Vegetais minimamente processados passam por algumas etapas durante seu preparo, ocorrem modificações na sua forma natural, porém devem manter a qualidade do produto fresco. Este estudo teve como objetivo quantificar mesófilos e psicrotróficos, coliformes totais e fecais, e verificar a presença de Escherichia coli, parasitos e sujidades em hortaliças prontas para o consumo. Foi utilizado o método de contagem em placas (UFC/g), para mesófilos e psicrotróficos. A contagem dos coliformes foi pelo método do Número Mais Provável (NMP). E. coli foi confirmada em meio EMB e provas bioquímicas. Para pesquisa de enteroparasitos, as hortaliças foram lavadas e o sedimento analisado pelos métodos de Faust e Lutz. As sujidades foram investigadas por filtração e observação em estereomicroscópio. A análise de mesófilos e psicrotróficos foi mensal, realizada em 48 amostras, variando entre 5,68 a 8,21 log10 UFC/g e entre 6,90 a 8,44 log10 UFC/g respectivamente. Destas, 24 foram analisadas para coliformes, onde as contagens de totais foram de <0,47 a 4,38 log10 NMP/g e de fecais de <0,47 a 3,66 log10 NMP/g. Quatro (16,6%) amostras apresentaram índices acima do permitido pela legislação. E coli foi observada em 6 amostras de coliformes fecais. Das 48 amostras utilizadas nas análises parasitológicas, cinco (10,4%) foram positivas para oocistos de Eimeria spp. A maioria das amostras apresentou algum tipo de sujidades. Contaminação de origem fecal foi verificada, sugerindo falhas nas etapas do processamento ou sanificação das hortaliças, além de indicar que o solo ou águas de irrigação possam constituir possíveis fontes desses microrganismos.

Vegetais minimamente processados passam por algumas etapas durante seu preparo, ocorrem modificações na sua forma natural, porém devem manter a qualidade do produto fresco. Este estudo teve como objetivo quantificar mesófilos e psicrotróficos, coliformes totais e fecais, e verificar a presença de Escherichia coli, parasitos e sujidades em hortaliças prontas para o consumo. Foi utilizado o método de contagem em placas (UFC/g), para mesófilos e psicrotróficos. A contagem dos coliformes foi pelo método do Número Mais Provável (NMP). E. coli foi confirmada em meio EMB e provas bioquímicas. Para pesquisa de enteroparasitos, as hortaliças foram lavadas e o sedimento analisado pelos métodos de Faust e Lutz. As sujidades foram investigadas por filtração e observação em estereomicroscópio. A análise de mesófilos e psicrotróficos foi mensal, realizada em 48 amostras, variando entre 5,68 a 8,21 log10 UFC/g e entre 6,90 a 8,44 log10 UFC/g respectivamente. Destas, 24 foram analisadas para coliformes, onde as contagens de totais foram de <0,47 a 4,38 log10 NMP/g e de fecais de <0,47 a 3,66 log10 NMP/g. Quatro (16,6%) amostras apresentaram índices acima do permitido pela legislação. E coli foi observada em 6 amostras de coliformes fecais. Das 48 amostras utilizadas nas análises parasitológicas, cinco (10,4%) foram positivas para oocistos de Eimeria spp. A maioria das amostras apresentou algum tipo de sujidades. Contaminação de origem fecal foi verificada, sugerindo falhas nas etapas do processamento ou sanificação das hortaliças, além de indicar que o solo ou águas de irrigação possam constituir possíveis fontes desses microrganismos.

Vegetais minimamente processados passam por algumas etapas durante seu preparo, ocorrem modificações na sua forma natural, porém devem manter a qualidade do produto fresco. Este estudo teve como objetivo quantificar mesófilos e psicrotróficos, coliformes totais e fecais, e verificar a presença de Escherichia coli, parasitos e sujidades em hortaliças prontas para o consumo. Foi utilizado o método de contagem em placas (UFC/g), para mesófilos e psicrotróficos. A contagem dos coliformes foi pelo método do Número Mais Provável (NMP). E. coli foi confirmada em meio EMB e provas bioquímicas. Para pesquisa de enteroparasitos, as hortaliças foram lavadas e o sedimento analisado pelos métodos de Faust e Lutz. As sujidades foram investigadas por filtração e observação em estereomicroscópio. A análise de mesófilos e psicrotróficos foi mensal, realizada em 48 amostras, variando entre 5,68 a 8,21 log10 UFC/g e entre 6,90 a 8,44 log10 UFC/g respectivamente. Destas, 24 foram analisadas para coliformes, onde as contagens de totais foram de <0,47 a 4,38 log10 NMP/g e de fecais de <0,47 a 3,66 log10 NMP/g. Quatro (16,6%) amostras apresentaram índices acima do permitido pela legislação. E coli foi observada em 6 amostras de coliformes fecais. Das 48 amostras utilizadas nas análises parasitológicas, cinco (10,4%) foram positivas para oocistos de Eimeria spp. A maioria das amostras apresentou algum tipo de sujidades. Contaminação de origem fecal foi verificada, sugerindo falhas nas etapas do processamento ou sanificação das hortaliças, além de indicar que o solo ou águas de irrigação possam constituir possíveis fontes desses microrganismos.

O comércio de vegetais minimamente processados (VMP) tem crescido substancialmente nos últimos anos devido a sua conveniência, frescor e aparente salubridade. No entanto, o processamento mínimo não reduz as populações de microrganismos patogênicos para níveis seguros. A irradiação de alimentos é utilizada para estender a vida de prateleira e inativar patógenos presentes nos alimentos. Seu uso combinado com o processamento mínimo poderia aumentar a segurança e qualidade dos VMP. Dois diferentes métodos de detecção de alimentos irradiados, um biológico, o DEFT/APC, e outro bioquímico, o teste do cometa, foram aplicados a VMP com o objetivo de testar sua aplicabilidade na detecção do tratamento por radiação. O DEFT/APC é um método de varredura microbiológico baseado no uso da técnica de epifluorescência direta em filtro (DEFT) e da contagem padrão em placas (APC). O teste do cometa detecta o dano no DNA devido, por exemplo, a radiação ionizante. Amostras de acelga, agrião, alface, catalônia, couve, escarola, espinafre e repolho do comércio varejista foram irradiadas com 0,5kGy e 1,0kGy utilizando um irradiador de 60Co. O processamento por irradiação garantiu a redução de pelo menos dois ciclos logarítmicos nas populações de microrganismos aeróbios e psicrotróficos. Em geral, com o aumento das doses de radiação, as contagens DEFT se mantiveram similares independentemente do processamento por irradiação, enquanto as contagens APC diminuíram gradualmente. A diferença das duas contagens aumentou gradualmente com o incremento da dose em todas as amostras. Uma diferença entre o valor de DEFT e do APC maior a 2,0 log seria indicativa de que o VMP foi tratado por irradiação. O teste do cometa permitiu distinguir amostras não irradiadas das irradiadas, que mostraram diferentes tipos de cometas decorrentes da fragmentação do DNA. Tanto o método DEFT/APC quanto o teste do cometa foram satisfatoriamente utilizados como métodos de varredura para a detecção do tratamento por irradiação. / Marketing of minimally processed vegetables (MPV) are gaining impetus due to its convenience, freshness and apparent healthy. However, minimal processing does not reduce pathogenic microorganisms to safe levels. Food irradiation is used to extend the shelf life and inactivation of food-borne pathogens. Its combination with minimal processing could improve the safety and quality of MPV. Two different food irradiation detection methods, a biological, the DEFT/APC, and another biochemical, the DNA Comet Assay were applied to MPV in order to test its applicability to detect irradiation treatment. DEFT/APC is a microbiological screening method based on the use of the direct epifluorescent filter technique (DEFT) and the aerobic plate count (APC). DNA Comet Assay detects DNA damage due to ionizing radiation. Samples of lettuce, chard, watercress, dandelion, kale, chicory, spinach, cabbage from retail market were irradiated 0.5kGy and 1.0kGy using a 60Co facility. Irradiation treatment guaranteed at least 2 log cycle reduction for aerobic and psychrotroph microorganisms. In general, with increasing radiation doses, DEFT counts remained similar independent of irradiation processing while APC counts decreased gradually. The difference of the two counts gradually increased with dose increment in all samples. It could be suggested that a DEFT/APC difference over 2.0 log would be a criteria to judge if a MPV was treated by irradiation. DNA Comet Assay allowed distinguishing non-irradiated samples from irradiated ones, which showed different types of comets owing to DNA fragmentation. Both DEFT/APC method and DNA Comet Assay would be satisfactorily used as a screening method for indicating irradiation processing.

O comércio de vegetais minimamente processados (VMP) tem crescido substancialmente nos últimos anos devido a sua conveniência, frescor e aparente salubridade. No entanto, o processamento mínimo não reduz as populações de microrganismos patogênicos para níveis seguros. A irradiação de alimentos é utilizada para estender a vida de prateleira e inativar patógenos presentes nos alimentos. Seu uso combinado com o processamento mínimo poderia aumentar a segurança e qualidade dos VMP. Dois diferentes métodos de detecção de alimentos irradiados, um biológico, o DEFT/APC, e outro bioquímico, o teste do cometa, foram aplicados a VMP com o objetivo de testar sua aplicabilidade na detecção do tratamento por radiação. O DEFT/APC é um método de varredura microbiológico baseado no uso da técnica de epifluorescência direta em filtro (DEFT) e da contagem padrão em placas (APC). O teste do cometa detecta o dano no DNA devido, por exemplo, a radiação ionizante. Amostras de acelga, agrião, alface, catalônia, couve, escarola, espinafre e repolho do comércio varejista foram irradiadas com 0,5kGy e 1,0kGy utilizando um irradiador de 60Co. O processamento por irradiação garantiu a redução de pelo menos dois ciclos logarítmicos nas populações de microrganismos aeróbios e psicrotróficos. Em geral, com o aumento das doses de radiação, as contagens DEFT se mantiveram similares independentemente do processamento por irradiação, enquanto as contagens APC diminuíram gradualmente. A diferença das duas contagens aumentou gradualmente com o incremento da dose em todas as amostras. Uma diferença entre o valor de DEFT e do APC maior a 2,0 log seria indicativa de que o VMP foi tratado por irradiação. O teste do cometa permitiu distinguir amostras não irradiadas das irradiadas, que mostraram diferentes tipos de cometas decorrentes da fragmentação do DNA. Tanto o método DEFT/APC quanto o teste do cometa foram satisfatoriamente utilizados como métodos de varredura para a detecção do tratamento por irradiação. / Marketing of minimally processed vegetables (MPV) are gaining impetus due to its convenience, freshness and apparent healthy. However, minimal processing does not reduce pathogenic microorganisms to safe levels. Food irradiation is used to extend the shelf life and inactivation of food-borne pathogens. Its combination with minimal processing could improve the safety and quality of MPV. Two different food irradiation detection methods, a biological, the DEFT/APC, and another biochemical, the DNA Comet Assay were applied to MPV in order to test its applicability to detect irradiation treatment. DEFT/APC is a microbiological screening method based on the use of the direct epifluorescent filter technique (DEFT) and the aerobic plate count (APC). DNA Comet Assay detects DNA damage due to ionizing radiation. Samples of lettuce, chard, watercress, dandelion, kale, chicory, spinach, cabbage from retail market were irradiated 0.5kGy and 1.0kGy using a 60Co facility. Irradiation treatment guaranteed at least 2 log cycle reduction for aerobic and psychrotroph microorganisms. In general, with increasing radiation doses, DEFT counts remained similar independent of irradiation processing while APC counts decreased gradually. The difference of the two counts gradually increased with dose increment in all samples. It could be suggested that a DEFT/APC difference over 2.0 log would be a criteria to judge if a MPV was treated by irradiation. DNA Comet Assay allowed distinguishing non-irradiated samples from irradiated ones, which showed different types of comets owing to DNA fragmentation. Both DEFT/APC method and DNA Comet Assay would be satisfactorily used as a screening method for indicating irradiation processing.

CUNHA, Francisco Afrânio. Detecção de betalactamases de espectro expandindo (ESBL) em cepas de coliformes isolados de hortaliças minimante comercializadas na cidade de Fortaleza -CE. 2007100 f : . Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Fortaleza-CE, 2007 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-06T13:34:15Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_facunha.pdf: 3336053 bytes, checksum: c193599fd7b4044ea639d9c9eaa1b454 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-06T13:34:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_facunha.pdf: 3336053 bytes, checksum: c193599fd7b4044ea639d9c9eaa1b454 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T13:34:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_facunha.pdf: 3336053 bytes, checksum: c193599fd7b4044ea639d9c9eaa1b454 (MD5) Previous issue date: 2007 / Minimally processed vegetables (MPV) normally consist of fresh raw vegetables, washed, peeled, cut, disinfected, centrifugal dryed packed and kept under refrigeration. Vegetables are potential vehicle of microorganisms that can be associated to the outbreaks of foodborne. Countless are the causes for the presence high microbial load in that product type, among which are: the cultivation techniques, storage, transport and distribution for consumption, the practice of the use of organic fertilizer, the use of polluted water for irrigation, the transport accomplished in open crates and the hygiene conditions in the handling and preparation of meals, mainly when such foods are consumed raw. The objective of this study was to determine the presence of extendedspectrum β-betalactamases (ESBL) in strains of Enterobacteriaceae isolated of MPV marketed in the city of Fortaleza and to verify if the analyzed vegetables assists the Brazilian Food Sanitation Standard, RDC N° 12, 02 of january 2001. 80 samples of MPV were collected marketed in Fortaleza. Were collected vegetables studied: 8 samples beet; 10 lettuce; 8 of cherry-colored tomato; 8 purple cabbage, green cabbage; 10 carrot and green bean; 8 grated carrot; 10 grated carrot, green cabbage and purple cabbage; 10 salads; 8 cilantro, onion and parsley pricked. The analyses were accomplished of april from 2006 to may of 2007. The countings of mesophiles aerobic, varied from 5,60 to 13,35 log UFC / g of MPV. The countings of moulds and yeasts, varied from 5,54 to 9,88 log UFC / g MPV. The counting of total coliforms and fecal coliforms were quite high. The main isolated and identified mold was the Penicillium spp. All of the beet samples, grated carrot, carrot and green bean, grated carrot, purple cabbage and green cabbage, cilantro and parsley pricked met inappropriate for the consumption, because they presented amounts superior of 100 fecal coliforms / g samples. Of the samples of lettuce 50% they presented fecal coliforms counting above legislation. Of the tomatoes cherry analyzed 75% were inside patterns of the Brazilian legislation, for fecal coliforms. Of the samples of purple cabbage, green cabbage 87% were with fecal coliforms counting above. Of the samples of salad 80% were out of the patterns. Salmonellas were not detected in the samples of MPV analyzed. The main isolated Enterobacteriaceae were E. coli, K. pneumoniae and E. aerogenes. All of the strains of K. pneumoniae and E. aerogenes were resistant to the ampicillin. Strains of E. coli, K pneumoniae and E. aerogenes with multidrug resistance were detected. Resistance to ciprofloxacin, ceftazidime and imipenem was not observed. Enterobacteriaceae samples producing of ESBL were not detected. Were not identified strains of E. coli O15:H7 among the strains of E. coli isolated of MPV. The hygienicsanitary conditions of those products can be improved with the application of Good Practices in the whole productive chain. / Hortaliças minimamente processadas (HMP) normalmente consistem de hortaliças frescas, cruas, lavadas, descascadas, cortadas, sanitizadas, centrifugadas, empacotadas e acondicionadas sob refrigeração. Hortaliças são potenciais veículos de microrganismos que podem estar associadas à doenças transmitidas por alimentos. Inúmeras são as causas para a presença de elevada carga microbiana nesse tipo de produto, entre as quais estão: as técnicas de cultivo, armazenamento, transporte e distribuição para consumo, a prática do uso de adubo orgânico, a utilização de água contaminada para rrigação, o transporte realizado em engradados abertos e as condições de higiene no manuseio e preparo de refeições, principalmente quando tais alimentos são consumidos crus. O objetivo desse estudo foi determinar a presença de Enzimas Betalactamases de Espectro Expandido (ESBL) em cepas de Enterobacteriaceae isoladas de HMP comercializadas na cidade de Fortaleza e verificar se as hortaliças analisadas a atendem a RDC N° 12 de 02 de janeiro de 2001, que rege o padrão microbiológico dos alimentos no Brasil. Foram coletadas 80 amostras de HMP comercializadas em Fortaleza. As hortaliças estudadas foram: 8 amostras de acelga; 10 alface; 8 tomate cereja; 8 repolho roxo, repolho verde; 10 cenoura e vagem; 8 cenoura ralada; 10 cenoura ralada, repolho verde e repolho roxo; 10 saladas; 8 coentro, cebola e salsa picados. As análises foram realizadas de abril de 2006 a maio de 2007. As contagens de microrganismos aeróbios mesófilos variaram de 5,60 a 13,35 log UFC/ g de HMP. As contagens de bolores e leveduras variaram de 5,54 a 9,88 log UFC/ g de HMP. A contagem de coliformes totais e coliformes a 45°C foram bastante elevadas. O principal bolor isolado e identificado foi o enicillium spp. Todas as amostras de acelga, cenoura ralada, cenoura e vagem, cenoura ralada, repolho roxo e repolho verde, coentro e salsa picados encontravam-se impróprias para o consumo, pois apresentaram quantidades superiores a 100 coliformesa 45ºC/g de amostra. Das amostras de alface 50% apresentavam contagem decoliformes a 45ºC acima do permitido peça legislação. Dos tomates cereja analisados 75% estavam dentro padrões microbiológicos exigidos pela legislação brasileira, para coliforme a 45ºC. Das amostras de repolho roxo, repolho verde 87% estavam com contagem de coliformes acima do permitido. Das amostras de salada 80% estavam fora dos padrões. Não foram detectadas Salmonellas nas amostras de HMP analisadas. As principais cepas de Enterobacteriaceae isoladas foram E. coli, K. pneumoniae e E. aerogenes. Todas as cepas de K. pneumoniae e E. aerogenes foram resistentes à ampicilina. Foram detectadas cepas de E. coli, K pneumoniae e E aerogenes com multiresistência aos antibióticos testados. Não foi observada resistência a ciprofloxacina, ceftazidima e imipenem. Não foram detectadas amostras de enterobactérias produtoras de ESBL. Não foram identificadas cepas de E. coli O15:H7 entre as cepas de E. coli isoladas de HMP. As condições higiênico-sanitárias desses produtos podem ser melhoradas com a aplicação de Boas Práticas em toda a cadeia produtiva.

A vida moderna tem gerado mudanças importantes nos hábitos alimentares em todo o mundo e observa-se um aumento da demanda por alimentos prontos para o consumo, tais como frutas e hortaliças minimamente processadas. As condições de embalagem e armazenamento destes produtos podem favorecer a multiplicação de bactérias psicrotróficas, destacando-se o patógeno Listeria monocytogenes. Para estudos de avaliação de riscos microbiológicos relativos a L. monocytogenes, dados quantitativos são fundamentais, mas, os métodos para enumeração disponíveis atualmente são trabalhosos e morosos. Há grande interesse no desenvolvimento de métodos rápidos para a determinação das populações de L. monocytogenes, o que pode reduzir significativamente o tempo de análise. Neste trabalho, foram analisadas 162 amostras de hortaliças minimamente processadas adquiridas no comércio varejista de Ribeirão Preto/SP, no período de setembro de 2007 a agosto de 2008. Foram realizados ensaios convencionais para enumeração de coliformes totais e termotolerantes, Escherichia coli e bactérias aeróbias psicrotróficas. Foi realizada a detecção de Listeria sp. por imunoensaio (Oxoid Listeria Rapid Test) e de Salmonella por método convencional. Alíquotas congeladas de amostras positivas para L. monocytogenes e Salmonella sp. foram também avaliadas quantitativamente empregando-se métodos convencionais. Para quantificação de L. monocytogenes foi utilizado o método da Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) em tempo real, com primers de DNA baseados em 16S rRNA. Para a comparação do método de PCR em tempo real e método convencional de cultivo, foram inoculadas seis amostras de hortaliças minimamente processadas (alface, cheiro-verde, couve, almeirão, repolho e acelga) com três níveis de inoculação. Dentre as 162 amostras de hortaliças analisadas, L. monocytogenes foi detectada em uma amostra de couve e uma de cheiro-verde, com populações de 1,5 x 103 e 0,43 NMP/g, respectivamente. Salmonella sp. foi isolada de duas amostras de almeirão, com populações de 0,09 e 4,6 NMP/g. Contaminação por coliformes totais foi detectada em 132 (81,5%) amostras e por coliformes termotolerantes em 107 (66%) amostras. Escherichia coli foi confirmada em 86 (53,1%) amostras, enquanto que 158 (96,7%) amostras apresentaram população de bactérias psicrotróficas maior que 5 log UFC/g. Os resultados obtidos entre os dois métodos desenvolvidos apresentaram pouca variação e todos os resultados foram concordantes considerando-se o intervalo de confiança de 95% da técnica do NMP (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001). A PCR em tempo real foi otimizada com a preparação comercial ABSOLUTETM QPCR SYBR® Green Mix (ABgene, Reino Unido) e os primers utilizados mostraram ser específicos para L. monocytogenes. As populações de microrganismos encontradas nestes alimentos indicaram a baixa qualidade microbiológica e evidenciaram a importância da implantação de programas para garantia da inocuidade de alimentos na cadeia produtiva das hortaliças minimamente processadas. A PCR em tempo real mostrou ser de fácil execução e diminuiu o tempo de obtenção de resultados para pouco mais que 48 horas em comparação com o tempo gasto (7 dias) quando as hortaliças foram analisadas por meio do método convencional de cultivo. / Modern lifestyles have deeply changed eating habits worldwide, with an increasing demand for ready-to-eat foods, including minimally processed fruits and leafy greens. Packaging and storage conditions of these products may favor the growth of psychrotrophic bacteria, such as the pathogen Listeria monocytogenes. For microbiological risk assessment, it is crucial to generate quantitative data on foodborne pathogens, but the enumeration methods currently available are labor and time consuming. There is great interest in the development of reliable and fast methods for enumeration of L. monocytogenes, in order to shorten the time needed to obtain quantitative results. In this study 162, samples of leafy vegetables minimally processed were acquired at retail market in Ribeirão Preto from September, 2007 to August 2008 and they were analysed by conventional enumerating methods for total and thermophilic coliforms, Escherichia coli and psychrotrophic aerobic bacteria. Presence or absence of Listeria spp. was evaluated by immunoassay (Oxoid Listeria Rapid test) and detection of Salmonella was performed by conventional methods. Frozen aliquots of Salmonella spp. and L. monocytogenes positive samples were quantitatively evaluated by conventional methods and L. monocytogenes was also enumerated by real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) with DNA primers based on 16S rRNA. Real-time PCR method was applied to analyze six artificially contaminated vegetables and the results obtained with this methodology were similar to the ones obtained with conventional most probably number (MPN) technique with a confidence interval of 95% (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001). Of the 162 samples analyzed, L. monocytogenes was detected in one sample of collard green and in one mixed bunch of parsley plus spring onion (1.5x103 and 0.43 MPN/g, respectively). Salmonella sp was detected in two samples of common chicory with populations of 0.09 and 4.6 MPN/g. One hundred and thirty two samples (81.5%) showed contamination by total coliforms and 107 (66%) by thermophilics coliforms. Escherichia coli was confirmed in 86 (53.1%) samples while 156 (96.7%) showed populations of psychrotrophic bacteria above of 5 log CFU/g. PCR was optimized with a commercial preparation ABSOLUTE TM QPCR SYBRÒ Green Mix (ABgene, UK) and the primers utilized were specific for L. monocytogenes. These results showed the low microbiologic quality of minimally processed vegetables samples studied and indicate an urge for implementation of quality programs from producer to processors of these ready-to-eat foods. Realtime In comparison with the conventional culture method, real-time PCR was more easily performed and the time required to obtain the results was reduced to ca. 48 hours, in comparison with 7 days for conventional method.

Made available in DSpace on 2015-04-17T15:03:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1319855 bytes, checksum: c9da3a0b2d2daa085371bfaec1a3a590 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The demand for fresh foods, with lower calories, high nutritional values and easily prepared has been increased the consumption of minimally processed vegetables. However, because the intense handling these products has been considered a potential problem to the microbiological safety, related mainly to the presence of psychrotrophic pathogenic and spoilage bacteria. The sanitization is considered a critical processing step for minimally processed vegetables, although some of the synthetic sanitizers allowed for the use in vegetables are cited as responsible for undesirable effects to consumers. In this context, as alternative to the synthetic sanitizers arise the essential oils, whose antimicrobial action mechanism is attributed, many times, to their majority compounds. Regarding these aspects, this study aimed to evaluate the potential application of carvacrol and 1,8-cineole against some strains of minimally processed vegetables contaminant bacteria (Listeria monocytogenes ATCC 7644, Aeromonas hydrophila INCQS 7966 and Pseudomonas fluorescens ATCC 11253), in mixed culture, by determining the values of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), the index of Fractional Inhibitory Concentration (FIC), as well as by assessing the efficacy of the application of these compounds in inhibiting the growth and survival of the mixed bacterial inoculum in vegetable broth and in leafy vegetables. Moreover, it was performed the assessment of possible damage caused by the tested compounds in the morphology of the bacterial cells by the analysis of confocal microscopy and scanning electronic microscopy. MIC values of carvacrol and 1,8-cineole ranged from 1.25 e 40μL/mL, respectively. The FIC index against the mixed bacterial inoculum was 0.25, suggesting a synergic interaction between the tested compounds. The application of the compounds alone or combined in sub-inhibitory concentrations in vegetable broth caused a significant decrease (p <0.05) in counts (CFU/mL) of the tested bacteria over 24 h. The exposure of vegetables to the compounds for only 5 min also caused a significant reduction (p < 0.05) in counts of the tested bacteria. The observations of bacterial cell morphology suggest that the compounds carvacrol and 1,8-cineole alone or combined in sub-inhibitory concentrations, cause damage to the cell viability, and change the permeability of the cytoplasmic membrane and the cell surface, with the appearance of roughness appearance and like-vesicles structures. These results show that carvacrol and 1,8-cineole possess strong inhibitory effect of the growth and survival of bacteria associated with minimally processed vegetables when tested in mixed culture. Still, these data confirm that constituents of essential oils, with different molecular structures, when applied in combination can replace traditional synthetic sanitizing used in minimally processed vegetables allowing reaching the balance between the demand for microbiological safety and sensory acceptability of these products. / A demanda por alimentos frescos, de baixo teor calórico, elevados valores nutricionais e de fácil preparo, tem elevado o consumo de hortaliças minimamente processadas. Entretanto, devido a sua intensa manipulação estes produtos têm sido considerados um potencial problema de segurança microbiológica, envolvendo principalmente bactérias psicrotróficas patogênicas e deteriorantes. A sanitização é considerada uma etapa crítica do processamento deste de hortaliças minimamente processadas, embora alguns dos sanitizantes sintéticos permitidos para uso em vegetais sejam citados como responsáveis por efeitos indesejáveis para o consumidor. Neste sentido, como alternativa aos sanitizantes sintéticos, surgem os óleos essenciais, cujo potencial antimicrobiano é atribuído, muitas vezes, aos seus compostos majoritários. Diante deste contexto, este estudo objetivou avaliar o potencial da aplicação dos constituintes carvacrol e 1,8-cineol na inibição de cepas de bactérias contaminantes de vegetais minimamente processados (Listeria monocytogenes ATCC 7644, Aeromonas hydrophila ATCC 7966 e Pseudomonas fluorescens ATCC 11253), em inóculo misto, através da determinação dos valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM), do índice de Concentração Inibitória Fracionada (CIF), bem como da influência da aplicação desses compostos na inibição do crescimento e sobrevivência do inóculo misto bacteriano em caldo vegetal e em vegetais folhosos. Além disso, foi realizada a avaliação dos possíveis danos causados pelos compostos testados à morfologia das células bacterianas através de análises de microscopia confocal e microscopia eletrônica de varredura. Os valores de CIM do carvacrol e do 1,8-cineol foram 1,25 e 40 μL/mL, respectivamente. O índice de CIF frente ao inóculo bacteriano misto foi 0,25, sugerindo uma interação sinérgica entre os compostos testados. A aplicação dos compostos isolados ou combinados em concentrações sub-inibitórias em caldo vegetal causou uma diminuição significativa (p < 0,05) na contagem das bactérias ensaiadas (UFC/mL) ao longo de 24 h. A exposição das hortaliças aos constituintes por apenas 5 min também causou uma redução significativa (p < 0,05) nas contagens dos micro-organismos testados. As observações morfológicas das células bacterianas sugerem ainda que os compostos carvacrol e 1,8-cineol, isolados ou combinados em concentrações sub-inibitórias, ocasionam danos à viabilidade celular, bem como alteração da permeabilidade da membrana citoplasmática e da superfície celular, com o aparecimento de rugosidades e estruturas semelhantes a vesículas. Estes resultados mostram que carvacrol e 1,8-cineol possuem considerável poder de inibição do crescimento e sobrevivência de bactérias contaminantes de hortaliças minimamente processadas, quando ensaiadas em inóculo misto. Ainda, confirmam que constituintes de óleos essenciais, com diferentes estruturas moleculares, quando aplicados em combinação podem substituir sanitizantes sintéticos clássicos utilizados em vegetais, possibilitando o alcance do equilíbrio entre a demanda pela segurança microbiológica e a aceitabilidade sensorial destes produtos.

A vida moderna tem gerado mudanças importantes nos hábitos alimentares em todo o mundo e observa-se um aumento da demanda por alimentos prontos para o consumo, tais como frutas e hortaliças minimamente processadas. As condições de embalagem e armazenamento destes produtos podem favorecer a multiplicação de bactérias psicrotróficas, destacando-se o patógeno Listeria monocytogenes. Para estudos de avaliação de riscos microbiológicos relativos a L. monocytogenes, dados quantitativos são fundamentais, mas, os métodos para enumeração disponíveis atualmente são trabalhosos e morosos. Há grande interesse no desenvolvimento de métodos rápidos para a determinação das populações de L. monocytogenes, o que pode reduzir significativamente o tempo de análise. Neste trabalho, foram analisadas 162 amostras de hortaliças minimamente processadas adquiridas no comércio varejista de Ribeirão Preto/SP, no período de setembro de 2007 a agosto de 2008. Foram realizados ensaios convencionais para enumeração de coliformes totais e termotolerantes, Escherichia coli e bactérias aeróbias psicrotróficas. Foi realizada a detecção de Listeria sp. por imunoensaio (Oxoid Listeria Rapid Test) e de Salmonella por método convencional. Alíquotas congeladas de amostras positivas para L. monocytogenes e Salmonella sp. foram também avaliadas quantitativamente empregando-se métodos convencionais. Para quantificação de L. monocytogenes foi utilizado o método da Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) em tempo real, com primers de DNA baseados em 16S rRNA. Para a comparação do método de PCR em tempo real e método convencional de cultivo, foram inoculadas seis amostras de hortaliças minimamente processadas (alface, cheiro-verde, couve, almeirão, repolho e acelga) com três níveis de inoculação. Dentre as 162 amostras de hortaliças analisadas, L. monocytogenes foi detectada em uma amostra de couve e uma de cheiro-verde, com populações de 1,5 x 103 e 0,43 NMP/g, respectivamente. Salmonella sp. foi isolada de duas amostras de almeirão, com populações de 0,09 e 4,6 NMP/g. Contaminação por coliformes totais foi detectada em 132 (81,5%) amostras e por coliformes termotolerantes em 107 (66%) amostras. Escherichia coli foi confirmada em 86 (53,1%) amostras, enquanto que 158 (96,7%) amostras apresentaram população de bactérias psicrotróficas maior que 5 log UFC/g. Os resultados obtidos entre os dois métodos desenvolvidos apresentaram pouca variação e todos os resultados foram concordantes considerando-se o intervalo de confiança de 95% da técnica do NMP (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001). A PCR em tempo real foi otimizada com a preparação comercial ABSOLUTETM QPCR SYBR® Green Mix (ABgene, Reino Unido) e os primers utilizados mostraram ser específicos para L. monocytogenes. As populações de microrganismos encontradas nestes alimentos indicaram a baixa qualidade microbiológica e evidenciaram a importância da implantação de programas para garantia da inocuidade de alimentos na cadeia produtiva das hortaliças minimamente processadas. A PCR em tempo real mostrou ser de fácil execução e diminuiu o tempo de obtenção de resultados para pouco mais que 48 horas em comparação com o tempo gasto (7 dias) quando as hortaliças foram analisadas por meio do método convencional de cultivo. / Modern lifestyles have deeply changed eating habits worldwide, with an increasing demand for ready-to-eat foods, including minimally processed fruits and leafy greens. Packaging and storage conditions of these products may favor the growth of psychrotrophic bacteria, such as the pathogen Listeria monocytogenes. For microbiological risk assessment, it is crucial to generate quantitative data on foodborne pathogens, but the enumeration methods currently available are labor and time consuming. There is great interest in the development of reliable and fast methods for enumeration of L. monocytogenes, in order to shorten the time needed to obtain quantitative results. In this study 162, samples of leafy vegetables minimally processed were acquired at retail market in Ribeirão Preto from September, 2007 to August 2008 and they were analysed by conventional enumerating methods for total and thermophilic coliforms, Escherichia coli and psychrotrophic aerobic bacteria. Presence or absence of Listeria spp. was evaluated by immunoassay (Oxoid Listeria Rapid test) and detection of Salmonella was performed by conventional methods. Frozen aliquots of Salmonella spp. and L. monocytogenes positive samples were quantitatively evaluated by conventional methods and L. monocytogenes was also enumerated by real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) with DNA primers based on 16S rRNA. Real-time PCR method was applied to analyze six artificially contaminated vegetables and the results obtained with this methodology were similar to the ones obtained with conventional most probably number (MPN) technique with a confidence interval of 95% (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001). Of the 162 samples analyzed, L. monocytogenes was detected in one sample of collard green and in one mixed bunch of parsley plus spring onion (1.5x103 and 0.43 MPN/g, respectively). Salmonella sp was detected in two samples of common chicory with populations of 0.09 and 4.6 MPN/g. One hundred and thirty two samples (81.5%) showed contamination by total coliforms and 107 (66%) by thermophilics coliforms. Escherichia coli was confirmed in 86 (53.1%) samples while 156 (96.7%) showed populations of psychrotrophic bacteria above of 5 log CFU/g. PCR was optimized with a commercial preparation ABSOLUTE TM QPCR SYBRÒ Green Mix (ABgene, UK) and the primers utilized were specific for L. monocytogenes. These results showed the low microbiologic quality of minimally processed vegetables samples studied and indicate an urge for implementation of quality programs from producer to processors of these ready-to-eat foods. Realtime In comparison with the conventional culture method, real-time PCR was more easily performed and the time required to obtain the results was reduced to ca. 48 hours, in comparison with 7 days for conventional method.