Chez S.cerevisiae, NuA4 est un complexe Histone acetyltransferase (HAT) de 1,3 MDa contenant 13 sous unités. Esal, seule HAT essentielle chez la levure, est la sous-unité catalytique qui acétyle les histones H4 et H2A et une des six protéines essentielles du complexe. De plus, six protéines sont présentes dans d'autres complexes de modification (SAGA, Sin3/Rpd3) et de remodelage ATP- dépendant de la chromatine (Ino80 et Swrl) et deux sous-groupes ont été identifiés comme ayant une activité cellulaire indépendante et distincte de NuA4 (PiccoloNuA4 et le trimère Eaf5/7/3). Cette organisation modulaire de NuA4 correspond aux multiples besoins de recrutements et de régulation d'Esal par la cellule lors des événements de réparation, de transcription et de replication de la chromatine. Chez l'humain, le complexe Tip60 est l'orthologue de NuA4 et regroupe les activités de modification de la chromatine de NuA4 et de Swrl. L'organisation spatiale de NuA4 présente donc beaucoup d'intérêt. Au sein du laboratoire du professeur Jacques Côté, je concentre mon travail sur la production et la purification du complexe NuA4. Avec nos échantillons hautement purifiés, les techniques d'analyse par microscopie électronique (EM) et de reconstitution informatique, réalisées par nos collaborateurs Johnathan Chittuluru et Francisco Asturias, permettent, avec une forte résolution, de visualiser le complexe en 3D. Les atouts majeurs associés à cette technique sont aussi de visualiser les interactions du complexe avec un nucléosome et de localiser les sous-unités dans le complexe (par deletion ou étiquetage). Dès lors, ces résultats apportent des indications pertinentes sur NuA4 et ces différents modules qui par recrutement ou interaction directe avec les histones participent à la régulation dynamique de la chromatine.

Le génome est organisé sous forme de chromatine afin de contourner la problématique d’espace limité dans le noyau. De plus, cette structure hautement condensé est une barrière physique aux processus cellulaires qui nécessite l’accès à l’information génétique. Les dernières années d'études ont dévoilé des complexes modificateurs de la chromatine comme des acteurs clés dans plusieurs mécanismes de modulation de la chromatine. L'un de ces modificateurs est NuA4, un complexe conservé au cours de l’évolution qui acétyle les histones H2A, H2A.Z et H4. Dans cette thèse, en utilisant Saccharomyces cerevisiae comme organisme modèle, nous avons identifié l'implication de NuA4 dans l'incorporation de H2A.Z et la biosynthèse des voies purines. Dans une seconde partie, nous étudions la participation de NuA4 dans la réponse aux dommages de l'ADN. Plus précisément, nous avons caractérisé la phosphorylation des sous-unités NuA4 dépendante de Mec1/Tel1. L’ensemble de ces travaux, comment NuA4 coordonne différentes activités cellulaires. / Cell genome is packaged into chromatin in order to compensate the limited space within the nucleus. However, this highly condensed structure also presents strong physical barriers for cellular processes using DNA as templates. Recent years of studies have unveiled chromatin modifying complexes as key players in several mechanisms of chromatin modulation. One of these modifiers is NuA4, an evolutionary conserved large multi-subunit histone acetyltransferase complex that acetylates histone H2A, H2A.Z and H4. In this thesis, using Saccharomyces cerevisiae as model system, we identified the implication of NuA4 in global histone variant H2A.Z incorporation and purine biosynthesis pathways. Moreover, we also show previously uncharacterized involvement of NuA4 in DNA damage response pathways through Mec1/ Tel1-dependent phosphorylation events on NuA4 subunits. Further analysis will shed light on detailed mechanisms about how NuA4, as a multifunctional complex, coordinates various cellular activities.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La régulation de la dynamique des chromosomes dicte la finalité de nombreux processus, tels la transcription, la réparation, la réplication et la recombinaison de l'ADN. Ce contrôle s'exerce notamment par la modification de la chromatine, un assemblage nucléoprotéique responsable de l'organisation de l'information génétique à l'intérieur du noyau des cellules eucaryotes. La chromatine constitue une plateforme dynamique et active où l'intégration de multiples événements de signalisation s'effectue. De ce fait, elle est porteuse d'une information épigénétique cruciale à l'homéostasie de la cellule et des organismes. Les complexes multiprotéiques pouvant modifier ou remodeler la structure de la chromatine sont au cœur de cette régulation. Leur caractérisation biochimique et fonctionnelle est donc primordiale à la compréhension des fonctions nucléaires. Une des modifications les mieux caractérisées est l'acétylation post-traductionnelle des queues N-terminales des histones, protéines structurales majeures de la chromatine. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe histone acétyltransférase NuA4, dont l'activité catalytique est portée par la protéine Esal, est le seul de ce type à être essentiel à la viabilité de la levure. Cet assemblage de 13 sous-unités cible les extrémités des histones H2A et H4 et agit comme co-activateur transcriptionnel ainsi que co-facteur dans la réparation des cassures double brin de l'ADN. Le but premier mes études doctorales était de déterminer si le complexe NuA4 était conservé chez l'humain. Nous avons donc entrepris la purification et la caractérisation biochimique et fonctionnelle de ce complexe à partir de cellules humaines en culture. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence l'étonnante conservation de NuA4 chez les eucaryotes, en plus d'observer l'évolution convergente de deux complexes aux activités distinctes, réunis en une seule entité chez les métazoaires. L'identification des différentes protéines constituant ces complexes nous a amené à caractériser l'environnement moléculaire d'une famille de suppresseurs de tumeur impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire et agissant comme co facteurs de p53; la famille « inhibitor of growth ». Ceci nous a permis d'identifier trois nouveaux complexes histone acétyltransférase chez l'humain. De plus, nous avons mis en évidence leur rôle essentiel dans le processus de réplication de l'ADN.

UHRF1 est une protéine nucléaire responsable du maintien et de la régulation de l'épigénome des cellules. Elle favorise la prolifération cellulaire et est surexprimée dans la plupart des cancers. TIP60, l'un des partenaires le plus important d’UHRF1, est impliqué dans le remodelage de la chromatine et la régulation transcriptionnelle grâce à son activité acétyltransférase. Ensemble, les deux protéines régulent la stabilité et l'activité d'autres protéines telles que la DNMT1 et la p53. Le but de cette étude était d'explorer le mécanisme d'interaction entre UHRF1 et TIP60 en visualisant cette interaction dans les cellules. La microscopie par imagerie à temps de vie de fluorescence et d'autres techniques de biologie moléculaire ont été utilisées. Les résultats ont montré que UHRF1 interagit directement avec le domaine MYST de TIP60 et cette interaction se produit dans la phase S du cycle cellulaire. Les deux protéines ont également montré une réponse similaire aux dommages à l'ADN, ce qui prédit une cohérence dans leur fonction dans le mécanisme de réparation de l'ADN. La surexpression de TIP60 a également induit la baisse du niveau d’UHRF1 et de DNMT1 ainsi qu’une induction d'apoptose dans les cellules ce qui suggère un rôle de TIP60 dans la régulation des fonctions oncogéniques d’UHRF1. / UHRF1 is a nuclear protein maintaining and regulating the epigenome of cells. Its promotes proliferation and is found upregulated in most of cancers. TIP60 is one of the important interacting partner of UHRF1 and is involved in chromatin remodeling and transcriptional regulation through its acetyltransferase activity. Together they regulate the stability and activity of other proteins such as DNMT1 and p53. The aim of this thesis was to explore the mechanism of interaction between UHRF1 and TIP60 by visualizing this interaction in cells. Fluorescent lifetime imaging microscopy and other molecular biology techniques were employed for this purpose. Results of this study showed that UHRF1 interacts directly to the MYST domain of TIP60 and this interaction prevails in the S-phase of cell cycle. Both proteins also showed a similar response to DNA damage predicting a coherence in their function in DNA repair mechanism. Overexpression of TIP60 also downregulated UHRF1 and DNMT1 and induced apoptosis in cells suggesting a role of TIP60 in regulation of oncogenic functions of UHRF1.

La chromatine est essentielle au maintien de l’intégrité du génome, mais, ironiquement, constitue l’obstacle principal à la transcription des gènes. Plusieurs mécanismes ont été développés par la cellule pour pallier ce problème, dont l’acétylation des histones composant les nucléosomes. Cette acétylation, catalysée par des histones acétyl transférases (HATs), permet de réduire la force de l’interaction entre les nucléosomes et l’ADN, ce qui permet à la machinerie transcriptionnelle de faire son travail. Toutefois, on ne peut laisser la chromatine dans cet état permissif sans conséquence néfaste. Les histone déacétylases (HDACs) catalysent le clivage du groupement acétyle pour permettre à la chromatine de retrouver une conformation compacte. Cette thèse se penche sur la caractérisation de la fonction et du mécanisme de recrutement des complexes HDACs Rpd3S et Set3C. Le complexe Rpd3S est recruté aux régions transcrites par une interaction avec le domaine C-terminal hyperphosphorylé de Rpb1, une sous-unité de l’ARN polymérase II. Toutefois, le facteur d’élongation DSIF joue un rôle dans la régulation de cette association en limitant le recrutement de Rpd3S aux régions transcrites. L’activité HDAC de Rpd3S, quant à elle, dépend de la méthylation du résidu H3K36 par l’histone méthyltransférase Set2. La fonction du complexe Set3C n’est pas clairement définie. Ce complexe est recruté à la plupart de ses cibles par l’interaction entre le domaine PHD de Set3 et le résidu H3K4 di- ou triméthylé. Un mécanisme indépendant de cette méthylation, possiblement le même que pour Rpd3S, régit toutefois l’association de Set3C aux régions codantes des gènes les plus transcrits. La majorité de ces résultats ont été obtenus par la technique d’immunoprécipitation de la chromatine couplée aux biopuces (ChIP-chip). Le protocole technique et le design expérimental de ce type d’expérience fera aussi l’objet d’une discussion approfondie. / Chromatin is essential for the maintenance of genomic integrity but, ironically, is also the main barrier to gene transcription. Many mechanisms, such as histone acetylation, have evolved to overcome this problem. Histone acetylation, catalyzed by histone acetyltransferases (HATs), weakens the internucleosomal and nucleosome-DNA interactions, thus permitting the transcriptional machinery access to its template. However, this permissive chromatin state also allows for opportunistic DNA binding events. Histone deacetylases (HDACs) help restore a compact chromatin structure by catalyzing the removal of acetyl moieties from histones. This thesis focuses on the characterization of the function and of the recruitment mechanism of HDAC complexes Rpd3S and Set3C. The Rpd3S complex is recruited to actively transcribed coding regions through interactions with the hyperphosphorylated C-terminal domain of Rpb1, a subunit of RNA polymerase II, with the DSIF elongation factor playing a role in limiting this recruitment. However, the HDAC activity of Rpd3S depends on H3K36 methylation, which is catalyzed by the Set2 histone methyltransferase. The Set3C complex’ function is still not clearly defined. It is recruited to most of its targets through the interaction between the Set3 PHD domain and di- or trimethylated H3K4. However, Set3C recruitment to genes displaying high RNA polymerase II occupancy is independent of H3K4 methylation. The mechanism by which Set3C is recruited to this gene subset is under investigation. These results have mostly been obtained through chromatin immunoprecipitation coupled to tiling microarrays (ChIP-chip). The protocol and experimental design challenges inherent to this technique will also be discussed in depth.

La chromatine est essentielle au maintien de l’intégrité du génome, mais, ironiquement, constitue l’obstacle principal à la transcription des gènes. Plusieurs mécanismes ont été développés par la cellule pour pallier ce problème, dont l’acétylation des histones composant les nucléosomes. Cette acétylation, catalysée par des histones acétyl transférases (HATs), permet de réduire la force de l’interaction entre les nucléosomes et l’ADN, ce qui permet à la machinerie transcriptionnelle de faire son travail. Toutefois, on ne peut laisser la chromatine dans cet état permissif sans conséquence néfaste. Les histone déacétylases (HDACs) catalysent le clivage du groupement acétyle pour permettre à la chromatine de retrouver une conformation compacte. Cette thèse se penche sur la caractérisation de la fonction et du mécanisme de recrutement des complexes HDACs Rpd3S et Set3C. Le complexe Rpd3S est recruté aux régions transcrites par une interaction avec le domaine C-terminal hyperphosphorylé de Rpb1, une sous-unité de l’ARN polymérase II. Toutefois, le facteur d’élongation DSIF joue un rôle dans la régulation de cette association en limitant le recrutement de Rpd3S aux régions transcrites. L’activité HDAC de Rpd3S, quant à elle, dépend de la méthylation du résidu H3K36 par l’histone méthyltransférase Set2. La fonction du complexe Set3C n’est pas clairement définie. Ce complexe est recruté à la plupart de ses cibles par l’interaction entre le domaine PHD de Set3 et le résidu H3K4 di- ou triméthylé. Un mécanisme indépendant de cette méthylation, possiblement le même que pour Rpd3S, régit toutefois l’association de Set3C aux régions codantes des gènes les plus transcrits. La majorité de ces résultats ont été obtenus par la technique d’immunoprécipitation de la chromatine couplée aux biopuces (ChIP-chip). Le protocole technique et le design expérimental de ce type d’expérience fera aussi l’objet d’une discussion approfondie. / Chromatin is essential for the maintenance of genomic integrity but, ironically, is also the main barrier to gene transcription. Many mechanisms, such as histone acetylation, have evolved to overcome this problem. Histone acetylation, catalyzed by histone acetyltransferases (HATs), weakens the internucleosomal and nucleosome-DNA interactions, thus permitting the transcriptional machinery access to its template. However, this permissive chromatin state also allows for opportunistic DNA binding events. Histone deacetylases (HDACs) help restore a compact chromatin structure by catalyzing the removal of acetyl moieties from histones. This thesis focuses on the characterization of the function and of the recruitment mechanism of HDAC complexes Rpd3S and Set3C. The Rpd3S complex is recruited to actively transcribed coding regions through interactions with the hyperphosphorylated C-terminal domain of Rpb1, a subunit of RNA polymerase II, with the DSIF elongation factor playing a role in limiting this recruitment. However, the HDAC activity of Rpd3S depends on H3K36 methylation, which is catalyzed by the Set2 histone methyltransferase. The Set3C complex’ function is still not clearly defined. It is recruited to most of its targets through the interaction between the Set3 PHD domain and di- or trimethylated H3K4. However, Set3C recruitment to genes displaying high RNA polymerase II occupancy is independent of H3K4 methylation. The mechanism by which Set3C is recruited to this gene subset is under investigation. These results have mostly been obtained through chromatin immunoprecipitation coupled to tiling microarrays (ChIP-chip). The protocol and experimental design challenges inherent to this technique will also be discussed in depth.