Ulm, Univ., Diss., 2009.

Um dos maiores desafios na área médica dermatológica tem sido o tratamento da acne. Esta dermatose afeta 80 a 90% dos adolescentes. A busca por tratamentos alternativos tornou-se importante devido à resistência bacteriana de Propionibacterium acnes (P. acnes) aos antibióticos comumente utilizados contra este agente etiológico e pelos efeitos colaterais produzidos por estas drogas. Visando minimizar estes efeitos colaterais e proporcionar a eliminação de P. acnes, uma nova modalidade de tratamento vem sendo pesquisada, a terapia fotodinâmica (TFD). TFD já está bem estabelecida no combate a muitos tipos de câncer e tem se mostrado promissora na área estética. Os protocolos de TFD para tratar a acne tem como base a síntese endógena de hematoporfirina e compostos relacionados induzida por ácido 5-aminolevulínico (ALA), um tratamento com tempo de incubação grande, dolorido e usando a luz azul. O objetivo deste estudo foi de um modo geral avaliar a eficácia da inativação fotodinâmica sobre o microrganismo P. acnes utilizando como FS a hipericina e irradiado com um LED amarelo (590 nm). A inativação do microorganismo foi conseguida mesmo com uma concentração baixa de hipericina (menos de 1 \'mü\'g/mL) e foi caracterizada pelo curto tempo de bioacumulação estacionária (cerca de 2 min 30 s). A eficiência fotodinâmica de hipericina foi comprovada nos experimentos, e também pode-se observar que o uso do LED amarelo a partir de doses pequenas (4,55 ± 0,08 J \'CM POT.-2\') sendo capaz de reduzir 63% das células viáveis utilizando 10 \'mü\'g/mL de hipericina. / One of the prominent challenges in medical dermatology has been the treatment of acne. The acne affects 80 to 90% of teenagers. The search for alternative treatment has become important due to bacterial resistance of P. acnes to usually applied antibiotics against this etiologic agent and the side effects produced by these drugs. In order to overcome these limitations to inactivated the P. acnes, the photodynamic based protocols has been studied. Already, well established named photodynamic therapy has been used against many cancers and the use of light has shown promise in the esthetic area, the photodynamic protocols has been used to treat acne based on endogenous synthesis of hematoporphyrin and related compounds induced by -aminolevulinic acid, a long term treatment and using the blue light. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of photodynamic inactivation of the P. acnes using hypericin, irradiated by a yellow LED (590 nm). The microorganism inactivation was achieved even at low concentration of hypericin (less than 1 \'mü\'g/mL), and was characterized by the short time bioaccumulation stationary state (around 2.5 minutes). In order to guarantee the reproducibility typically the incubation time was 10 minutes. The photodynamic efficiency was evaluated to be 4.55 ± 0.08 J \'CM POT.-2\' able to reduce 63% of the viable cells using 10 \'mü\'g/mL of hypericin. These results allow concluding that the hypericin is an effective FS to inactivate P. acnes.

Um dos maiores desafios na área médica dermatológica tem sido o tratamento da acne. Esta dermatose afeta 80 a 90% dos adolescentes. A busca por tratamentos alternativos tornou-se importante devido à resistência bacteriana de Propionibacterium acnes (P. acnes) aos antibióticos comumente utilizados contra este agente etiológico e pelos efeitos colaterais produzidos por estas drogas. Visando minimizar estes efeitos colaterais e proporcionar a eliminação de P. acnes, uma nova modalidade de tratamento vem sendo pesquisada, a terapia fotodinâmica (TFD). TFD já está bem estabelecida no combate a muitos tipos de câncer e tem se mostrado promissora na área estética. Os protocolos de TFD para tratar a acne tem como base a síntese endógena de hematoporfirina e compostos relacionados induzida por ácido 5-aminolevulínico (ALA), um tratamento com tempo de incubação grande, dolorido e usando a luz azul. O objetivo deste estudo foi de um modo geral avaliar a eficácia da inativação fotodinâmica sobre o microrganismo P. acnes utilizando como FS a hipericina e irradiado com um LED amarelo (590 nm). A inativação do microorganismo foi conseguida mesmo com uma concentração baixa de hipericina (menos de 1 \'mü\'g/mL) e foi caracterizada pelo curto tempo de bioacumulação estacionária (cerca de 2 min 30 s). A eficiência fotodinâmica de hipericina foi comprovada nos experimentos, e também pode-se observar que o uso do LED amarelo a partir de doses pequenas (4,55 ± 0,08 J \'CM POT.-2\') sendo capaz de reduzir 63% das células viáveis utilizando 10 \'mü\'g/mL de hipericina. / One of the prominent challenges in medical dermatology has been the treatment of acne. The acne affects 80 to 90% of teenagers. The search for alternative treatment has become important due to bacterial resistance of P. acnes to usually applied antibiotics against this etiologic agent and the side effects produced by these drugs. In order to overcome these limitations to inactivated the P. acnes, the photodynamic based protocols has been studied. Already, well established named photodynamic therapy has been used against many cancers and the use of light has shown promise in the esthetic area, the photodynamic protocols has been used to treat acne based on endogenous synthesis of hematoporphyrin and related compounds induced by -aminolevulinic acid, a long term treatment and using the blue light. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of photodynamic inactivation of the P. acnes using hypericin, irradiated by a yellow LED (590 nm). The microorganism inactivation was achieved even at low concentration of hypericin (less than 1 \'mü\'g/mL), and was characterized by the short time bioaccumulation stationary state (around 2.5 minutes). In order to guarantee the reproducibility typically the incubation time was 10 minutes. The photodynamic efficiency was evaluated to be 4.55 ± 0.08 J \'CM POT.-2\' able to reduce 63% of the viable cells using 10 \'mü\'g/mL of hypericin. These results allow concluding that the hypericin is an effective FS to inactivate P. acnes.

Yes / Photodynamic Therapy (PDT) is an emerging method to treat colorectal cancers (CRC). Hypericin (HYP) is an effective mediator of PDT and the ABCG2 inhibitor, Febuxostat (FBX) could augment PDT. HT29 and HEK293 cells showed light dependant cytotoxic response to PDT in both 2D and 3D cell models. FBX co-treatment was not found to improve PDT cytotoxicity. Next, ABCG2 protein expression was observed in HT29 but not in HEK293 cells. However, ABCG2 gene expression analysis did not support protein expression results as ABCG2 gene expression results were found to be higher in HEK293 cells. Although HYP treatment was found to significantly reduce ABCG2 gene expression levels in both cell lines, FBX treatment partially restored ABCG2 gene expression. Our findings indicate that FBX co-treatment may not be suitable for augmenting HYP-mediated PDT in CRC but could potentially be useful for other applications. / Royal Society International Exchanges Award (IEC\R3\203014) - UKRI EPSRC Research Programme Grant (753910/B19R13527) - Bowel Cancer UK/RCS Eng Colorectal Research Chair Award (18SC0001) / The full-text of this article will be released for public view at the end of the publisher embargo on 16 Apr 2025.

O câncer é uma doença que causa grande número de mortes a cada ano e os tratamentos convencionais normalmente ocasionam efeitos colaterais indesejados além do que nem sempre são eficazes. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade alternativa de tratamento, que se baseia na combinação de um fotossensibilizador (FS), luz e oxigênio, e tem mostrado resultados promissores em vários tipos de câncer. No entanto, existem alguns desafios para o desenvolvimento de fotossensibilizadores que cumprem os requisitos para uso clínico. Os compostos, hipericina (HY) e curcumina (CUR), estão presentes em plantas medicinais, possuem altos rendimentos quânticos e podem ser usados como FS em TFD. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência fotodinâmica da HY e CUR através de suas propriedades físico-químicas e biológicas, tais como coeficiente de absortividade molar (&#949), coeficiente de partição (Log P), fotodegradação, atividade fotodinâmica de geração de oxigênio singlete e a resposta biológica usando ensaios citotóxicos e microscopia de fluorescência para avaliar o tipo de morte celular. A HY apresenta propriedade anfifílica, enquanto a CUR, hidrofóbica. A HY é mais fotoestável, enquanto a CUR fotodegrada facilmente sob irradiação em 455 nm levando à formação de fotoprodutos que possuem menor citotoxicidade que a CUR íntegra, o que sugere que a eficiência da TFD diminui conforme este corante é irradiado. Além disso, a alta eficiência de geração de oxigênio singlete de HY corrobora com a sua fototoxicidade mais elevada em comparação com a CUR. A concentração inibitória média (IC50) da HY em células de carcinoma epidermóide de laringe humana (HEp-2) é 256 vezes menor para CUR sob a mesma dose de luz. A investigação do tipo de morte celular foi realizada por microscopia de fluorescência após TFD utilizando os FSs em concentração equivalente a duas vezes o valor de IC50. HY-TFD promoveu cerca de 1,5 vezes mais apoptose nas células HEp-2 do que a CUR. Além disso, a acumulação intracelular dos FSs analisada por Microscopia Confocal de fluorescência mostrou que a CUR apresenta uma velocidade de acumulação menor que a HY. Em conclusão, os resultados obtidos sugerem que a HY é um FS mais eficiente que a CUR para TFD, porém como a CUR e a HY apresentam baixa toxicidade na ausência de luz, são compostos seguros para serem utilizados clinicamente. / Cancer is a disease that causes several deaths each year and the treatment modalities are not quite selective and usually bring about intensive side effect besides not very effective sometimes. Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment, which is based on the combination of a photosensitive molecule, light activation and oxygen. Many studies have shown promising results with PDT in diverse types of cancer. However, there are some challenges for the development of photosensitizers to comply the requisites for clinical use. The compounds hypericin (HY) and curcumin (CUR), are present in medicinal plants, have high fluorescence quantum yields and can be used as PS in PDT. In this study, we compare HY and CUR through the study of theirs physic-chemical and biological properties, as well as photo degradation, determination of the partition coefficient (Log P) and the molar absorptivity coefficient (&#949), the photodynamic activity as an indirect estimation of singlet oxygen generation potential and the biological response using cytotoxicity assays as well as fluorescence microscopy. The results suggested that HY presents amphiphilic property while CUR is hydrophobic. HY is more photostable than CUR, which is easily photodegradated at 455 nm leading to the formation of photoproducts. The cytotoxicity of these photoproducts was investigated being lower than that of CUR, which suggests that the efficiency of CUR-PDT decreases while this dye is irradiated. Furthermore, the elevated oxygen singlet generation of HY corroborates with its higher phototoxicity compared to CUR. The median inhibitory concentration (IC50) of HY in human epidermoid cancer cells (HEp-2) is 256 times lower than the IC50 for CUR at equal light irradiance. The investigation on the type of cell death was carried out by fluorescence microscopy after PDT using the photosensitizers at concentration equivalent to 2x IC50 values. HY-PDT induced around more 1.5 times apoptosis cell death than CUR-PDT. Besides, the intracellular accumulation of PS analyzed by fluorescence Confocal Microscopy has demonstrated that the accumulation of CUR is slower than HY. In conclusion, our findings suggest that HY is a more efficient PS than CUR for PDT, however, as CUR and HY present low toxicity in the absence of light, they are safe compounds to be clinically used.

O câncer é uma doença que causa grande número de mortes a cada ano e os tratamentos convencionais normalmente ocasionam efeitos colaterais indesejados além do que nem sempre são eficazes. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade alternativa de tratamento, que se baseia na combinação de um fotossensibilizador (FS), luz e oxigênio, e tem mostrado resultados promissores em vários tipos de câncer. No entanto, existem alguns desafios para o desenvolvimento de fotossensibilizadores que cumprem os requisitos para uso clínico. Os compostos, hipericina (HY) e curcumina (CUR), estão presentes em plantas medicinais, possuem altos rendimentos quânticos e podem ser usados como FS em TFD. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência fotodinâmica da HY e CUR através de suas propriedades físico-químicas e biológicas, tais como coeficiente de absortividade molar (&#949), coeficiente de partição (Log P), fotodegradação, atividade fotodinâmica de geração de oxigênio singlete e a resposta biológica usando ensaios citotóxicos e microscopia de fluorescência para avaliar o tipo de morte celular. A HY apresenta propriedade anfifílica, enquanto a CUR, hidrofóbica. A HY é mais fotoestável, enquanto a CUR fotodegrada facilmente sob irradiação em 455 nm levando à formação de fotoprodutos que possuem menor citotoxicidade que a CUR íntegra, o que sugere que a eficiência da TFD diminui conforme este corante é irradiado. Além disso, a alta eficiência de geração de oxigênio singlete de HY corrobora com a sua fototoxicidade mais elevada em comparação com a CUR. A concentração inibitória média (IC50) da HY em células de carcinoma epidermóide de laringe humana (HEp-2) é 256 vezes menor para CUR sob a mesma dose de luz. A investigação do tipo de morte celular foi realizada por microscopia de fluorescência após TFD utilizando os FSs em concentração equivalente a duas vezes o valor de IC50. HY-TFD promoveu cerca de 1,5 vezes mais apoptose nas células HEp-2 do que a CUR. Além disso, a acumulação intracelular dos FSs analisada por Microscopia Confocal de fluorescência mostrou que a CUR apresenta uma velocidade de acumulação menor que a HY. Em conclusão, os resultados obtidos sugerem que a HY é um FS mais eficiente que a CUR para TFD, porém como a CUR e a HY apresentam baixa toxicidade na ausência de luz, são compostos seguros para serem utilizados clinicamente. / Cancer is a disease that causes several deaths each year and the treatment modalities are not quite selective and usually bring about intensive side effect besides not very effective sometimes. Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment, which is based on the combination of a photosensitive molecule, light activation and oxygen. Many studies have shown promising results with PDT in diverse types of cancer. However, there are some challenges for the development of photosensitizers to comply the requisites for clinical use. The compounds hypericin (HY) and curcumin (CUR), are present in medicinal plants, have high fluorescence quantum yields and can be used as PS in PDT. In this study, we compare HY and CUR through the study of theirs physic-chemical and biological properties, as well as photo degradation, determination of the partition coefficient (Log P) and the molar absorptivity coefficient (&#949), the photodynamic activity as an indirect estimation of singlet oxygen generation potential and the biological response using cytotoxicity assays as well as fluorescence microscopy. The results suggested that HY presents amphiphilic property while CUR is hydrophobic. HY is more photostable than CUR, which is easily photodegradated at 455 nm leading to the formation of photoproducts. The cytotoxicity of these photoproducts was investigated being lower than that of CUR, which suggests that the efficiency of CUR-PDT decreases while this dye is irradiated. Furthermore, the elevated oxygen singlet generation of HY corroborates with its higher phototoxicity compared to CUR. The median inhibitory concentration (IC50) of HY in human epidermoid cancer cells (HEp-2) is 256 times lower than the IC50 for CUR at equal light irradiance. The investigation on the type of cell death was carried out by fluorescence microscopy after PDT using the photosensitizers at concentration equivalent to 2x IC50 values. HY-PDT induced around more 1.5 times apoptosis cell death than CUR-PDT. Besides, the intracellular accumulation of PS analyzed by fluorescence Confocal Microscopy has demonstrated that the accumulation of CUR is slower than HY. In conclusion, our findings suggest that HY is a more efficient PS than CUR for PDT, however, as CUR and HY present low toxicity in the absence of light, they are safe compounds to be clinically used.

O aparecimento de uma grande variedade de microrganismos patogênicos resistentes aos antimicrobianos tem resultado no aumento do índice de doenças e mortalidade provocadas por infecções que eram facilmente tratadas no passado. Muitas vezes essa resistência está relacionada à formação de biofilme pelos microrganismos, que produzem substâncias poliméricas extracelulares (EPS) dificultando a penetração de agentes antimicrobianos. A Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) é uma alternativa promissora para combater infecções microbianas, principalmente aquelas em que apresentam biofilmes. Basicamente esse mecanismo envolve a combinação sinérgica de um fotossensibilizador (FS), oxigênio molecular e luz visível de comprimento de onda adequado para produzir espécies reativas de oxigênio (EROs) que causam oxidação dos componentes da célula levando-a à morte. Devido à natureza multifacetada e não-específica das EROs produzidos na aPDT, os microrganismos têm menos chance de desenvolver mecanismos de resistência. Apesar destas vantagens, a aPDT tem enfrentando o problema da hidrofobicidade que FSs como hipericina (Hy) e ftalocianina de zinco (FcZn) apresentam. Esta hidrofobicidade promove a agregação do FS em meio biológico, reduzindo a sua atividade fotodinâmica. Diante disso, este estudo teve o objetivo avaliar a ação fotodinâmica da Hy, FcZn e seus derivados hidrossolúveis (hipericina-glucamina - HyG, ftalocianina de zinco tetracarboxilada - FcZnTc e ftalocianina de zinco tetracarboxi-N-metilglucamina - FcZnTcG), para inativar as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli, tanto em cultura planctônica como em biofilme. Como a aPDT apresenta também a vantagem de seletividade, foi proposto que as condições para fotoinativação destas bactérias provocassem o mínimo de dano às células hospedeiras. Estudos físico-químicos dos novos FSs mostraram menor agregação dos FSs derivados em meio aquoso que seus compostos de origem, bem como um ligeiro aumento no coeficiente de atividade fotodinâmica. Além disso, a hidrofilicidade dos FSs aumentou a acumulação intracelular dos mesmos nas bactérias de estudo S. aureus e E. coli, tanto na forma de células planctônicas quanto em biofilme. Os ensaios de acumulação intracelular dos FSs determinaram os parâmetros de fotoinativação seletiva dos microrganismos, tanto em células planctônicas como em biofilme. Todos os FSs, com exceção de FcZn, foram capazes de promover a seletividade de S. aureus e E. coli na forma planctônica. Entretanto, devido a maior complexidade morfológica de E. coli, os parâmetros de fotoinativação utilizados para inibir esta bactéria foram cerca de duas vezes maiores que para inativar a mesma concentração celular de S. aureus. Dentre todos os FSs, a FcZnTcG apresentou as melhores condições de seletividade tanto para E. coli quanto para S. aureus, uma vez que inibiu aproximadamente 100% destes microrganismos e no máximo 15% de células epiteliais (Vero). A obtenção das condições de seletividade para os biofilmes bacterianos foi mais difícil, pois a acumulação dos FSs por S. aureus e E. coli foi menor, tornando-se assim necessário aumentar os parâmetros de fotoinativação, ou seja, concentração do FS, tempo de incubação e dose de luz, que consequentemente inibiram mais as células epiteliais. Apesar disso, HyG e FcZnTcG foram capazes de promover a seletividade do biofilme de S. aureus em todas as etapas de formação. Entretanto, a seletividade do biofilme de E. coli foi alcançada apenas nas etapas de adesão reversível e irreversível e somente por FcZnTcG. Isso pode ser justificado pela maior concentração de EPS sintetizado por E. coli que por S. aureus, dificultando a acumulação dos FSs nas últimas etapas do biofilme de E. coli (biofilme maduro e dispersão). Portanto, os resultados desse estudo permitem sugerir que a hidrofilicidade é uma característica importante para os FSs fotoinativarem seletivamente os microrganismos S. aureus e E. coli, mesmo na forma de biofilme. Além disso, foi observado que a ação de aPDT no EPS do biofilme bacteriano desempenha um papel fundamental para inibição tanto de S. aureus quanto de E. coli. / The appearance of a large variety of antimicrobial-resistant pathogenic microorganisms has led to increased rates of disease and mortality caused by infections that were easily treated in the past. It has become clear that the biofilm-grown cells increase the bacteria resistance to antibiotics. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is a promising alternative way to fight microbial infections, especially the biofilm ones. This technique, basically, involves the synergistic combination of a photosensitizer, molecular oxygen and visible light of an appropriate wavelength to produce highly reactive oxygen species that lead to the oxidation of several cell components and to cell inactivation. The main advantage of the technique is that, given the existence of multiple targets, there is no development of resistance. The hidrophobicity of photosensitizers (PSs) like hypericin (Hy) and zinc phthalocyanine (ZnPc), reduces their photodynamic activity once they form aggregates in biological media. For this reason, was evaluated the effectivenes of Hy, ZnPc and its water-soluble derivatives (glucamine-hypericin-HyG, zinc tetracarboxylated phthalocyanine-ZnTcPc and zinc tetracarboxy-N-metylglucamine phthalocyanine-ZnTcGPc) to photoinactivate S. aureus and E. coli with minimal damage to a model of host cells. Physicochemical studies showed that hidrophilic PSs suffer less aggregation in aqueous media, as well as present a slight increase in photodynamic activity compared to Hy and ZnPC. Furthermore, the hydrophilicity of PSs increased the PS intracellular accumulation in bacteria, either in planktonic culture or biofilms. The accumulation study allowed to determine the parameters of selective photoinactivation of microorganisms. Due the morphologic complexity of E. coli the photodynamic parameters (incubation time, PS concentration and light dose) were twice that used against S. aureus. As a consequence, some more epithelial cells were affected by the process. Despite that, only the ZnPc could not promote the selective inactivation for planktonic cells. By the other hand, HyG and FcZnTcG were able to seletively photoinactivate the biofilm of S. aureus in all its formation stages. However, the selective inactivation of E. coli biofilm was achieved only in the reversible and irreversible adhesion and just for FcZnTcG. This fact can be explained by the higher concentration of exopolysaccharide (1,9 \'mü\'g/mL) synthesized by E. coli compared with S. aureus, making difficult the accumulation of the PSs in the last stages of the E. coli biofilm formation (mature biofilm and dispersion). So, we can suggest that hidrophilicity is an important characteristic for the PSs, improving the selective photoinactivation of S. aureus and E. coli, even as biofilm. Moreover, the effectiveness of aPDT agains EPS plays a key role for inhibition of bacterial biofilms.

Orientadora: Profa Dra Patrícia Dantoni Alnis Bezerra / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência & Tecnologia - Química, 2014. / A reação quimiluminescente do sistema peróxi-oxalato (QL-PO) envolve derivados do ácido oxálico e um peróxido. Desde sua descoberta, em 1963, por Chandross, vem sendo muito estudada visando-se o entendimento de seu mecanismo e sua aplicação para diferentes fins. O processo de emissão da reação QL-PO ocorre pela excitação de um fluoróforo através de um mecanismo de transferência eletrônica a partir de um intermediário de alta energia formado na reação. Geralmente os fluoróforos e os ésteres são insolúveis em água e pouco solúveis em meios parcialmente aquosos, necessários em muitas aplicações analíticas. Assim, muitos grupos de pesquisa vêm estudando novos fluoróforos para a reação, além de buscarem formas de contornar problemas de solubilidade, estabilidade do éster e reprodutibilidade aplicando-se tensoativos e ciclodextrinas, possibilitando o trabalho em meios majoritariamente aquosos. Desta forma, neste trabalho, foi estudado o efeito da presença das ciclodextrinas naturais (CDs) sobre os sinais quimiluminescentes da reação entre oxalato de bis-(2,4,6-triclorofenila) (TCPO) e peróxido de hidrogênio (H2O2), em meio parcialmente aquoso tamponado por fosfato (pH 6,00, 7,00 e 8,00) e carbonato (pH 10,4). Avaliou-se, também, a aplicabilidade da hipericina sintética (Hyp) como novo fluoróforo da reação, obtendo-se as melhores condições reacionais e comparando seus resultados aos obtidos com outros fluoróforos. A adição das CDs ao meio reacional foi realizada solubilizando-as em tampão. Na presença de 2,5-difeniloxazol, PPO, como fluoróforo, não se notou influência da presença das CDs sobre os sinais quimiluminescentes. Aplicando-se a fluoresceína, Flu, observou-se que em meio de tampão fosfato, pH 6,00, há aumento de Imax em 29,5% com gama-CD e supressão da Área em 95,6% com beta-CD. Quando estudados o nível de acidez e a natureza do tampão, os melhores resultados foram obtidos em meio de tampão fosfato pH 8,00. Estudando-se os espectros de absorção e fluorescência da Flu e da Hyp em meio parcialmente aquoso, tamponado e na presença de CDs, não se verificou interação entre o fluoróforo e as CDs, explicando-se a não influência da presença das CDs sobre os sinais quimiluminescentes. A avaliação da Hyp como fluoróforo foi iniciada por meio de sua caracterização espectrofotométrica, obtendo-se espectros de absorção, fluorescência e quimiluminescência, comprovando que a Hyp é a espécie emissora do sistema. Um estudo de estabilidade mostrou que a solução da Hyp pode ser armazenada por 50 dias, ao abrigo da luz e em congelador. Avaliando-se os efeitos dos tampões e das concentrações de cada reagente, obteve-se melhores resultados com tampão fosfato pH 8,00, TCPO 1,3x10-4 mol L-1, Hyp 1,3x10-5 mol L-1 e H2O2 8,9x10-5 mol L-1. Comparando-se a Hyp a outros fluoróforos, obtiveram-se intensidade e rendimento quântico fluorescente baixos nas condições reacionais, bem como sensibilidade para quantificação de H2O2 inferior a de outros fluoróforos. No entanto, quando determinado o rendimento quântico quimiluminescente, a Hyp apresentou o melhor resultado comparado aos demais, indicando uma limitação instrumental devido à baixa sensibilidade da fotomultiplicadora para o comprimento de onda de emissão da Hyp. Porém, esta importante substância com fins terapêuticos apresentou resultados positivos quando aplicada na reação QL-PO e abre perspectivas de novos estudos nesta área. / The chemiluminescent reaction of peroxyoxalate system (PO-CL) involves oxalic acid derivatives and a peroxide. Since its discovery, in 1963, by Chandross, it has been much studied in order to understand its mechanism and its application for different purposes. The process of issuing the PO-CL reaction is achieved by the excitement of a fluorophore through a mechanism of electron transfer from a high-energy intermediate formed in the reaction. Usually the fluorophores and the esters are insoluble in water and poorly soluble in partially aqueous medium, necessary in many analytical applications. Thus, many research groups are studying new fluorophores for the reaction and seeking ways to circumvent problems of solubility, stability of the ester and reproducibility by applying surfactants and cyclodextrins, thus making it possible to work in mostly aqueous medium. In this way, in this work, the effect of the presence of the natural cyclodextrins (CDs) on the chemiluminescent signals of the reaction between oxalate of bis-(2,4,6-trichlorophenyl) oxalate (TCPO) and hydrogen peroxide (H2O2), in partially aqueous medium and in the presence of phosphate (pH 6.00, 7.00 and 8.00) and carbonate (pH 10.4) buffers was studied. The applicability of synthetic hypericin (Hyp) as a new fluorophore of the reaction was also evaluated, obtaining the best reactional conditions and comparing its results to those obtained with other fluorophores. The addition of the CDs to the reaction medium was performed solubilizing them in buffer. In the presence of 2,5-diphenyloxazole, PPO, as fluorophore, the influence of the presence of CDs on the chemiluminescent signals wasn¿t noticed. Applying the fluorescein, Flu, it was observed that with phosphate buffer, pH 6,00, there is an increase of Imax in 29.5% with gamma-CD and suppression of Area in 95.6% with beta-CD. On studying the acidity level and the nature of the buffer, the best results were obtained in a phosphate buffer solution with pH 8.00. Studying the absorption and fluorescence spectras of Flu and Hyp in partially aqueous medium, buffered and in the presence of CDs, it was verified that there is no interaction between the fluorophore and the CDs under the working conditions, explaining the lack of influence of the presence of CDs on the chemiluminescent signals. The evaluation of Hyp as fluorophore was initiated through its spectrophotometric characterization, obtaining absorption, fluorescence and chemiluminescence spectra, proving that Hyp is the emitting species of the system. A stability study showed that Hyp¿s solution can be stored for 50 days, away from light and in freezer. Evaluating the effects of buffers and concentrations of each reagent, the best results were obtained with phosphate buffer pH 8.00, TCPO 1,3x10-4 mol L-1, Hyp 1,3x10-5 mol L-1 and H2O2 8,9x10-5 mol L-1. Comparing the Hyp to other fluorophores, there were obtained low intensity and fluorescent quantum yield in the reactional conditions, as well as sensitivity to quantification of H2O2 lower than other fluorophores. However, on determining the chemiluminescent quantum yield, the Hyp presented the best result compared to the others, indicating an instrumental limitation due to the low sensitivity of the photomultiplier at the emission wavelength of the Hyp. However, this substance ¿ important as it is for therapeutic purposes ¿, exhibited positive results when applied to PO-CL reaction, opening prospects for further studies in this area.

Medicinal plants which have been widely used in folk medicine are known to contain important biologically active compounds. Most of today&rsquo / s synthetic drug raw materials are to be prepared by using plant originated compounds as the starting material. Hypericum Perforatum is one of the medicinal plants that grows in Europe, Western Asia and Northern Africa and is distinguished by its golden yellow flowers. The common name of the plant is St. John&rsquo / s wort. From the time of the ancient Greeks down through the middle Ages, the plant was considered to be imbued with magical powers and was used to ward off evil and protect against disease. As a practical folk-remedy, it has been used widely to heal wounds, remedy kidney troubles, and alleviate nervous disorders, even insanity. In the last thirty years, Hypericum perforatum has undergone extensive clinical and laboratory testing. The extract of the flower is a red liquid that contains many biologically active compounds such as: naphtodianthrones (hypericin, pseudohypericin), phloroglucinols (hyperforin, adhyperforin), flavonoids (quercetin, hyperoside, quercitrin, isoquercitrin, rutin, campferol, myricetin, amentofloavone), procyanidins (procyanidin, catechin, epicatechin polymers) , tannins (tannic acid), essential oils (terpenes, alcohols), amino acids (GABA, Cysteine, glutamine, leucine, lysine, ornithine, praline, threonine), phenyl propanes (caffeic acid, chlorogenic acid), xanthones (keilcorin, norathriol), organic acids peptides and polysaccharides (other water soluble compounds). These compounds have previously been isolated using HPLC method. The aim of this study is to isolate the main biologically active compound groups of Hypericum Perforatum and simply characterize the compounds with TLC, UV-VIS spectroscopy, NMR spectroscopy using standard compounds as references.

O aparecimento de uma grande variedade de microrganismos patogênicos resistentes aos antimicrobianos tem resultado no aumento do índice de doenças e mortalidade provocadas por infecções que eram facilmente tratadas no passado. Muitas vezes essa resistência está relacionada à formação de biofilme pelos microrganismos, que produzem substâncias poliméricas extracelulares (EPS) dificultando a penetração de agentes antimicrobianos. A Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) é uma alternativa promissora para combater infecções microbianas, principalmente aquelas em que apresentam biofilmes. Basicamente esse mecanismo envolve a combinação sinérgica de um fotossensibilizador (FS), oxigênio molecular e luz visível de comprimento de onda adequado para produzir espécies reativas de oxigênio (EROs) que causam oxidação dos componentes da célula levando-a à morte. Devido à natureza multifacetada e não-específica das EROs produzidos na aPDT, os microrganismos têm menos chance de desenvolver mecanismos de resistência. Apesar destas vantagens, a aPDT tem enfrentando o problema da hidrofobicidade que FSs como hipericina (Hy) e ftalocianina de zinco (FcZn) apresentam. Esta hidrofobicidade promove a agregação do FS em meio biológico, reduzindo a sua atividade fotodinâmica. Diante disso, este estudo teve o objetivo avaliar a ação fotodinâmica da Hy, FcZn e seus derivados hidrossolúveis (hipericina-glucamina - HyG, ftalocianina de zinco tetracarboxilada - FcZnTc e ftalocianina de zinco tetracarboxi-N-metilglucamina - FcZnTcG), para inativar as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli, tanto em cultura planctônica como em biofilme. Como a aPDT apresenta também a vantagem de seletividade, foi proposto que as condições para fotoinativação destas bactérias provocassem o mínimo de dano às células hospedeiras. Estudos físico-químicos dos novos FSs mostraram menor agregação dos FSs derivados em meio aquoso que seus compostos de origem, bem como um ligeiro aumento no coeficiente de atividade fotodinâmica. Além disso, a hidrofilicidade dos FSs aumentou a acumulação intracelular dos mesmos nas bactérias de estudo S. aureus e E. coli, tanto na forma de células planctônicas quanto em biofilme. Os ensaios de acumulação intracelular dos FSs determinaram os parâmetros de fotoinativação seletiva dos microrganismos, tanto em células planctônicas como em biofilme. Todos os FSs, com exceção de FcZn, foram capazes de promover a seletividade de S. aureus e E. coli na forma planctônica. Entretanto, devido a maior complexidade morfológica de E. coli, os parâmetros de fotoinativação utilizados para inibir esta bactéria foram cerca de duas vezes maiores que para inativar a mesma concentração celular de S. aureus. Dentre todos os FSs, a FcZnTcG apresentou as melhores condições de seletividade tanto para E. coli quanto para S. aureus, uma vez que inibiu aproximadamente 100% destes microrganismos e no máximo 15% de células epiteliais (Vero). A obtenção das condições de seletividade para os biofilmes bacterianos foi mais difícil, pois a acumulação dos FSs por S. aureus e E. coli foi menor, tornando-se assim necessário aumentar os parâmetros de fotoinativação, ou seja, concentração do FS, tempo de incubação e dose de luz, que consequentemente inibiram mais as células epiteliais. Apesar disso, HyG e FcZnTcG foram capazes de promover a seletividade do biofilme de S. aureus em todas as etapas de formação. Entretanto, a seletividade do biofilme de E. coli foi alcançada apenas nas etapas de adesão reversível e irreversível e somente por FcZnTcG. Isso pode ser justificado pela maior concentração de EPS sintetizado por E. coli que por S. aureus, dificultando a acumulação dos FSs nas últimas etapas do biofilme de E. coli (biofilme maduro e dispersão). Portanto, os resultados desse estudo permitem sugerir que a hidrofilicidade é uma característica importante para os FSs fotoinativarem seletivamente os microrganismos S. aureus e E. coli, mesmo na forma de biofilme. Além disso, foi observado que a ação de aPDT no EPS do biofilme bacteriano desempenha um papel fundamental para inibição tanto de S. aureus quanto de E. coli. / The appearance of a large variety of antimicrobial-resistant pathogenic microorganisms has led to increased rates of disease and mortality caused by infections that were easily treated in the past. It has become clear that the biofilm-grown cells increase the bacteria resistance to antibiotics. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is a promising alternative way to fight microbial infections, especially the biofilm ones. This technique, basically, involves the synergistic combination of a photosensitizer, molecular oxygen and visible light of an appropriate wavelength to produce highly reactive oxygen species that lead to the oxidation of several cell components and to cell inactivation. The main advantage of the technique is that, given the existence of multiple targets, there is no development of resistance. The hidrophobicity of photosensitizers (PSs) like hypericin (Hy) and zinc phthalocyanine (ZnPc), reduces their photodynamic activity once they form aggregates in biological media. For this reason, was evaluated the effectivenes of Hy, ZnPc and its water-soluble derivatives (glucamine-hypericin-HyG, zinc tetracarboxylated phthalocyanine-ZnTcPc and zinc tetracarboxy-N-metylglucamine phthalocyanine-ZnTcGPc) to photoinactivate S. aureus and E. coli with minimal damage to a model of host cells. Physicochemical studies showed that hidrophilic PSs suffer less aggregation in aqueous media, as well as present a slight increase in photodynamic activity compared to Hy and ZnPC. Furthermore, the hydrophilicity of PSs increased the PS intracellular accumulation in bacteria, either in planktonic culture or biofilms. The accumulation study allowed to determine the parameters of selective photoinactivation of microorganisms. Due the morphologic complexity of E. coli the photodynamic parameters (incubation time, PS concentration and light dose) were twice that used against S. aureus. As a consequence, some more epithelial cells were affected by the process. Despite that, only the ZnPc could not promote the selective inactivation for planktonic cells. By the other hand, HyG and FcZnTcG were able to seletively photoinactivate the biofilm of S. aureus in all its formation stages. However, the selective inactivation of E. coli biofilm was achieved only in the reversible and irreversible adhesion and just for FcZnTcG. This fact can be explained by the higher concentration of exopolysaccharide (1,9 \'mü\'g/mL) synthesized by E. coli compared with S. aureus, making difficult the accumulation of the PSs in the last stages of the E. coli biofilm formation (mature biofilm and dispersion). So, we can suggest that hidrophilicity is an important characteristic for the PSs, improving the selective photoinactivation of S. aureus and E. coli, even as biofilm. Moreover, the effectiveness of aPDT agains EPS plays a key role for inhibition of bacterial biofilms.