Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire incurable encore incomplètement comprise. Elle se caractérise cliniquement par une élévation de la pression moyenne dans l’artère pulmonaire (AP) au-delà du seuil de 25 mmHg. Au niveau cellulaire, cette élévation des pressions est attribuable à une prolifération excessive et une résistance à l’apoptose accrue des cellules musculaires lisses (CML) d’AP. HDAC6 est une histone désacétylase 6 principalement cytoplasmique régulant divers mécanismes de survie surexprimée en réponse au stress dans plusieurs cancers. Étant donné les similarités entre les cellules cancéreuses et les cellules vasculaires HTAP, nous avons émis l’hypothèse qu’HDAC6 est surexprimée en HTAP et contribuait au phénotype prolifératif et anti-apoptotique des CMLAPs et au remodelage vasculaire en HTAP. À l’aide de souris génétiquement modifiées et d’approches pharmacologiques dans deux modèles animaux précliniques d’HTAP, nous avons voulu démontrer qu’HDAC6 représente une cible thérapeutique de choix. Nous faisons la démonstration qu’HDAC6 est surexprimée dans les tissus pulmonaires, les AP distales et les CML isolées de patients HTAP lorsque comparés aux donneurs sains. L’inhibition moléculaire et pharmacologique d’HDAC6 réduit la prolifération et la résistance à l’apoptose des CMLAPs HTAP, sans avoir d’effet sur les cellules contrôles. D’un point de vue mécanistique, nous démontrons qu’HDAC6 désacétyle KU70, bloquant la translocation mitochondriale de Bax pour éluder l’apoptose. L’inhibition d’HDAC6 in vivo par la tubastatine A améliore significativement les paramètres hémodynamiques et le remodelage vasculaire dans deux modèles d’HTAP précliniques. Nous montrons que l’inhibition d’HDAC6 peut être combinée de façon sécuritaire à une bithérapie HTAP approuvée présentement utilisée en clinique et que la trithérapie proposée procure un effet bénéfique additif à l’inhibition d’HDAC6 seule sur le remodelage. Finalement, nous montrons que les souris mutées pour HDAC6 ont un remodelage vasculaire et une élévation des pressions artérielles pulmonaires significativement moins grands que les souris non mutées en réponse à une hypoxie de 3 semaines. Nous démontrons pour la première fois l’implication d’HDAC6 dans le développement de l’HTAP. L’inhibition d’HDAC6 semble être une avenue thérapeutique intéressante dans le traitement de l’HTAP. La tubastatine A étant déjà en phase clinique dans le traitement de certains cancers, l’évaluation de son efficacité pour la clientèle HTAP pourrait être rapidement mise en place. / RATIONALE: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a vascular remodeling disease with limited therapeutic options. Although exposed to stressful conditions, pulmonary artery (PA) smooth muscle cells (PASMCs) exhibit a pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype. HDAC6 is a cytoplasmic histone deacetylase implicated in the regulation of multiple pro-survival mechanisms and overexpressed in response to stress in cancer cells. Due to the similarities between cancer and PAH, we hypothesized that HDAC6 expression is increased in PAH-PASMCs to face stress, allowing them to survive and proliferate, thus contributing to vascular remodeling in PAH. OBJECTIVE: Using genetically modified mice and pharmacological approaches, we aimed to demonstrate that HDAC6 inhibition is a promising strategy to improve PAH. METHODS AND RESULTS: HDAC6 is significantly up-regulated in lungs, distal PAs and isolated PASMCs from PAH patients and animal models. Molecular and pharmacological inhibition of HDAC6 reduces PAH-PASMC proliferation (Ki67 labeling) and resistance to apoptosis (Annexin V assay) in vitro sparing control cells. Mechanistically, we demonstrate that HDAC6 deacetylates Ku70, blocking the translocation of Bax to the mitochondria and preventing apoptosis. In vivo inhibition of HDAC6 (Tubastatin A) significantly improves established PAH in two experimental models (Sugen/hypoxia and monocrotaline) and can be safely given in combination with currently approved PAH therapies. Finally, Hdac6 K.O mice have significantly lower right ventricle systolic pressure in response to 3 weeks of chronic-hypoxia compared to wild-type mice. CONCLUSION: We showed for the first time that HDAC6 is implicated in PAH development and represents a new promising therapeutic target to improve PAH.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par l’obstruction des artères pulmonaires, principalement due au phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des cellules musculaires lisses de la paroi des artères pulmonaires (CMLAP). L’augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires aboutit à une élévation de la pression pulmonaire qui va induire rapidement une insuffisance cardiaque droite et conduire au décès des patients à moyen terme. Plusieurs études ont démontré l’implication du facteur de transcription NFAT (nuclear factor of activated T cell) dans le maintien du phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des CMLAP-HTAP. Cependant les voies de signalisation responsables de l’activation constitutive d’NFAT restent peu connues. Durant mon doctorat, j’ai étudié les mécanismes responsables de l’activation d’NFAT dans l’HTAP. Nous nous sommes intéressés au rôle des microARN et notamment à miR-204. Ainsi, les facteurs circulants augmentés dans HTAP, diminue l’expression de miR-204 via l’activation du facteur de transcription STAT3. Par un mécanisme de rétro-action positive, la diminution de miR-204 induit une suractivation de STAT3 aboutissant au phénotype pathologique. Ainsi, l’augmentation exogène de miR-204 permettrait de soigner l’HTAP in vitro et in vivo. Nous avons montré que miR-204 va également moduler l’expression de Runx2, facteur de transcription connu pour être impliqué dans la calcification. Dans les CMLAP-HTAP, la diminution de miR-204 est associée à une augmentation de l’expression de Runx2, connu comme un régulateur positif de l’activation du facteur de transcription HIF-1 impliqué dans l’HTAP. Ainsi la modulation de miR-204 affecte la prolifération et l’apoptose des CMLAP-HTAP par plusieurs axes de signalisation. Enfin, nous avons démontré l’implication du facteur de transcription Krüppel Like Factor 5 (KLF5) dans l’HTAP. La surexpression de KLF5 dans l’HTAP est secondaire à l’activation de STAT3, tandis que son inhibition diminue la prolifération et favorise l’apoptose des CMLAP-HTAP. In vivo, l’administration de siKLF5 renverse l’HTAP en diminuant les pressions pulmonaires, l’hypertrophie ventriculaire droite, la prolifération et augmentant l’apoptose des CMLAP des artères pulmonaires distales. Finalement, j’ai étudié différents aspects du développement de l’HTAP et notamment de l’activation de l’axe STAT3/NFAT. Nous avons pu mettre en évidence que cibler cette voie de signalisation par différents moyens (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) semble une bonne stratégie pour traiter l’HTAP. Mots clés : l’hypertension artérielle pulmonaire, thérapeutique, prolifération, apoptose, microARN, facteur de transcription, réparation à l’ADN. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by the obstruction of the pulmonary arteries, mainly due to the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype of the pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC). The progressive increase of pulmonary vascular resistance first leads to an increase of pulmonary pressure and then leads to a right heart failure, which generates patient’s death within few years. Many studies demonstrated the implication of the transcription factor NFAT (nuclear factor of activated T cell), which maintains the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype in PAH-PASMC. However, pathways that lead to the constitutive NFAT activation remain unclear. During my doctorate, I studied mechanisms responsible for the activiation of NFAT in HTAP. We study the role of the microRNA and more exactly to miR-204. Thus, the circulating factors, which are increased in PAH and which decreased miR-204 expression in PAH, via the transcription factor STAT3 activation. Through a positive regulation loop mechanism, the decrease of miR-204 induces an overactivation sustain of STAT3 leading to the pathologique phenotype. Thus, the exogenous increase of miR-204 could treat PAH in vitro as well as in vivo. We demonstrated that miR-204 is able to modulate the expression of the transcription factor Runx2 known to be implicated in calcification. In PAH-PASMC, the decrease of miR-204 is associated to an increase of Runx2 expression, known as positive regulator of the HIF-1 activation implicated in PAH. Thus miR-204 modulations affected the proliferation and apoptosis of PAH-PASMC through many molecular axes. Finaly we reveal the implication of the transcription factor Kruppel Like Factor 5 (KLF5) in PAH. The KLF5 overexpressed in PAH is associated to the STAT3 activation, wherease its inhibition decreased the proliferation and promoted apoptosis in PAH-PASMC. In vivo, si KLF5 reversed PAH by decreasing pulmonary pressures, right ventricular hypertrophy, proliferation and increasing apoptosis in PASMC from distal PA. Finally, I studied many aspects implicated in PAH development and especially the STAT3/NFAT axis activation. We showed that targeting this pathway using many technics (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) seem to be an interesting strategy to treat PAH. Key words: Pulmonary arterial hypertension, therapeutic, proliferation, apoptosis, microRNA, and transcription factor.

Titre de l'écran-titre (visionné le 11 avril 2023) / L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire rare irréversible qui affecte les artères pulmonaires et altère la fonction cardiaque. Malgré des progrès importants années dans la compréhension de la maladie et la prise en charge des patients au cours des 20 dernières années, l'HTAP reste une maladie foudroyante qui emporte les patients en seulement quelques années après leur diagnostic. L'HTAP se caractérise par une pression pulmonaire moyenne au-dessus de 20mmHg. La pression est la force motrice du sang dans les vaisseaux. La contraction excessive et un remodelage important des petites artères pulmonaires est à l'origine de l'obstruction progressive des vaisseaux, et l'augmentation conséquente de la résistance à l'écoulement du sang dans ces vaisseaux ainsi de la pression artérielle pulmonaire moyenne chez les patients souffrant d'HTAP. En réponse, le cœur doit fournir plus d'effort pour maintenir un débit cardiaque suffisant pour alimenter tous les tissus en oxygène et nutriments. La progression de l'hypoperfusion conduit à une insuffisance cardiaque droite responsable de la mort des patients. Les cellules musculaires lisses d'artères pulmonaires (CMLAP) jouent un rôle majeur dans le remodelage vasculaire. Ces cellules ont acquis un phénotype pathologique pro-polifératif et résistant à l'apoptose rappelant celui des cellules cancéreuses, ce qui leur permet de survivre et de s'accumuler dans la paroi des artères. En particulier, comme les cellules cancéreuses, les CMLAP ont développé des mécanismes de protection de leur matériel génétique qui leur permet de résister aux à leur environnement génotoxique. Les protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l'ADN et la réparation sont les plus différentiellement exprimées dans les CMLAP issues de patients HTAP (CMLAP-HTAP). Les thérapeutiques actuels ne ciblent pas ce phénotype particulier. En cancérologie, les chimio- et radiothérapies sont des méthodes courantes pour induire des dommages à l'ADN et tuer les cellules cancéreuses. De nombreuses méthodes moins directes ont été étudiées pour épargner les cellules saines, notamment en passant par des acteurs moléculaires augmentés spécifiquement dans les cellules malades. Ces acteurs sont souvent impliqués dans des mécanismes d'adaptation cellulaires. Inhiber ces acteurs permet d'abolir ces mécanismes d'adaptation et de resensibiliser les cellules à leur milieu cytotoxique. NUDT1 fait partie des protéines les plus différentiellement exprimées dans les CMLAP-HTAP. Elle est surexprimée dans ces cellules ainsi que dans les CMLAP de rats présentant une HTAP induite. NUDT1 est une enzyme qui détoxifie le pool de nucléotides, les précurseurs des bases de l'ADN, par l'hydrolyse de nucléotides oxydés. L'augmentation du pool de nucléotides oxydés induit des effets cytotoxiques supérieurs aux dommages à l'ADN seuls. L'inhibition de NUDT1 dans les cancers est associée à des effets antitumoraux. L'augmentation du pool de nucléotide par le (S)-Crizotinib, un inhibiteur de NUDT1, diminue la prolifération et la résistance à l'apoptose des CMLAP-HTAP et des CMLAP des modèles de rats de la maladie. Chez ces rats, la diminution du remodelage vasculaire est associée à une amélioration des paramètres hémodynamiques, et notamment de la pression artérielle pulmonaire moyenne et de la fonction cardiaque. De manière intéressante, l'altération des flux autophagiques est impliquée dans les effets thérapeutiques du (S)-Crizotinib. Ces résultats précliniques démontrent que l'altération du pool de nucléotides, notamment l'augmentation du pool de nucléotides oxydés est une stratégie effective pour traiter l'HTAP et représente un nouveau levier thérapeutique en HTAP. L'application d'une telle stratégie est à évaluer en fonction de paramètres précis, dynamique et individuels pour chaque patient au titre d'une médecine « Personnalisée, Proactive, et Précise » à la pointe des avancées technologiques. Dans cette optique, certains nucléotides oxydés représentent de potentiels biomarqueurs dont le suivi en temps réel pourrait permettre cette prise en charge personnalisée, proactive et précise.

Nos investigations avaient pour but premier d'identifier une nouvelle cible thérapeutique potentielle en Hypertension Artérielle Pulmonaire (HTAP) impliquée dans le remodelage vasculaire des cellules musculaires lisses (CML) au niveau des artères pulmonaires (AP). Ces recherches ont révélé que l'inhibition de Aurora Kinase B (AURKB) dans les Cellules musculaires lisses d'artères pulmonaires (CMLAP) d'HTAP entraîne une perturbation du cycle cellulaire avec un blocage en phase G2/M, une induction de la mort cellulaire programmée, et une modification significative de leur signature génétique. Ces observations suggèrent un rôle crucial de AURKB dans le processus de remodelage vasculaire associé à l'HTAP. Encouragés par ces résultats, nous avons évalué l'efficacité thérapeutique de l'inhibition de AURKB in vivo en utilisant le Barasertib, un de ses inhibiteurs spécifiques. Nos expériences précliniques chez l'animal ont démontré que le traitement au Barasertib améliore significativement la dynamique vasculaire dans deux modèles animaux d'HTAP (Monocrotaline et Sugen/Hypoxie), et cette amélioration a été confirmée dans des échantillons de poumons humains, des Precision-cut lung slices (PCLS). De plus, les CMLAP d'HTAP ont développé un phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP) à la suite de différents traitements moléculaires et pharmacologiques. Une approche thérapeutique combinée, associant le Barasertib avec un agent anti-sénescent, l'UC2288, a révélé une amélioration significative du remodelage vasculaire, suggérant une nouvelle stratégie prometteuse pour le traitement de l'HTAP. Nos résultats mettent en lumière AURKB comme une cible thérapeutique potentielle pour l'HTAP et soulignent l'efficacité d'une approche combinée pour réduire le remodelage vasculaire pulmonaire associé à cette pathologie. Ces découvertes ouvrent la voie à de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'HTAP, offrant ainsi un espoir pour améliorer leur qualité de vie et leur pronostic à long terme / The primary objective of our investigation was to identify a potential novel therapeutic target involved in the vascular remodeling of smooth muscle cells with in pulmonary arteries, specifically in Pulmonary Arterial Hypertension (PAH). Our research revealed that inhibiting Aurora Kinase B (AURKB) in PAH smooth muscle cells leads to cell cycle disruption, causing a block at the G2/M phase, induction of programmed cell death, and significant alterations in their genetic profile. These findings highlight the crucial role of AURKB in the vascular remodeling process associated with PAH. Encouraged by these results, we assessed the therapeutic potential of AURKB inhibition in vivo using Barasertib, a specific inhibitor of this kinase.Our preclinical experiments demonstrated that Barasertib treatment significantly improved vascular dynamics in two animal models of PAH (Monocrotaline and Sugen/Hypoxia). This improvement was further validated in human lung samples using Precision-cut Lung Slices (PCLS). Moreover, PAH smooth muscle cells in pulmonary arteries developed a senescence-associated secretory phenotype (SASP) following various molecular and pharmacological treatments. A combined therapeutic approach, using Barasertib together with an anti-senescent agent, UC2288, resulted in a significant reduction of vascular remodeling, suggesting a promising new strategy for PAH treatment.These results identify AURKB as a potential therapeutic target for PAH and underscore the effectiveness of a combined approach in reducing pulmonary vascular remodeling associated with the condition. These discoveries pave the way for innovative therapeutic strategies for PAH patients, offering hope for improved quality of life and long-term prognosis.