Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T08:42:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tizei_PedroAugustoGalvao_M.pdf: 2670317 bytes, checksum: edbc1214fe54dca40dc54a503a4d4c85 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A produção fermentativa de etanol a partir de substratos chamados de "primeira geração", como cana-de-açúcar e amido de milho, já atingiu níveis muito elevados de eficiência. As linhagens industriais utilizadas nestes processos já são adaptadas ao ambiente industrial e possuem características que dificultam o melhoramento por engenharia genética tradicional. Duas abordagens inovadoras foram utilizadas para buscar processos fermentativos mais eficientes: o uso de reatores bioelétricos para alterar os produtos da fermentação e um ensaio de engenharia evolutiva para otimizar fenótipos heterólogos. Foram feitas fermentações bioelétricas com Saccharomyces cerevisiae, obtendo aumentos de produtividade de etanol, sem alterar o rendimento final, e também mudanças nas proporções dos subprodutos glicerol e acetato. Uma resposta distinta foi observada para uma linhagem industrial cultivada nas mesmas condições. Foram realizadas análises de expressão gênica global de linhagens de laboratório e industrial fermentando sob estímulo bioelétrico. Não foram observadas alterações na via fermentativa, mas houve variações grandes na expressão de genes relacionados a outros aspectos da fisiologia da levedura, como genes para síntese de lipídios de membrana e genes desconhecidos ou com funções aparentemente não-relacionadas ao processo fermentativo. Também foi evidente uma resposta global diferente entre as duas linhagens. Foi estabelecido um método automatizado para ensaios de engenharia evolutiva, que permitiu a seleção de linhagens por crescimento em celobiose. Utilizando apenas a variabilidade presente no genoma de uma linhagem industrial diplóide, foi possível obter linhagens haplóides com desempenho superior à linhagem parental. Portanto, esta estratégia pode ser viável para se obter fenótipos superiores utilizando linhagens distantes de S. cerevisiae / Abstract: Fermentative ethanol production from substrates known as "first generation", such as sugar cane and corn starch, has reached very high levels of efficiency. The industrial strains used in these processes are already adapted to the industrial environment and possess characteristics that hinder further improvement by traditional genetic engineering. Two innovative approaches were used to seek more efficient fermentation processes: the use of bioelectric reactors to alter fermentation products and an evolutionary engineering assay to optimize heterologous phenotypes. Bioelectric fermentations were carried out with Saccharomyces cerevisiae, obtaining increases in ethanol productivity, without changing the final yield, and also changes in the proportions of byproducts glycerol and acetate. A distinct response was observed for an industrial strain cultivated under the same conditions. Global gene expression analyses were carried out for a laboratory and industrial strain under bioelectric stimulus. No changes were observed for the fermentative pathway, but there were large variations in expression for genes related to other aspects of yeast physiology, such as membrane lipid synthesis and unknown genes or genes with functions that are apparently unrelated to the fermentation process. A difference in the global response for the two strains was also evident. An automated method for evolutionary engineering assays was established, which allowed the selection of strains by growth on cellobiose. Using only the genetic variability present within the genome of a diploid industrial strain, it was possible to obtain haploid strains with superior growth rate when compared to the parental strain. Therefore, this strategy may be viable for obtaining superior phenotypes using distant strains of S. cerevisiae / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第24532号 / 医科博第146号 / 新制||医科||10(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 金子 新, 教授 上杉 志成, 教授 寺田 智祐 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T00:00:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prause_AndreRichard_D.pdf: 4277553 bytes, checksum: d91469a30bbec7480bb60a683266a0af (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Com o aumento da busca por novas fontes renováveis para a substituição do petróleo fóssil como substrato de derivados petroquímicos, as indústrias de plásticos, atualmente um dos ramos mais dependentes da acessibilidade do petróleo, já alcançaram um nível alto de sustentabilidade em linhas de polímeros verdes. Porém, rotas verdes para a obtenção do produto final ainda não foram implantadas industrialmente, sendo que somente precursores dos monômeros desejados são produzidos. A partir desses precursores, o processo é continuado convencionalmente através de operações químicas até a obtenção do monômero. O desenvolvimento de uma rota enzimática para esses monômeros pode ser uma alternativa para os processos praticados na indústria. Enzimas são amplamente utilizadas para a bio-conversão industrial de compostos químicos e a busca por enzimas capazes de catalisar novas reações tem se intensificado, criando uma demanda maior por processos automatizados com aplicação de protocolos de rastreamento de alto desempenho. Para a realização da produção enzimática de alcenos de cadeia curta, uma enzima nativa, apresentando um mecanismo catalítico similar à reação desejada, foi modificada pela aplicação do conceito de "desenho de proteínas", que reúne técnicas de diversificação, recombinação, clonagem, expressão heteróloga e rastreamento, utilizando a "enzima molde" como ponto de partida. A enzima P450BS?, selecionada por apresentar os melhores pré-requisitos para modificações estruturais, foi submetida ao "desenho de proteínas", gerando 5.271 versões mutantes. O rastreamento de alto desempenho automatizado dessas proteínas alteradas, utilizando uma plataforma robótica, possibilitou a obtenção de uma enzima que apresenta a nova ação catalítica da conversão de 100 ?M de ácido octanóico para 2,6 ?M de 1-hepteno. Essa nova enzima abre o caminho para a produção industrial de "bio-alcenos" em micro-organismos, criando um sistema de fermentação que poderia sustentar uma rota verde para os monômeros necessários para a produção de plásticos. / Abstract: With the increased search for renewable resources for substituting fossil petroleum as the raw material for petrochemical products, the plastics industry, currently being one of the branches with the highest dependency on petroleum availability, already reached a high level of sustainability in their green polymer lines. Still, green routes producing the final product have not been implemented industrially and only precursors of the desired are being produced. Using these precursors, the process is continued conventionally, using chemical operations for the production of the monomers. The development of an enzymatic route toward these monomers could be an alternative for current industrial processes. Enzymes are widely used in industrial bioconversion of chemicals and the search for enzymes with the potential of catalyzing new reactions has intensified, creating a higher demand for automatized processes for the application of high-throughput screening protocols. In order to realize the enzymatic production of short-chained alkenes, a native enzyme, presenting a catalytic mechanism similar to the target reaction, was modified, applying the concept of "protein design", which unites diversification, recombination, cloning, heterologous expression and screening techniques, utilizing the "template enzyme" as a starting point. The enzyme P450BS?, selected for possessing the best prerequisites for structural modifications, was submitted to "protein design", creating 5,271 mutant versions. Automatized high-throughput screening of these altered proteins, utilizing a liquid handling platform, enabled the discovery of an enzyme, which presents a new catalytic action: the conversion of 100 ?M butyric acid to 2.6 ?M 1-heptene. This new enzyme opens the way for the industrial production of "bio-alkenes" in microorganisms, creating a fermentation system, which would be able to sustain a green route toward the necessary monomers for the production of plastics. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular