cultivé avec une souche bioluminescente de L. monocytogenes. Il a été montré que la production de luminescence est le reflet de la croissance de L. monocytogenes en micro-culture et qu’il est ainsi possible de tester la stabilité du pouvoir antagoniste de chaque membre de la collection dans de multiples conditions de cultures différentes. Cette méthode a ainsi permis d’identifier des souches de C. maltaromaticum dont la propriété anti-L. monocytogenes est peu influencée par les conditions de cultures. Outre l’intérêt fondamental que présente cette méthode pour l’étude des interactions compétitives dans l’aliment, elle a permis d’identifier des souches présentant un fort potentiel de valorisation dans le domaine de la biopréservation alimentaire / The food industry is constantly seeking to improve food preservation processes. Biopreservation imposes itself as an alternative to the use of chemical preservatives and involves micro-organisms selected as protective cultures for their natural antimicrobial properties. The aim of this study was to benefit from the diversity of Carnobacterium maltaromaticum in order to identify strains capable of inhibiting the growth of Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. For this purpose, a molecular typing method that enables fine strain identification has been established, then a method of screening of antibacterial activities with high robustness has been developed. The molecular typing method is a MLVA (Multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis) with 3 VNTR loci (VNTR-A, VNTR-B, VNTR-C). It allowed to discriminate 15 different genotypes among a collection of 24 C. maltaromaticum strains. These results confirmed the high strain diversity within this species and showed the high performance of this method. The screening method is based on high throughput competition assays where each member of a collection of C. maltaromaticum strains was co-cultivated with a bioluminescent strain of L. monocytogenes. It was established that the bioluminescence of this strains is highly correlated to bacterial growth in micro-cultures, indicating that it is possible to investigate the stability of antagonistic properties of each collection member under multiple different culture conditions. The use of this method allowed to identify C. maltaromaticum strains with bioprotection properties that are poorly influenced by culture conditions. Besides the fundamental interest of this method for investigations of competitive interactions in food, it allowed to identify strains with high potential for bioprotection applications
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Etude de la régulation du système de sécrétion de type 3 et du système de sécrétion de type 6 chez Pseudomonas aeruginosa : Approches de chémogénomique, mutagénèse aléatoire et étude d'isolat clinique / Study of the regulation of the Type III and Type VI Secretion Systems in Pseudomonas aeruginosa : Chemogenomic approaches, random mutagenesis and study of clinical isolate.

Sall, Khady 28 November 2013 (has links)
Pseudomonas aeruginosa est un bacille gram négatif, ubiquiste de l'environnement. Ce pathogène opportuniste humain provoque sous sa forme planctonique des infections aiguës dont le facteur de virulence clé est le SST3. P. aeruginosa peut aussi se développer sous forme de biofilm où elle exprime entre autre le SST6-1 et induire des infections chroniques. L'expression ciblée des différents facteurs de virulence est liée à l'intégration de nombreux stimuli environnementaux transduits au moyen de systèmes à deux composants ou encore de messagers secondaires, comme le di-GMPc et l'AMPc, et conduisant à une régulation très fine, conférant une grande capacité d'adaptation à la bactérie. La nature, de même que les mécanismes impliqués dans la transduction du signal, n'ont pas encore été tous identifiés à ce jour. Le but de cette thèse était de décrypter ces mécanismes moléculaires de détection et de transduction du signal gouvernant la réponse adaptative de ce pathogène à son environnement au moyen de différentes approches : chémogénomique, mutagénèse aléatoire et d'étude d'isolat clinique. Lors de cette thèse, nous avons criblé deux chimiothèques commerciales à la recherche de molécules activatrices du SST3 et du SST6-1 et nous avons pu établir un test de criblage à haut débit robuste pour les criblages de plus larges banques de composés. En utilisant une souche avec deux rapporteurs, nous avons réalisé une banque de mutants par transposons et nous avons trouvé des mutants affectés dans leur expression du SST3, candidats intéressants pour identifier de nouveaux régulateurs du système. Enfin, grâce à l'analyse de l'isolat clinique CHA (issu d'un patient atteint de mucoviscidose), nous avons découvert qu'une délétion dans le gène codant pour le régulateur majeur GacS définissait le phénotype agressif de cette souche. / Pseudomonas aeruginosa is a gram negative bacillum present in several places. This opportunistic pathogen has the capacity to infect a wide range of hosts: plants, animals, humans. This bacterium, that shows an impressive adaptability relying on a multifactorial virulence, possesses two lifestyles. These lifestyles are associated with specific virulence patterns of expression. Under its planktonic form, P. aeruginosa can provoke acute infections thanks to the activation of T2 and T3SS or induces chronic infections in cystic fibrosis patients' lungs where it establishes a biofilm (communautary life). The expression of virulence factors is linked to the integration of several environmental cues that are transduced through two-component systems and secondary messengers like c-di-GMP and that lead to a fine tuned regulation. The nature and the mechanisms involved in this signal transduction remain largely unknown. The goal of this thesis was to decipher molecular mechanisms of signal detection and transduction that govern the adaptive pathogen response to host environment using the combination of a chemogenomics, random mutagenesis and study of clinical isolate. During this work, we screened two commercial libraries and set up a robust high throughput screening test to analyse huge molecules libraries. By setting up a double reporter-gene strain, we realized a transposon mutagenesis bank and identified interesting candidates with a down-regulated T3SS. Finally, the study of the particular clinical isolate CHA (from a cystic fibrosis patient), leads to the discovery that a deletion in the gene encoding for the important regulator GacS shapes the aggressive phenotype of this strain.

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