Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire incurable encore incomplètement comprise. Elle se caractérise cliniquement par une élévation de la pression moyenne dans l’artère pulmonaire (AP) au-delà du seuil de 25 mmHg. Au niveau cellulaire, cette élévation des pressions est attribuable à une prolifération excessive et une résistance à l’apoptose accrue des cellules musculaires lisses (CML) d’AP. HDAC6 est une histone désacétylase 6 principalement cytoplasmique régulant divers mécanismes de survie surexprimée en réponse au stress dans plusieurs cancers. Étant donné les similarités entre les cellules cancéreuses et les cellules vasculaires HTAP, nous avons émis l’hypothèse qu’HDAC6 est surexprimée en HTAP et contribuait au phénotype prolifératif et anti-apoptotique des CMLAPs et au remodelage vasculaire en HTAP. À l’aide de souris génétiquement modifiées et d’approches pharmacologiques dans deux modèles animaux précliniques d’HTAP, nous avons voulu démontrer qu’HDAC6 représente une cible thérapeutique de choix. Nous faisons la démonstration qu’HDAC6 est surexprimée dans les tissus pulmonaires, les AP distales et les CML isolées de patients HTAP lorsque comparés aux donneurs sains. L’inhibition moléculaire et pharmacologique d’HDAC6 réduit la prolifération et la résistance à l’apoptose des CMLAPs HTAP, sans avoir d’effet sur les cellules contrôles. D’un point de vue mécanistique, nous démontrons qu’HDAC6 désacétyle KU70, bloquant la translocation mitochondriale de Bax pour éluder l’apoptose. L’inhibition d’HDAC6 in vivo par la tubastatine A améliore significativement les paramètres hémodynamiques et le remodelage vasculaire dans deux modèles d’HTAP précliniques. Nous montrons que l’inhibition d’HDAC6 peut être combinée de façon sécuritaire à une bithérapie HTAP approuvée présentement utilisée en clinique et que la trithérapie proposée procure un effet bénéfique additif à l’inhibition d’HDAC6 seule sur le remodelage. Finalement, nous montrons que les souris mutées pour HDAC6 ont un remodelage vasculaire et une élévation des pressions artérielles pulmonaires significativement moins grands que les souris non mutées en réponse à une hypoxie de 3 semaines. Nous démontrons pour la première fois l’implication d’HDAC6 dans le développement de l’HTAP. L’inhibition d’HDAC6 semble être une avenue thérapeutique intéressante dans le traitement de l’HTAP. La tubastatine A étant déjà en phase clinique dans le traitement de certains cancers, l’évaluation de son efficacité pour la clientèle HTAP pourrait être rapidement mise en place. / RATIONALE: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a vascular remodeling disease with limited therapeutic options. Although exposed to stressful conditions, pulmonary artery (PA) smooth muscle cells (PASMCs) exhibit a pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype. HDAC6 is a cytoplasmic histone deacetylase implicated in the regulation of multiple pro-survival mechanisms and overexpressed in response to stress in cancer cells. Due to the similarities between cancer and PAH, we hypothesized that HDAC6 expression is increased in PAH-PASMCs to face stress, allowing them to survive and proliferate, thus contributing to vascular remodeling in PAH. OBJECTIVE: Using genetically modified mice and pharmacological approaches, we aimed to demonstrate that HDAC6 inhibition is a promising strategy to improve PAH. METHODS AND RESULTS: HDAC6 is significantly up-regulated in lungs, distal PAs and isolated PASMCs from PAH patients and animal models. Molecular and pharmacological inhibition of HDAC6 reduces PAH-PASMC proliferation (Ki67 labeling) and resistance to apoptosis (Annexin V assay) in vitro sparing control cells. Mechanistically, we demonstrate that HDAC6 deacetylates Ku70, blocking the translocation of Bax to the mitochondria and preventing apoptosis. In vivo inhibition of HDAC6 (Tubastatin A) significantly improves established PAH in two experimental models (Sugen/hypoxia and monocrotaline) and can be safely given in combination with currently approved PAH therapies. Finally, Hdac6 K.O mice have significantly lower right ventricle systolic pressure in response to 3 weeks of chronic-hypoxia compared to wild-type mice. CONCLUSION: We showed for the first time that HDAC6 is implicated in PAH development and represents a new promising therapeutic target to improve PAH.

La schistosomiase est la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme puisqu’en 2016, environ 200 millions de personnes ont été traitées pour cette parasitose. Plusieurs espèces de schistosomes peuvent être la cause de cette maladie dont Schistosoma mansoni, responsable de la schistosomiase intestinale. Son cycle de vie est complexe et comprend deux hôtes : un hôte définitif vertébré, l’Humain et un hôte intermédiaire qui est un mollusque d’eau douce. Actuellement, un seul médicament, le praziquantel, est utilisé contre toutes les espèces de schistosomes, mais son utilisation de façon massive et répétée à favoriser l’émergence de souches parasitaire tolérantes et/ou résistantes. La nécessité de trouver de nouveaux médicaments et de nouveaux traitements est donc devenue impérative.Les lysines désacétylases ou KDAC(s) constituent des cibles thérapeutiques intéressantes, notamment parce que ce sont des enzymes impliquées dans des processus cellulaires essentiels tels que la régulation de l'expression des gènes et du cycle cellulaire, ou encore la différenciation cellulaire. À ce jour, des inhibiteurs de KDAC(s) sont déjà approuvés dans le traitement du cancer et d’autres sont en essais cliniques.Chez S. mansoni, trois KDAC(s) de classe I ont été identifiées: HDAC 1, 3 et 8. D'autre part, l'utilisation d'inhibiteurs de KDAC(s) a démontré qu'il était possible d'induire l'apoptose et la mort des parasites en culture. Des études réalisées sur la protéine HDAC8 humaine et SmHDAC8 ont montré qu'il existait des différences significatives au niveau de la poche catalytique entre ces deux protéines. Ces données soulignent l’intérêt de développer des inhibiteurs sélectifs de SmHDAC8. Il est devenu, néanmoins essentiel de déterminer le rôle de SmHDAC8 dans la biologie du parasite et notamment ses partenaires protéiques. De ce fait, la première partie de ce travail de thèse s’est focalisé sur la mise en évidence de l’interactome de l’enzyme parasitaire SmHDAC8. Par l’utilisation du système en double hybride chez la levure et de la co-immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié plusieurs partenaires de SmHDAC8 qui sont impliqués dans des processus essentiels à la cellule tel que la régulation de la transcription et de la traduction, le cycle cellulaire, le métabolisme, la réparation de l’ADN, la protéolyse ou encore le transport des protéines. Parmi ces interactants, nous avons également retrouvé la GTPase SmRho1 suggérant que l’enzyme SmHDAC8 serait impliqué dans la modulation de l’organisation du cytosquelette.Dans une seconde partie, nous nous sommes donc intéresser à l’interaction entre SmHDAC8 et la SmRho1. Nous avons initialement démontré que cette interaction était bien présente chez le parasite et notamment chez les vers adultes et les schistosomules. L’acétylation de SmRho1 sur la lysine K136 a également été mise en évidence par spectrométrie de masse et nous avons aussi pu observer un effet de l’inhibition de SmHDAC8 sur l’organisation du cytosquelette d’actine chez le parasite.Deux isoformes de SmRho1 (SmRho1.1 et SmRho1.2) ont été identifiées et caractérisées. La technique du double hybride chez la levure et la co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, a permis de démontrer que seule SmRho1.1 pouvait interagir avec SmHDAC8. Enfin, la caractérisation des motifs d'interaction entre SmHDAC8 et SmRho1.1, par co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, suggère que le domaine C-terminal de SmRho1 serait impliqué dans cette interaction. Ces données sont en faveur d’un rôle potentiel de SmHDAC8 dans la modulation du cytosquelette d’actine via son interaction spécifique avec la GTPase SmRho1.1. / Schistosoma mansoni is the major parasitic platyhelminth species causing intestinal schistosomiasis, for which around 200 million people are in need of treatment. The schistosome life cycle is complex and includes two hosts: a definitive mammalian host, mainly humans in the case of S. mansoni, and an intermediate snail host. Currently one drug, praziquantel, is the treatment of choice against all species of schistosomes, but tolerant/resistant strains have been isolated in endemic areas following its extensive use in mass treatment programs, as well as in laboratory studies. The need to find new drugs and new treatments is therefore imperative.Lysine deacetylases (KDACs) form a family of enzymes that are conserved in metazoans. They are attractive therapeutic targets in a variety of pathologies, particularly cancer, because they are involved in the regulation of gene transcription and several KDAC inhibitors have already been approved as drugs. Our previous studies identified and characterized three class I KDACS in Schistosoma mansoni: HDAC 1, 3 and 8. Invalidation of the transcription of SmHDAC8 by RNAi led to the impaired survival of the worms after the infection of mice, showing that it is a valid therapeutic target.The analysis of the 3D structure of SmHDAC8 by X-ray crystallography showed that the catalytic domain structure diverges significantly from that of human HDAC8 and this was exploited to identify selective inhibitors that induce apoptosis and death of the worms and are thus lead compounds for the development of novel anti-schistosomal drugs.The precise biological roles of mammalian or schistosomal HDAC8 are unknown and in order to determine why SmHDAC8 knockdown or inhibition causes apoptosis and death it is essential to study the cellular signaling pathways involving SmHDAC8. In the first part of the work described in this thesis, protein partners of SmHDAC8 were characterized by screening a yeast two-hybrid cDNA library and co-immunoprecipitation/mass spectrometry (MS) analysis. SmHDAC8 partners are involved in different processes, included transcriptional and translational regulation, cell cycle, metabolism, DNA repair, proteolysis or protein transport. Among the partners thus identified the schistosome orthologue of the human RhoAGTPase, suggesting that SmHDAC8 may be involved in the modulation of the organization of the cytoskeleton.The second part of the work focused on the interaction between SmHDAC8 and SmRho1. In adult worms and schistosomula S. mansoni, SmHDAC8 interacts with SmRho1 GTPase which is acetylated on lysine K136. Treatment with an SmHDAC8 inhibitor caused massive disruption of the worm and schistosomula actin cytoskeleton. We have also identified two closely related isoforms of SmRho1 (SmRho1.1 and SmRho1.2). By using two heterologous expression systems (the yeast two hybrid assay and Xenopus oocytes), we have demonstrated a specific interaction between SmHDAC8 and SmRho1.1 involving its C-terminal moiety. Our results show that SmHDAC8 is potentially involved in cytoskeleton organization via its interaction with the SmRho1.1 isoform.

L'expression des facteurs de transcription C/EBPs est induite dans les cellules épithéliales intestinales lorsque celles-ci sont stimulées avec certaines cytokines. Cette famille de facteurs de transcription joue un rôle très important dans l'élaboration de la phase aiguë de la réponse inflammatoire (APR) dans plusieurs tissus en régularisant l'expression de certains gènes de réponse inflammatoire. Nous avons déjà démontré que différents domaines de l'isoforme C/EBP[minuscule delta] sont impliqués dans le contrôle de son activité transcriptionnelle, mais très peu de choses sont connues sur la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. L'objectif de notre recherche était de déterminer le rôle des histones désacétylases dans la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. Nous avons observé par essai d'interactions in vitro et in vivo, que deux histones désacétylases, HDAC1 et HDAC3, interagissent avec les domaines N et C-terminaux de C/EBP[minuscule delta]. L'intégrité du bZIP (région basique et leucine zipper) est nécessaire pour la liaison de HDAC1 et HDAC3 au domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Les acides aminés 70 à 85 de C/EBP[minuscule delta] sont importants pour la liaison à HDAC1, ainsi que les acides aminés 50 à 60. Il y a un site de liaison de HDAC3 entre les acides aminés 60 à 70 de C/EBP[minuscule delta] et un autre entre les acides aminés 108 à 164. Nos résultats suggèrent que la liaison de HDAC1 à C/EBP[minuscule delta] est indirecte et pourrait être en partie médiée par la protéine mSin3A puisque ce co-répresseur lie le domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Par ailleurs, nous avons également montré qu'une histone désacétylase de classe II, soit HDAC4, pouvait également interagir avec C/EBP[minuscule delta] par ces deux domaines. Nos observations suggèrent que l'interaction des histones désacétylases avec C/EBP[minuscule delta] pourrait impliquer d'autres protéines que celles jusqu'à maintenant identifiées. Nous montrons également par transfections transitoires et essai luciférase que HDAC1 et HDAC3 modulent négativement l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de l'haptoglobine. Ces deux histones désacétylases de classe I pourraient donc jouer un rôle prépondérant dans la régulation négative de l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de gènes cibles.

Friedreich’s ataxia (FRDA) is an inherited recessive disorder characterized by progressive neurological disability and heart disease. It is caused by a pathological intronic hyperexpansion of a GAA repeat in the FXN gene, encoding the essential mitochondrial protein frataxin. At the homozygous state, the GAA expansion induces a heterochromatin state with decreased histone acetylation and increased methylation, resulting in a partial deficiency of frataxin expression. This was established in cells from FRDA patients. We showed that the same chromatin changes exist in a GAA based mouse model, KIKI, generated in our laboratory. Furthermore, treatment of KIKI mice with a novel Histone Deacetylase Inhibitor (HDACi), 106, a pimelic diphenylamide that increases frataxin levels in FRDA cell culture, restored frataxin levels in the nervous system and heart of KIKI mice and induced histone hyperacetylation near the GAA repeat. As shown by microarrays, most of the differentially expressed genes in KIKI were corrected towards wild type. In an effort to improve the pharmacological profile of compound 106, we synthesized more compounds based on its structure and specificity. We characterized two of these compounds in FRDA patients’ peripheral blood lymphocytes and in the KIKI mouse model. We observed a sustained frataxin upregulation in both systems, and, by following the time course of the events, we concluded that the effects of these compounds last longer than the time of direct exposure to HDACi. Our results support the pre-clinical development of a therapeutic approach based on pimelic diphenylamide HDACis for FRDA. Laboratory tools to follow disease progression and assess drug efficacy are needed in a slowly progressive neurodegenerative disease such as FRDA. We used microarrays to characterize the gene expression profile in peripheral lymphocytes from FRDA patients, carriers and controls. We identified gene expression changes in heterozygous, clinically unaffected GAA expansion carriers, suggesting that they present a biochemical phenotype, consistent with data from animal models of frataxin deficiency. We identified a subset of genes changing in patients as a result of pathological frataxin deficiency establishing robust gene expression changes in peripheral lymphocytes. These changes can be used as a biomarker to monitor disease progression and potentially assess drug efficacy. To this end, we used he same methodology to characterize the gene expression profiles in peripheral lymphocytes after treatment with pimelic diphenylamide HDACi. This treatment had relevant effects on gene expression on peripheral patients’ blood lymphocytes. It increased frataxin levels in a dose-dependent manner, and partially rescued the gene expression phenotype associated with frataxin deficiency in the tested cell model, thus providing the first application of a biomarker gene set in FRDA. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Résumé<p>L’objectif de ce travail a été d’évaluer la toxicité du butyrate de sodium (NaBu), un inhibiteur des<p>histones désacétylases (HDACs), et ses mécanismes d’action sur les cellules de cancer du sein<p>humain, les cellules MCF-7 déficientes pour la caspase-3, et lignées dérivées :les cellules MCF-<p>7/caspase-3, et les cellules VCREMS résistantes à la vincristine, et dans une moindre mesure à la<p>doxorubicine. La contribution de l’apoptose dans la létalité induite par le NaBu a été recherchée<p>dans les cellules MCF-7wt en estimant l’exposition de la phosphatidylsérine ainsi que le clivage de<p>la PARP. La présence de caspase-3, n’a ni amplifié ni accéléré l’apoptose qui a impliqué le<p>rhéostat Bax/Bcl-2 en faveur d’une induction de Bax. La cytostasie du NaBu dans les cellules<p>MCF-7 s’est manifestée par un blocage des cellules en phase G2/M. L’évaluation du niveau<p>d’expression des régulateurs du cycle cellulaire dans les cellules MCF-7wt et MCF-7/caspase-3 a<p>montré une surexpression de p21, de façon indépendante de p53. L’action cytostatique du NaBu<p>a été associée à une accumulation légère et modeste des formes non-phosphorylées de pRB, un<p>facteur dont la phosphorylation par les complexes cycline D/cdk4,6 et cycline E/cdk2 est<p>nécessaire à la transition G1/S. Dans ces conditions, les niveaux de cdk2 et de Cdc25A, une<p>oncoprotéine activatrice de cdk2, sont restés stables. Le NaBu est une molécule à effet<p>pléïotropique, l’utilisation de la trichostatine A, inhibiteur par excellence des HDACs, a permis<p>d’établir la relation de causalité entre l’inhibition des HDACs et la toxicité du NaBu. La plupart<p>des inhibiteurs des HDACs induisent l’apoptose en perturbant le métabolisme oxydatif de la<p>mitochondrie ce qui pourrait modifier le statut redox cellulaire. Nous avons cherché une<p>implication du métabolisme du glutathion (GSH), le thiol anti-oxydant non-protéique majoritaire<p>de la cellule, dans la toxicité induite par le NaBu. Les résultats montrent que le NaBu induit une<p>déplétion du GSH dans les cellules MCF-7wt et dérivées de façon dose-dépendante, corrélée avec<p>la mortalité cellulaire. Devant l’éventualité d’une consommation accrue de GSH par les enzymes<p>associées à son métabolisme, nous avons évalué le niveau des activités des enzymes glutathion<p>peroxydase, glutathion réductase et glutathion S-transférases. Dans les cellules MCF-7, le NaBu a<p>induit de façon significative ces enzymes anti-oxydantes, à l’exception des GSTs, de même que la<p>catalase, une enzyme indépendante de ce système. Les expériences visant à libérer le pool de<p>GSH lié aux protéines ont montré que la déplétion du GSH intracellulaire est parallèle à celle du<p>GSH lié aux protéines. Par conséquent, la consommation du GSH est réellement la cause de la<p>chute du niveau de GSH générant un stress oxydant. La doxorubicine, un inhibiteur des<p>topoisomérases, a une utilisation clinique limitée en raison de ses effets secondaires irréversibles<p>(cardiotoxicité entre autres). Dans le but d’améliorer son efficacité, nous avons expérimenté des<p>combinaisons NaBu/doxorubicine sur les cellules VCREMS et MCF-7, étant donné la capacité<p>du NaBu à induire l’expression des topoisomérases et favoriser la conformation déployée de la<p>chromatine. L’utilisation de la technique isobologramme nous a permis de déterminer les index<p>de combinaison pour une application simultanée ou séquentielle des drogues. Les résultats<p>indiquent que le NaBu sensibilise les cellules VCREMS et MCF-7 à l’action de la doxorubicine.<p>Dans les cellules VCREMS, cet effet s’est produit en dépit de la stimulation des enzymes de<p>détoxication, GSTs et GPX. L’ensemble de ces résultats indique que l’utilisation du NaBu en<p>combinaison avec certains anticancéreux constitue une stratégie très intéressante en<p>cancérothérapie. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La sénescence cellulaire, ou l’arrêt irréversible de la prolifération, influence des processus physiologiques et pathologiques, comme le cancer. Parmi les caractéristiques de la sénescence, se retrouve le PSAS ou phénotype sécrétoire associé à la sénescence. Le PSAS est composé d’une variété de cytokines, facteurs de croissance et protéases. Ses actions pro- et anti-tumorale sont connues, mais l’on ignore laquelle prédomine. Mes travaux s’attardent aux effets du PSAS sur l’induction de la sénescence dans les cellules environnantes et à sa régulation. Nous avons démontré que le PSAS ne synergise pas avec la dysfonction télomérique chronique ou aigue, afin de causer un arrêt de croissance. Également, l’étude du mécanisme responsable de l’induction de la sénescence par stress à la chromatine, suggère que la kinase c-Abl n’est pas requise pour cette voie, contrairement à des publications antérieures. Mes travaux éclairent les mécanismes d’action et la régulation du PSAS dans la sénescence induite par dysfonction télomérique et par stress à la chromatine. / Cellular senescence, or irreversible proliferation arrest, is known for its influence on physiological and pathological processes, such as cancer. Among the features found in the senescent phenotype is the inflammatory secretome, also known as the senescence associated secretory phenotype (SASP). The SASP consists of a variety of factors such as cytokines, growth factors and proteases. It is widely recognized that SASP can have either a pro- or anti-tumor effect, but it is not clear which one predominates. My work focused on the SASP effects on the induction of senescence in surrounding cells and its regulation mechanisms. We demonstrated that the SASP does not synergize with chronic or induced telomere dysfunction to cause cellular proliferation arrest. Also, study of chromatin stress-induced senescence mechanism suggests that kinase c-Abl is not required for this pathway, contrary to what had been previously published. My work helps understand the regulatory and working mechanisms of the SASP in chromatin stress-induced and telomere dysfunction-induced senescence models.

L’infection par HIV-1 représente un des problèmes de santé publique majeurs de notre société actuelle. Le traitement HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy) inhibe le cycle réplicatif viral mais ne permet pas l’éradication du HIV-1. La principale cause de cet échec thérapeutique est la persistance de réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HIV-1, qui, lors de l’arrêt du traitement HAART, sont à l’origine d’un rebond de la charge plasmatique virale. Le défi actuel est donc de découvrir de nouvelles méthodes d’élimination des cellules réservoirs. Une des stratégies envisagées est de forcer l’expression virale dans les cellules infectées de manière latente afin d’entraîner leur destruction suite à leur détection par le système immunitaire ou suite aux effets cytopathiques viraux. Parallèlement, le traitement HAART serait maintenu afin de limiter la propagation des virions néo-synthétisés. Plusieurs éléments sont impliqués dans la répression transcriptionnelle associée à la latence post-intégrationnelle du virus HIV-1 :la nature du site d’intégration ;l’absence de facteurs cellulaires inductibles tels que NF-κB ;la structure chromatinienne du provirus et les modifications post-traductionnelles des histones ;l’absence de niveaux suffisants de la protéine trans-activatrice Tat. De plus, notre laboratoire a précédemment mis en évidence un lien entre deux de ces éléments, en démontrant, dans une lignée modèle de latence post-intégrationnelle, que la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un activateur de la voie de signalisation NF-κB, permet une réactivation synergique de l’expression virale combinée à l’inhibiteur d’histone-désacétylases (HDACI) TSA. Cependant, l’utilisation thérapeutique du TNFα et de la TSA est inenvisageable en raison de leurs toxicités.<p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished