Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2003. / Titre provenant de l'écran-titre.

Die Entwicklung der Hypophyse ist ein komplexer Prozess, an dem viele Transkriptionsfaktoren beteiligt sind. Bedeutende Funktionen haben die Bone Morphogenetic Proteins 2, 4 und 7. Ziel der Arbeit war es, an Patienten mit angeborener kombinierter Hypophyseninsuffizienz diese 3 Gene auf Mutationen zu untersuchen. Dabei wurden die Exons, Exon-Intron-Übergänge sowie die 3`- und 5`-untranslatierten Regionen sequenziert. Neu identifizierte Varianten wurden anschließend in einer gesunden Kontrollkohorte untersucht, um pathogenetisch nicht relevante Genvarianten auszuschließen. Um die funktionelle Relevanz der Varianten beurteilen zu können, wurden phylogenetische Analysen und Untersuchungen mittels Programmen zum Einfluss auf die Proteinstruktur und -funktion durchgeführt. Neben bekannten Varianten, konnten wir neue Varianten mit und ohne Aminosäureaustausch identifizieren. Eine neue Mutation im kodierenden Bereich von BMP4 erschien dabei besonders relevant. Wir konnten sie nur bei einem Patienten nachweisen, der zusätzlich zur kombinierten Hypophyseninsuffizienz Skelettveränderungen aufwies. Die hohe Konservierung und diese spezifische Klinik legen eine funktionelle Relevanz nahe.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'embryologie de la surrénale humaine et la pathogénie de l'hypoplasie congénitale des surrénales sont mal connues et complexes. L'une pouvant expliquer l'autre, nous présentons, à partir de 119 fœtus humains normaux de12 à 36 semaines de développement (SD), une étude cinétique histologique et moléculaire de la surrénale fœtale et nous décrivons 3 cas d'hypoplasie surrénalienne. Après un rappel des mécanismes moléculaires connus, régulant ensemble l'embryologie surrénalienne, gonadique et hypophysaire et ceux de l'hypoplasie surrénale congénitale, nous présentons nos résultats. Dans la corticosurrénale humaine fœtale normale, les cellules du cortex permanent prolifèrent et, dès la 12ème SD, expriment la NCAM, la 3β-HSD et la P450 c21. Elles ont la capacité de synthétiser des minéralocorticoïdes et/ou du cortisol. Les cellules du cortex fœtal ne prolifèrent pas et expriment ni la 3β-HSD, ni la NCAM. La médullosurrénale est formée par des neuroblastes immatures (CgA-, NCAM+) qui migrent et prolifèrent de la périphérie vers le centre de la glande, où ils se différencient en neuroblastes matures (CgA+). Dans les deux cas d'hypoplasie surrénale de type anencéphalique, avec absence de mutation de DAX-1 et de SF-1, la dysembryoplasie surrénalienne est probablement d'origine hypophysaire, par absence de cellules gonadotropes. Dans le 3ème cas, jamais décrit, associant un RCIU, une hypoplasie surrénalienne congénitale, une ambiguïté sexuelle, une absence de différenciation des cellules antéhypophysaires, l'absence de mutation de gènes connus (DAX-1, SF-1, SRY, FGF9, SOX2, SOX3, SOX5 et SOX9) suggère l'existence de nouveaux gènes régulant la différenciation précoce de ces trois glandes endocrines.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'hypophyse antérieure assure une interface endocrine entre le cerveau et les organes périphériques. En effet, cette glande sécrète de manière pulsatile ses différentes hormones dans la circulation générale sous l'influence de facteurs hypothalamiques déversés épisodiquement dans le système porte de l'éminence médiane. Toutefois, l'influence hypothalamique ne saurait à elle seule expliquer l'harmonisation des sécrétions des cellules d'un même type endocrine, qui sont distribuées de manière hétérogène au sein du parenchyme. Il existe sans doute des mécanismes permettant de coordonner l'activité des cellules endocrines à l'échelle de la glande entière. Au cours de cette thèse, nous avons montré la présence d'un mécanisme de communication intra-hypophysaire permettant un transfert rapide d'information au sein d'un réseau de cellules non-endocrines, les cellules folliculostellaires (FS). Ce travail réalisé sur des tranches épaisses d'hypophyse de rat, modèle qui maintient intacte l'architecture cordonale du tissu, a permis de mettre en évidence l'excitabilité membranaire des cellules FS, propriété jusqu'alors inconnue. Cette excitabilité sert de base à l'initiation de vagues calciques, qui peuvent se propager rapidement via des jonctions gap à des régions éloignées de la glande. Nous avons également étudié la libération d'interleukine-6 (IL-6) par les cellules FS. Cette cytokine est connue pour stimuler l'ensemble des sécrétions hormonales hypophysaires. La production d'IL-6 est stimulée par le PACAP. Ce neuropeptide semble agir directement au niveau du gène, et son effet dépend de l'état des communications intercellulaires au sein du réseau. Les cellules FS pouvant répondre à des stimuli d'origine centrale et périphérique, ainsi que dialoguer avec les cellules endocrines, l'ensemble de ces résultats montre que le réseau de cellules FS pourrait fournir un mécanisme efficace qui coordonnerait le fonctionnement de la glande en fonction des différents états physiologiques

De nombreux modèles ont été proposés pour expliquer les mécanismes de développement et de progression tumorale, néanmoins certains aspects comme la nature et la hiérarchie des altérations primaires et secondaires sont encore discutés. Pour répondre à ces questions, nous nous sommes intéressés à la progression tumorale des tumeurs hypophysaires à prolactine humaines. Ces tumeurs d'origine monoclonale sont souvent bénignes mais certaines présentent un phénotype agressif voire malin. Afin d'identifier les mécanismes impliqués dans la progression vers le phénotype agressif nous avons utilisé des techniques de génomique intégrative (puces à ADN, séquençage haut débit) couplant l'étude du transcriptome, du génome (variation du nombre de copie chromosomique, polymorphismes) et du miRNome à partir des mêmes échantillons tumoraux. Par cette stratégie nous avons identifié et hierarchisé des altérations spécifiques des tumeurs agressives et / ou malignes dans un modèle expliquant la progression tumorale des tumeurs hypophysaires à prolactine humaines. Nous avons montré que la sous-expression des microARNs miR-183, miR-744 et miR-98 stimule la prolifération via la surexpression de leurs cibles KIAA0101, TGFB1 et E2F2 spécifiquement dans les tumeurs agressives. Ceci entraine l'acquisition d'altérations chromosomiques (perte du chromosome 11 et le gain du chromosome 1q) permettant l'activation de la dissémination métastatique. Enfin, ce travail montre que l'approche de génomique intégrative multidimensionnelle permet d'apporter de nouveaux éléments pour la caractérisation des phénotypes tumoraux, le diagnostic des tumeurs agressives et la prédiction du comportement tumoral

L’antéhypohyse est une glande endocrine maitresse produisant 6 hormones (GH, TSH, ACTH, PRL, FSH et LH) qui régulent des processus vitaux comme la croissance. Chez l’Homme, des mutations des gènes impliqués dans l’ontogénèse pituitaire sont responsables de déficit(s) isolé (IGHD) ou multiples (CPHD) en hormones antéhypophysaires, pouvant être syndromique(s). L’incidence de ces déficits est d’environ 1/8000 naissances. A ce jour, des mutations rapportées dans une trentaine de gènes permettent d’expliquer cette affection chez seulement 25% des patients. Le premier objectif de ce travail de thèse était d’identifier de nouveaux gènes responsables de déficit antéhypophysaire par une approche « gènes candidats », et par des analyses d’exome couplées à une cartographie par homozygotie. Nous avons pu mettre en évidence des variations dans les gènes NOG, VAX1 et GSX1, impliqués dans l’ontogénèse pituitaire murine, et identifier d’autres gènes potentiellement clés dans le développement de l’hypophyse. L’autre objectif était de caractériser la fonction de LHX4, GHRHR, GLI2 et GSX1 à travers l’étude fonctionnelle des variants identifiés au laboratoire. L’implication de nouveaux variants génétiques de LHX4, GHRHR et GLI2 a permis de préciser le spectre phénotypique associé aux mutations de chacun de ces gènes, et aussi de préciser le rôle de LHX4 dans le réseau moléculaire complexe nécessaire à la formation de l’hypophyse. La compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine du développement pituitaire devrait permettre à terme une meilleure prise en charge de cette pathologie très hétérogène, incluant le conseil génétique des familles concernées et le traitement des patients. / The anterior pituitary is a master endocrine gland producing 6 hormones (GH, TSH, ACTH, PRL, FSH and LH) that regulate essential life processes such as growth. In the human, mutations in genes encoding morphogenes and transcription factors implicated in pituitary ontogenesis are responsible for isolated (IGHD) or combined (CPHD) pituitary hormone deficit(s) that can be syndromic. The incidence of those deficits is close to 1/8,000 births. So far, mutations reported in about thirty genes explain only 25% of the cases. The first goal of this thesis was to identify new genes responsible for pituitary hormone deficits through a candidate gene approach, and by whole-exome sequencing coupled with homozygosity mapping, using a large cohort of more than 3000 DNA samples collected by the laboratory since 1997.We found variations in NOG, VAX1 and GSX1 genes, all involved in mouse pituitary ontogenesis, and we identified potentially key genes for pituitary developpment.The other aim of this work was to characterize the function of LHX4, GHRHR, GLI2 and GSX1 through the functional evaluation of the variants identified in the laboratory. The implication of new disease-causing genetic variants in LHX4, GHRHR and GLI2 allowed us to delineate the phenotypic spectrum associated with mutations for each gene, and also to precise the role of LHX4 in the complex molecular network required for proper pituitary development. A better understanding of the molecular mecanisms involved in pituitary formation should lead to new ways for management of this heterogenous condition, including genetic counseling and therapeutic decisions in affected families.

Stressfaktoren begegnen uns sehr häufig in unserem tagtäglichen Leben und können sowohl positive als auch negative Effekte auf unser Wohlbefinden haben. Während akuter Stress motivierend oder auch leistungssteigernd wirken kann, wird chronischer Stress meist zur Belastung. Langanhaltender Stress wurde bereits mehrfach mit psychischen Erkrankungen wie Depressionen, aber auch systemischen Erkrankungen wie Diabetes in Verbindung gebracht. Der Körper reagiert auf Stress über eine Aktivierung des endokrinen Stresssystems, welches über das Gehirn gesteuert wird und gezielt die Ausschüttung von Stresshormonen kontrolliert. Diese Hormone ermöglichen beispielsweise den erhöhten Energiebedarf bei Stress und regulieren andererseits ihre eigene Aktivität über ein negatives Feedback. Die Stressantwort ist demnach ein essenzielles Netzwerk verschiedener Organe und bedarf einer genauen Regulierung. Es konnte gezeigt werden, dass chronischer Stress oder frühkindlicher Stress dieses System dauerhaft verändern kann, was eine erhöhte Wahrscheinlichkeit einer späteren Erkrankung zur Folge haben kann. Die zugrundeliegenden Ursachen hierfür sind bis heute nicht vollständig geklärt. Eine Theorie besagt, dass Stammzellen in endokrinen Drüsen einen Anteil an chronischen Veränderungen haben könnten. Es wurde bereits gezeigt, dass der Hypothalamus, die Hypophyse und die Nebennierenrinde Stammzellen aufweisen. Die Funktion dieser Stammzellen ist noch nicht vollständig aufgeklärt und insbesondere der Einfluss von Stress auf diese Zellen oder der Zellen auf die Stressantwort ist weitestgehend unbekannt. Die Stammzellen der Organe weisen unterschiedliche Merkmale auf und sind nicht direkt miteinander vergleichbar. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass sie durch einen Signalweg reguliert werden, den YAP/TAZ Signalweg, welcher zuvor bereits mit Stress und Belastungsstörungen in Verbindung gebracht wurde. Das Ziel dieser Studie war demnach, aufzuklären, ob dieser Signalweg in Hypophyse und Nebennierenrinde durch Stress beeinflusst wird und ob dies eine Regulation der Stammzellen in den jeweiligen Organen zur Folge hat. Die Regulierung der Stammzellpopulationen wurde zunächst in einem Stressmodell charakterisiert. Anschließend wurden molekulare Methoden, wie RT-qPCR, RNAscope mRNA in situ Hybridisierung, Western Blot und Immunofluoreszenz, für weitere Analysen herangezogen. Stammzellen des Nebennierencortex und der Hypophyse wurden zusätzlich in vitro kultiviert, um ihre Regulierung weiter zu analysieren. Es wurde zuerst der YAP/TAZ Signalweg im Detail in der Nebennierenrinde analysiert. Es konnte aufgezeigt werden, dass die Komponenten des Signalwegs zwar in der ganzen Nebennierenrinde exprimiert wurden, der Transkriptionsfaktor YAP hingegen hauptsächlich in den äußersten Zellschichten aktiv war, wo auch die Stammzellen lokalisiert sind. YAP und auch klassische Zielgene wie Ctgf wurden außerdem in den Zellen gefunden, welche in vorherigen Studien durch spezifische Marker als Vorläuferzellen oder Stammzellen definiert wurden. Ein anschließend durchgeführtes Stressexperiment zeigte auf, dass insbesondere Ctgf vermehrt in der Stammzellnische exprimiert wurde. Die Vorläuferzellen in der Nebennierenrinde werden normalerweise hauptsächlich durch den WNT Signalweg reguliert, welcher durch Stress inhibiert wurde. Da dies in vorherigen Studien als wichtiger Schritt zur Neubildung von Zellen aus den Vorläuferzellen aufgezeigt wurde, wurden zusätzlich Nebennieren von Glucocorticoid-behandelten Mäusen analysiert, welche eine Nebennierenrindenatrophie und verringerte Zelldifferenzierung aufzeigten. Diese zeigten eine dem Stress gegensätzliche Aktivität der beiden Signalwege auf. In einem Zellkulturmodell konnte aufgezeigt werden, dass die Regulation der beiden Signalwege während des Differenzierungsprozesses in vitro die Regulation der Signalwege während der Stressantwort in vivo widerspiegelten. Dasselbe Stressprotokoll wurde dann herangezogen, um die Regulation des YAP/TAZ Signalweges in der Adenohypophyse zu analysieren. Die Stammzellpopulation in der Hypophyse wird generell durch den Marker SOX2(+) definiert und wird unter anderen durch den YAP/TAZ Signalweg reguliert. Wiederholter Stress führte zu einer stark erhöhten Genexpression klassischer YAP/TAZ Zielgene, Ctgf und Cyr61. Beide wurden in den SOX2(+) Zellen der Adenohypophyse exprimiert, was einen potenziellen Einfluss von Stress auf SOX2(+) Zellen suggerierte. Die Daten ließen aber vermuten, dass diese Zellen keine erhöhte Proliferations- oder Differenzierungsrate aufwiesen. Vielmehr zeigten in vitro Studien auf, dass SOX2(+) Zellen CTGF ausschütteten, um potenziell über parakrine Signalwege benachbarte Zellen zu beeinflussen. Weitere Untersuchungen legten dar, dass Glucocorticoide die Ctgf Expression und Ausschüttung des Signalpeptids in den SOX2(+) Zellen vermehrt anregten. Diese Ergebnisse deuten also darauf hin, dass das negative Feedback von der Nebenniere in Stress auch Stammzellen in der Hypophyse beeinflussen könnte, welche wiederum eine Rolle in der Regulation der hormonproduzierenden Zellen über parakrine Signalwege haben könnten. Zusammenfassend demonstriert die vorliegende Arbeit, dass Stress einen Einfluss auf Signalwege in der endokrinen Stressachse haben kann, welche Vorläuferzellpopulationen in verschiedenen Organen beeinflussen können. Dies kann verschiedene Konsequenzen für das jeweilige Organ haben und Vorläuferzellen könnten so die Stressantwort im Allgemeinen beeinflussen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass ein weitreichenderes Verständnis der Regulation von Stammzellen in Stress helfen könnte, die zugrundeliegenden Ursachen der Krankheitsentstehung in Folge von chronischem oder frühkindlichem Stress zu verstehen.