Les canaux TRPC6 sont des canaux cationiques non sélectifs perméables au calcium et au sodium. In vitro, ils laissent passer du manganèse, du baryum ou du fer. Ces canaux peuvent être activés par des analogues du diacylglycérol (SAG ou OAG) et par l'hyperforine (un antidépresseur d'origine végétal). Des expériences de dosages par ICP-OES, d'imagerie synchrotron et d'imagerie de fluorescence du FluoZin-3 ont montré que les cellules HEK surexprimant TRPC6 sont enrichies en zinc. Ces cellules sont plus sensibles à un stress oxydant et produisent plus d'espèces réactives de l'oxygène que les cellules HEK non transfectées. Dans les cellules HEK exprimant TRPC6, l'entrée de zinc en réponse au SAG est plus importante que celle observée dans les cellules HEK ou HEK-TRPC3. Les canaux TRPC6 sont exprimés dans les neurones corticaux. En réalisant des expériences d'imagerie de fluorescence et d'électrophysiologie, nous avons observé que l'activation de ces canaux par le SAG ou par l'hyperforine permettait l'entrée de zinc dans les neurones. La taille du pool de zinc fixé sur des protéines à groupement thiols est augmentée après un influx de zinc via TRPC6. Ceux-ci forment donc une voie d'entrée pour ce métal dans les neurones corticaux embryonnaires. Dans certains types cellulaires, les canaux TRPC6 participent à l'entrée calcique déclenchée en réponse à la déplétion du stock calcique du réticulum (canaux SOC). Cependant, dans les neurones corticaux, les voies SOC et activées par l'hyperforine possèdent des propriétés pharmacologiques distinctes suggérant que les canaux TRPC6 ne participent pas à la voie SOC. L'homéostasie des métaux dans les neurones est perturbée par l'hyperforine. Cet antidépresseur diminue la taille des pools de calcium et de zinc des mitochondries à la fois lors de traitements aigus et chroniques. Une relocalisation du zinc est observée dans les neurones traités de façon chronique à l'hyperforine ainsi qu'une augmentation de l'expression des métallothionéines à la fois in vitro et in vivo. Chez la souris, la quantité de soufre du cerveau est augmentée lors un traitement à l'hyperforine. Celle-ci serait donc un antidépresseur qui module les capacités de stockage du zinc en augmentant le nombre de groupements thiols cellulaires. L'hyperforine est présente dans les extraits de millepertuis. Ceux-ci ont diverses cibles pharmacologiques, agissant notamment sur la voie de signalisation du BDNF. Nos expériences montrent que, lors d'un traitement chronique de souris adultes, l'hyperforine augmente l'expression de TrkB et P-TrkB dans le cortex. In vitro, dans les neurones corticaux, TrkB, CREB et P-CREB sont surexprimés après un traitement de trois jours à l'hyperforine. L'inhibition de la PKA ou le blocage des canaux TRPC6 par le SKF-96365 empêche l'effet de l'hyperforine. Par ailleurs, la chélation du calcium par le BAPTA-AM supprime partiellement l'effet de l'hyperforine. Un traitement chronique avec cet extrait végétal semble agir sur une voie dépendante de la PKA et du calcium pour réguler la phosphorylation de CREB et l'expression de TrkB. Nos expériences montrent que l'effet de l'hyperforine sur les acteurs de la voie du BDNF n'est pas présent au niveau de l'hippocampe où l'expression de TrkB n'est pas affectée. De plus, ces traitements n'influencent pas la neurogenèse adulte chez la souris. L'hyperforine seule n'explique donc pas les effets complexes des extraits de millepertuis sur les activités neuronales.

La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) est caractérisée par l’accumulation dans le sang de lymphocytes B/CD5+ qui sont déficients pour leur programme de mort apoptotique. Malgré les progrès thérapeutiques récents, la LLC est une maladie toujours incurable. La stratégie de rétablissement des processus apoptotiques semble pertinente pour améliorer les traitements des patients, et cette stratégie nécessite l’identification de cibles spécifiques. Dans ce but, nous avons développé une recherche du mécanisme d’action de l’hyperforine, un phloroglucinol purifié à partir de la plante Millepertuis, qui est un inducteur d’apoptose des cellules de LLC ex vivo par la voie mitochondriale dépendante des caspases. Les résultats montrent que le traitement des cellules primaires de LLC régule positivement Noxa, une protéine de la famille Bcl-2 du type « BH3-only » qui est un ligand antagoniste spécifique de Mcl-1, la protéine de survie majeure pour le défaut d’apoptose dans les LLC. Nous montrons que Noxa interagit effectivement avec Mcl-1, ce qui entraine la dissociation du complexe que Mcl-1 forme avec Bak, et l’activation de cette protéine responsable de la libération par la mitochondrie des facteurs d’activation des caspases. La régulation positive de Noxa ne résulte apparemment pas d’une activation transcriptionnelle mais plutôt d’une régulation au niveau protéique comme le suggère la capacité de l’hyperforine à inhiber l’activité protéolytique du protéasome dans les cellules de LLC. Par ailleurs, l’apoptose induite par l’hyperforine est réduite en partie par l’extinction de Noxa avec des ARN interférents. Nos résultats indiquent donc que la régulation positive de Noxa est un des mécanismes qui permet à l’hyperforine de déclencher l’apoptose des cellules de LLC. Ce mécanisme semble être commun à d’autres composés d’origine végétale, comme nous l’avons observé avec l’extrait M2Yn dans la seconde partie de notre travail qui a permis de mettre en évidence que cet extrait de plantes d’Asie centrale est capable lui aussi d’induire l’apoptose des cellules de LLC par la voie mitochondriale dépendante des caspases. Enfin, nous avons contribué à la mise en évidence des propriétés pro-apoptotiques de l’hyperforine dans un autre modèle de leucémie, la leucémie myéloïde aiguë, grâce en partie à la régulation positive de Noxa ainsi qu’à l’inhibition de l’activité kinasique de Akt-1.En conclusion, nos travaux de thèse décrivent des nouvelles étapes dans le mécanisme d’action de l’hyperforine et permettent d’établir que la protéine « BH3-only » Noxa est une cible majeure pour la stratégie thérapeutique du rétablissement d’apoptose dans les LLC, ce qui devrait susciter le développement de nouveaux agents capables d’imiter spécifiquement l’action de Noxa. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by blood accumulation of CD5+/B lymphocytes which are deficient in their apoptotic program. Despite recent therapeutic advances, CLL remains an incurable disease. Treatment strategy based on the re-establishment of apoptotic processes has retained much attention, and such a strategy requires the identification of specific targets. To this aim, we have investigated the mechanism of action of hyperforin, a phloroglucinol purified from St John’s wort, capable of inducing apoptosis of CLL cells ex vivo via the caspase-dependent mitochondrial pathway. Our results show that treatment of CLL patients’ cells upregulates the BH3-only protein Noxa that is a specific antagonist ligand of Mcl-1, the crucial prosurvival protein for apoptosis deficiency in CLL. We find that hyperforin provokes both the interaction of Noxa with Mcl-1 and the dissociation of Mcl-1/Bak complex, leading to Bak activation responsible for the release of apoptogenic factors from mitochondria. Noxa upregulation does not seem to result from transcription activation but rather from a regulation at the protein level, as suggested by the ability of hyperforin to inhibit proteasome activity in CLL cells. Using siRNA, Noxa silencing partially reduces hyperforin-induced apoptosis. Our data indicate that Noxa upregulation is one of the mechanisms through which hyperforin triggers CLL cell apoptosis. This mechanism appears to be shared with other plant-derived compounds, as observed with M2Yn, an extract from central Asia plants, that we show here to be an inducer of apoptosis in CLL cells by activating the caspase-dependent mitochondrial pathway. Finally, we have participated in highlighting the proapoptotic properties of hyperforin in another leukemia model, acute myeloid leukemia, via in part Noxa upregulation and Akt1 kinase activity inhibition.In conclusion, our data describe new steps in the mechanism of action of hyperforin and favor that the BH3-only protein Noxa is a major target for the therapeutic strategy based on apoptosis induction in CLL. Thus, this thesis should prompt the development of new BH3 mimetics specific for Noxa.

Les canaux TRPC6 sont des canaux cationiques non sélectifs perméables au calcium et au sodium. In vitro, ils laissent passer du manganèse, du baryum ou du fer. Ces canaux peuvent être activés par des analogues du diacylglycérol (SAG ou OAG) et par l'hyperforine (un antidépresseur d'origine végétal). Des expériences de dosages par ICP-OES, d'imagerie synchrotron et d'imagerie de fluorescence du FluoZin-3 ont montré que les cellules HEK surexprimant TRPC6 sont enrichies en zinc. Ces cellules sont plus sensibles à un stress oxydant et produisent plus d'espèces réactives de l'oxygène que les cellules HEK non transfectées. Dans les cellules HEK exprimant TRPC6, l'entrée de zinc en réponse au SAG est plus importante que celle observée dans les cellules HEK ou HEK-TRPC3. Les canaux TRPC6 sont exprimés dans les neurones corticaux. En réalisant des expériences d'imagerie de fluorescence et d'électrophysiologie, nous avons observé que l'activation de ces canaux par le SAG ou par l'hyperforine permettait l'entrée de zinc dans les neurones. La taille du pool de zinc fixé sur des protéines à groupement thiols est augmentée après un influx de zinc via TRPC6. Ceux-ci forment donc une voie d'entrée pour ce métal dans les neurones corticaux embryonnaires. Dans certains types cellulaires, les canaux TRPC6 participent à l'entrée calcique déclenchée en réponse à la déplétion du stock calcique du réticulum (canaux SOC). Cependant, dans les neurones corticaux, les voies SOC et activées par l'hyperforine possèdent des propriétés pharmacologiques distinctes suggérant que les canaux TRPC6 ne participent pas à la voie SOC. L'homéostasie des métaux dans les neurones est perturbée par l'hyperforine. Cet antidépresseur diminue la taille des pools de calcium et de zinc des mitochondries à la fois lors de traitements aigus et chroniques. Une relocalisation du zinc est observée dans les neurones traités de façon chronique à l'hyperforine ainsi qu'une augmentation de l'expression des métallothionéines à la fois in vitro et in vivo. Chez la souris, la quantité de soufre du cerveau est augmentée lors un traitement à l'hyperforine. Celle-ci serait donc un antidépresseur qui module les capacités de stockage du zinc en augmentant le nombre de groupements thiols cellulaires. L'hyperforine est présente dans les extraits de millepertuis. Ceux-ci ont diverses cibles pharmacologiques, agissant notamment sur la voie de signalisation du BDNF. Nos expériences montrent que, lors d'un traitement chronique de souris adultes, l'hyperforine augmente l'expression de TrkB et P-TrkB dans le cortex. In vitro, dans les neurones corticaux, TrkB, CREB et P-CREB sont surexprimés après un traitement de trois jours à l'hyperforine. L'inhibition de la PKA ou le blocage des canaux TRPC6 par le SKF-96365 empêche l'effet de l'hyperforine. Par ailleurs, la chélation du calcium par le BAPTA-AM supprime partiellement l'effet de l'hyperforine. Un traitement chronique avec cet extrait végétal semble agir sur une voie dépendante de la PKA et du calcium pour réguler la phosphorylation de CREB et l'expression de TrkB. Nos expériences montrent que l'effet de l'hyperforine sur les acteurs de la voie du BDNF n'est pas présent au niveau de l'hippocampe où l'expression de TrkB n'est pas affectée. De plus, ces traitements n'influencent pas la neurogenèse adulte chez la souris. L'hyperforine seule n'explique donc pas les effets complexes des extraits de millepertuis sur les activités neuronales. / TRPC6 channels are non selective plasma membrane cation channels permeable to calcium and sodium. In addition, in vitro data showed that they can transport manganese, barium or iron. These channels can be activated by diacylglycerol (DAG) or DAG analogues like SAG or OAG. They are also sensitive to hyperforin (a plant extract exhibiting antidepressant properties). ICP-OES experiments, X-ray synchrotron imaging and live-cell FluoZin-3 imaging show that the over expression of TRPC6 in HEK cells increases their zinc and sulfur content. This enrichment is associated with an increased sensitivity of transfected cells to oxidative stress by enhancing the production of reactive oxygen species in response to oxidative insults. The entry of zinc permitted by SAG or hyperforin is more pronounced in cells over-expressing TRPC6 when compared to HEK or HEK-TRPC3 cells. TRPC6 channels are expressed in cortical neurons. Electrophysiological recordings and experiments with the fluorescent zinc probe FluoZin-3 demonstrated that TRPC6 channels are permeable to zinc in neurons. The size of the 2-2 'dithiodipyridine (DTDP) sensitive pool of zinc is augmented after the entry of this metal through TRPC6. These channels form a zinc entry pathway in cortical neurons. In some cell types, TRPC6 are involved in the mechanism of calcium entry in response to the depletion of intracellular pools of calcium. This calcium entry occurs via store-operated Ca channels (SOC). In our experiments, we have shown that in cortical neurons, hyperforin-sensitive channels and SOC are distinct since they exhibit distinct pharmacological properties. Hyperforin influences the homeostasis of metals in cortical neurons. We found that acute or chronic applications of this antidepressant decreases the size of the mitochondrial pools of calcium and zinc. In addition, in vitro and in vivo data show that a chronic treatment causes a cellular redistribution of zinc, associated with an increased expression of metallothioneins. Furthermore, brains of mice are enriched in sulfur. It seems that this antidepressant influences the zinc storage capacities of brain cells by altering the cellular expression of thiol-containing molecules. Hyperforin is an extract of the medicinal plant St John Worth. This latter one possesses complex properties, acting notably on the BDNF pathway. A chronic treatment with hyperforin increases the expression of TrkB and P-TrkB in the cortex of mice. In cortical neurons, TrkB, CREB and P-CREB are up regulated by a chronic treatment with hyperforin. This process is sensitive to inhibitors of PKA, TRPC6 channels and to the chelator of calcium BAPTA-AM. On the other hand, a chronic treatment with hyperforin does not influence the BDNF pathway in the hippocampus and also does not modulate the adult neurogenesis. Thus, the brain effects of hyperforin are distinct from those induced by the whole St John Worth extract.

Les canaux TRPC6 sont des canaux cationiques non sélectifs qui peuvent être activés par le diacylglycérol (DAG). Ils sont présents dans de nombreux tissus et types cellulaires, notamment dans le cortex de souris embryonnaire (à E13). Des expériences d'imagerie calcique réalisées sur des neurones de cortex de souris en culture ont révélé la présence de canaux cationiques activés par le DAG. Ils sont perméables aux ions Ca2+, Na+, Ba2+ et Mn2+. L'entrée de Ca2+ via ces canaux est indépendante de la protéine kinase C et elle est bloquée par le SKF-96365 et le Gd3+. Par ailleurs, l'acide flufénamique augmente l'amplitude des réponses calciques induites par le DAG. Des expériences d'électrophysiologie réalisées avec la technique du patch-clamp en configuration cellule entière ont montré que l'hyperforine, un activateur des canaux TRPC6, donne naissance à un courant cationique non sélectif, confirmant ainsi l'existence de canaux de type TRPC6 dans les neurones corticaux. Des analyses quantitatives en spectrométrie d'émission atomique à plasma couplé inductif, en spectrométrie d'absorption atomique et en fluorescence X avec la nanosonde synchrotron (µ-SXRF) révèlent que la surexpression de TRPC6 dans les cellules HEK-293 s'accompagne d'une augmentation du contenu intracellulaire en zinc, en soufre et en manganèse. Les résultats obtenus avec des sondes fluorescentes sensibles au zinc et au fer indiquent que les canaux TRPC6 peuvent transporter ces cations. Par ailleurs, les expériences en µ-SXRF montrent que l'activation des canaux TRPC6 en présence de fer induit une accumulation de ce métal dans les cellules HEK et les neurones. Au cours de notre étude, nous avons également mis en évidence l'action de deux agents (l'acide flufénamique et l'hyperforine), couramment utilisés pour modifier l'activité des canaux TRPC6, sur la physiologie mitochondriale et l'homéostasie des métaux. En effet, l'acide flufénamique et l'hyperforine non seulement modifient le fonctionnement des canaux TRPC6 mais ils exercent aussi une action de type découplante sur les mitochondries, provoquant une libération de Ca2+ et de Zn2+ à partir de ces organelles.