The ability to reprogram adult somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells could provide a valuable implement for in vitro disease modeling and drug discovery. More importantly, they may potentially serve as an unlimited source of cells for regenerative medicine. However, most of the iPS cells have been generated by retroviral vectors, and therefore they carry the risk of viral integration into the host genome. This problem prevents their use for clinical applications and regenerative medicine. mRNA-mediated delivery of reprogramming factors is an alternative approach for cellular reprogramming. mRNA-based reprogramming offers the advantage of being completely free of genomic integration and is therefore highly suitable for clinical translation. However, there are some limitations which must be overcome so that mRNA can be widely used for successful cellular reprogramming. In the current thesis, the attempt was to generate stable mRNA-iPS cells through overcoming those limitations. Several human donor cells were transfected with mRNA encoding reprogramming factors and the generation of two stable mRNA-iPS cell lines was shown. The resultant mRNA-iPS colonies were assessed for pluripotency markers. Their pluripotency features were evaluated by the viral-iPS cells produced by conventional retroviral vectors. It was noticed that the generation of mRNA-iPS cells was largely affected by the parental cells from which they were derived. However, characterization and evaluation of the generated mRNA-iPS cells proved their pluripotency states comparable to the viral-iPS cells. On the other hand, the aging hallmarks of the iPS cells were assessed in the second part of this thesis. The potential aging signatures of the iPS cells should be conducted before their use in clinical applications. Currently, there are controversial data regarding the ability of reprogramming to fully rejuvenate an aged somatic cell and reverse agerelated changes such as shortened telomeres, dysfunctional mitochondria and DNA damage. Moreover, mixed findings have been published regarding whether the iPS cells are fully rejuvenated or they might retain some of the aging hallmarks from the cells which they were derived. This thesis studied these controversies through the investigation of three hallmarks of aging including telomere length, mitochondrial alteration and DNA damage. Telomere elongation was indicated in the iPS cells. Furthermore, mitochondrial morphology and function were improved into more immature features in iPS cell lines than their corresponding fibroblasts. Moreover, the iPS cell lines were shown to have less amount of DNA damage compared to their parental fibroblasts. In summary, it can be concluded that generation of mRNA-iPS cells is largely affected by the primary donor cells from which they are derived. Furthermore, it seems that reprogramming enables reversion of aging signatures to a more youthful state.

The ability to reprogram adult somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells could provide a valuable implement for in vitro disease modeling and drug discovery. More importantly, they may potentially serve as an unlimited source of cells for regenerative medicine. However, most of the iPS cells have been generated by retroviral vectors, and therefore they carry the risk of viral integration into the host genome. This problem prevents their use for clinical applications and regenerative medicine. mRNA-mediated delivery of reprogramming factors is an alternative approach for cellular reprogramming. mRNA-based reprogramming offers the advantage of being completely free of genomic integration and is therefore highly suitable for clinical translation. However, there are some limitations which must be overcome so that mRNA can be widely used for successful cellular reprogramming. In the current thesis, the attempt was to generate stable mRNA-iPS cells through overcoming those limitations. Several human donor cells were transfected with mRNA encoding reprogramming factors and the generation of two stable mRNA-iPS cell lines was shown. The resultant mRNA-iPS colonies were assessed for pluripotency markers. Their pluripotency features were evaluated by the viral-iPS cells produced by conventional retroviral vectors. It was noticed that the generation of mRNA-iPS cells was largely affected by the parental cells from which they were derived. However, characterization and evaluation of the generated mRNA-iPS cells proved their pluripotency states comparable to the viral-iPS cells. On the other hand, the aging hallmarks of the iPS cells were assessed in the second part of this thesis. The potential aging signatures of the iPS cells should be conducted before their use in clinical applications. Currently, there are controversial data regarding the ability of reprogramming to fully rejuvenate an aged somatic cell and reverse agerelated changes such as shortened telomeres, dysfunctional mitochondria and DNA damage. Moreover, mixed findings have been published regarding whether the iPS cells are fully rejuvenated or they might retain some of the aging hallmarks from the cells which they were derived. This thesis studied these controversies through the investigation of three hallmarks of aging including telomere length, mitochondrial alteration and DNA damage. Telomere elongation was indicated in the iPS cells. Furthermore, mitochondrial morphology and function were improved into more immature features in iPS cell lines than their corresponding fibroblasts. Moreover, the iPS cell lines were shown to have less amount of DNA damage compared to their parental fibroblasts. In summary, it can be concluded that generation of mRNA-iPS cells is largely affected by the primary donor cells from which they are derived. Furthermore, it seems that reprogramming enables reversion of aging signatures to a more youthful state.

A striking feature of Parkinson's disease (PD) is that the distal axonal terminals of neurons degenerate prior to the soma, a process referred to as 'dying-back'. Another hallmark of the disease is the pathological accumulation of abnormal protein aggregates in soma and axons. Lysosomes, a critical component of the protein quality control machinery, have thus been thought to be altered in PD. LRRK2 G2019S, a gain-of-kinase-function mutation, is one of PD's most common known causative mutations, and LRRK2-specific small molecule inhibitors have been developed as possible therapeutics. However, LRRK2 G2019S is incompletely penetrant, and its role in axonal degeneration is unclear. LRRK2 phosphorylates a subset of Rab GTPases, including Rab10. Since Rab GTPases are mediators of organelle trafficking, we speculated that LRRK2 G2019S affects the transport of organelles, such as lysosomes, thereby contributing to early PD pathogenesis. Using neural progenitor cell-derived neurons from two LRRK2 G2019S-PD patients; we developed a model of axonal trafficking of lysosomes to characterize the impact of mutant LRRK2 on lysosomal trafficking. In comparison to their isogenic gene-corrected controls, we observed a subtle reduction in mutant axonal lysosomal speed, which could indicate that mutant LRRK2 mildly disrupts retrograde lysosomal transport. We also observed that this trafficking phenotype was only partially rescued by LRRK2 kinase inhibitors, which could indicate the importance of other factors regulating axonal transport. Consistent with this idea, we found that mutant LRRK2 was associated with increased co-localization of phosphorylated Rab10 on a small subset of distal axonal lysosomes. Furthermore, the over-expression of Rab10 only mildly affected lysosomal trafficking in axons. Interestingly, damaging the lysosomal membrane increased LRRK2-dependent Rab10 phosphorylation, leading us to speculate that membrane damage in the axon might induce LRRK2 activity. Since lysosomes have been shown to mediate plasma membrane repair, we speculated that membrane damage might exacerbate LRRK2-dependent phenotypes in distal axons. Axotomy was used to test this idea, and we observed an inconsistent delay in the regrowth of mutant axons after axotomy. Moreover, we identified an association between mutant LRRK2 and the transient increase in lysosomes at the injury site, indicating that LRRK2 G2019S might potentially affect damage-prone distal axons. Since the LRRK2 G2019S-associated phenotypes observed in our assays were relatively mild in one isogenic pair, we were curious about the clinical and genetic phenotypes of the patients from whom the somatic cells for neural progenitor cell generation were sourced. Interestingly, we observed that clinical features of PD, including age-of-onset, motor symptoms, cognitive impairment, and the level of cerebrospinal fluid biomarkers, were heterogeneous between the two patients. Additionally, genetic analysis of specific PD risk-associated loci in MAPT and SNCA revealed that one patient was more at risk of developing PD than the other, indicating influence from genetic factors in addition to LRRK2 G2019S. These factors might affect the axonal phenotypes observed in our assays. Overall, we have developed assays to investigate the effects of LRRK2 G2019S on axonal lysosomes. These assays can potentially be a useful tool to better understand early pathogenesis in heterogeneous PD patients and test targeted therapeutics that can be successful over an eclectic cohort of PD patients, all of whom are diagnosed based on deteriorating motor symptoms.:TABLE OF CONTENTS I LIST OF FIGURES IV LIST OF TABLES VI ABBREVIATIONS VII 1 INTRODUCTION 1 1.1 Neurodegenerative diseases 1 1.2 Parkinson’s disease 2 1.2.1 General Features 2 1.2.2 Phenomenon of “dying back” in PD 6 1.2.3 Contribution of axonal architecture and function to “dying back” 7 1.2.4 Etiology of PD 10 1.2.4.1 Environmental factors 10 1.2.4.2 Genetic factors linked to axonal function 11 1.3 Lysosomes 12 1.3.1 Composition and biogenesis of lysosomes 13 1.3.2 Lysosomes as digestive centers 15 1.3.3 Lysosomes as secretory organelles 18 1.3.4 Lysosomes in PD 20 1.3.4.1 Genetic PD factors linked to lysosomal function 21 1.4 Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) 22 1.4.1 LRRK2 domain organization and function 22 1.4.2 Clinical features of PD patients with LRRK2 mutations (LRRK2-PD) 24 1.4.3 LRRK2 animal models 24 1.4.4 LRRK2 induced pluripotent stem cell (iPSC)-based models 25 1.4.5 Animal and iPSC-based models demonstrate a role for LRRK2 in the endo-lysosomal system 27 1.4.6 LRRK2 kinase inhibitors 30 2 AIMS OF THE THESIS 32 3 MATERIALS AND METHODS 33 3.1 Materials 33 3.1.1 Chemicals 33 3.1.2 Purchased kits 34 3.1.3 Plasmids 34 3.1.4 Antibodies 35 3.1.5 Dyes 36 3.1.6 Primers and oligonucleotides 36 3.1.7 Cell culture media and reagents 37 3.1.8 Small molecules 38 3.1.9 Compounds 38 3.1.10 Cell culture media 39 3.1.11 Human Neural Progenitor Cell (NPC) lines 40 3.2 Methods 41 3.2.1 Ethics statement 41 3.2.2 Licenses 41 3.2.3 Information about iPSC and NPC line generation 41 3.2.4 Preparation of cell culture coated plates 41 3.2.5 Maintenance of NPCs 42 3.2.6 Differentiation of NPCs to neurons 42 3.2.7 Preparation of microfluidic chambers 43 3.2.8 Seeding neurons as single cells 44 3.2.9 HEK293T cell culture 45 3.2.10 Treatment of neurons with compounds 45 3.2.11 Genomic DNA isolation 46 3.2.12 Polymerase-Chain Reaction (PCR) 46 3.2.13 Agarose gel electrophoresis 46 3.2.14 Plasmid DNA isolation 46 3.2.15 Lentiviral vector production 47 3.2.16 Lentiviral infection of human neurons 48 3.2.17 Protein isolation and quantification 48 3.2.18 Capillary electrophoresis 49 3.2.19 Axotomy 49 3.2.20 Immunostaining 50 3.2.21 Live cell imaging 51 3.2.22 Quantification of axonal trafficking using kymographs 52 3.2.23 Quantification of axonal trafficking using an object based method 53 3.2.24 Apotome imaging and quantification 54 3.2.25 Confocal imaging and quantification 54 3.2.26 Clinical and biomarker data collection 55 4 RESULTS 57 4.1 Establishing an axonal lysosomal trafficking assay 57 4.1.1 NPCs from LRRK2 G2019S patients and their respective isogenic controls differentiate into neurons 57 4.1.2 Axons can be spatially separated from soma and dendrites 60 4.1.3 Setting up the axonal trafficking assay 62 4.2 Axonal lysosomal trafficking assay detects LRRK2 G2019S associated changes in lysosome movement 65 4.3 Axonal lysosomal trafficking assay detects partial rescue by a small molecule LRRK2 inhibitor 71 4.4 LRRK2 G2019S is associated with an increase in the proportion of lysosomes co-localizing with phosphorylated Rab10 76 4.5 Rab10 over-expression mildly affects lysosomal trafficking in axons 78 4.6 Lysosomal membrane damage increases LRRK2-mediated Rab10 phosphorylation 81 4.7 LRRK2 G2019S is not associated with consistent effects on long-term axonal regrowth after axotomy 82 4.8 LRRK2 G2019S is associated with transient accumulation of lysosomes at the injury site after axotomy 86 4.9 Assessment of clinical, biomarker and genetic data from the LRRK2 G2019S patient donors 88 5 DISCUSSION 92 6 APPENDIX 101 7 SUMMARY 104 8 ZUSSAMENFASSUNG 106 9 BIBLIOGRAPHY 108 10 ACKNOWLEDGEMENTS 136 11 DECLARATIONS 138

Hintergrund: Das Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziale-Syndrom (BWCFF-S) gehört mit einer Prävalenz von 1:1.000.000 zu den sehr seltenen genetischen Krankheiten und wird durch Missense-Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1, die die zytoplasmatischen Aktin-Isoformen βCYA und γCYA kodieren, verursacht. Neben multiplen fazialen Dysmorphien und Skelettfehlbildungen weisen bis zu 70 % der Patient*innen kortikale Malformationen wie Mikrozephalie und Lissenzephalie auf, deren ursächlichen Pathomechanismen bisher noch nicht erforscht wurden. Ebenso wenig ist über das Expressionsmuster von βCYA und γCYA im humanen Gehirn während der embryonalen Entwicklung bekannt. Die Generierung von zerebralen Organoiden durch Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPS-Zellen), die aus primären Zellen von Patient*innen reprogrammiert werden können, eröffnet neue Möglichkeiten, die Neurogenese und Kortikogenese zu studieren sowie zelluläre Krankheitsmodelle zu entwickeln. Material und Methoden: Das Expressionsmuster von βCYA und γCYA wurde mittels Immunfluoreszenz in humanem fetalem Gehirngewebe sowie zerebralen Organoiden charakterisiert. Aus den iPS-Zelllinien der BWCFF-S-Patientinnen mit Mutationen in jeweils einem Aktin-Gen (ACTB p.Thr120Ile und ACTG1 p.Thr203Met) sowie gesunden Kontrollen wurden unter der Verwendung von zwei Protokollen nach gerichteter und ungerichteter Differenzierung zerebrale Organoide generiert und diese charakterisiert. Mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems wurden die gleichen Mutationen in ACTB und ACTG1 in iPS-Zellen der Kontroll-Zelllinien CRTDi011-A und SC102A-1 editiert. Zerebrale Organoide, die nach dem ungerichteten Protokoll differenziert wurden, wurden durch Immunfluoreszenz- und TEM-Analysen hinsichtlich ihrer Zytoarchitektur, Zelltypen und Aktin-Verteilung untersucht. Außerdem wurden Apoptose, Proliferation und Ausrichtung der Zellteilungsebenen der apikalen Progenitorzellen analysiert. Unter Verwendung der RNA-Einzelzell-Sequenzierung wurden die Zellpopulationen von zerebralen BWCFF-S- und Kontroll-Organoiden an zwei unterschiedlichen Kultivierungs-Zeitpunkten analysiert. Zudem wurden Kontroll-iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) differenziert, um die intrazelluläre Lokalisierung der Aktin-Isoformen mit Immunfluoreszenz-Analysen zu bestimmen. Unter Durchführung von Migrationsassays mit Neurospäroiden und zerebralen Organoiden wurden die Migrationseigenschaften der neuralen BWCFF-S-Zellen untersucht. Ergebnisse: In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster der Aktin-Isoformen βCYA und γCYA im humanen fetalen Gewebe, in zerebralen Organoiden sowie in NPCs und Neuronen analysiert. Im humanen fetalen Gewebe und in den zerebralen Organoiden zeigte sich ein überlappendes Expressionsmuster von beiden Isoformen in allen Schichten des Neokortex. Im Gegensatz dazu wiesen Immunfluoreszenz-Färbungen in kultivierten NPCs und Neuronen eine Isoform-spezifische Lokalisierung von βCYA und γCYA auf, mit einer Anreicherung von βCYA im Zellkortex und in den Zellfortsätzen der NPCs, wohingegen γCYA im Zytosol angereichert war. In Neuronen wurde eine stärkere Lokalisierung von βCYA im Wachstumskegel und von γCYA in den Neuriten festgestellt. Zudem wurde die Kultur zerebraler Organoide für die Modellierung des BWCFF-S erfolgreich etabliert. BWCFF-S-Organoide waren im Vergleich zur Kontrolle in ihrer Gesamtgröße signifikant reduziert und zeigten auch kleinere ventrikulären Zonen (VZs) in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Als Ursache für diese Größenunterschiede konnte die veränderte Ausrichtung der Teilungsebene der apikalen Progenitorzellen (APs) in der Anaphase von vertikal zu horizontal und damit der Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung festgestellt werden, im Zusammenspiel mit einer abnormalen Anreicherung von Mikrotubuli an der ventrikulären Oberfläche in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung der zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoide zeigte eine Veränderung der Zellpopulation mit einer reduzierten Anzahl von radialen Gliazellen (RGs) und Neuronen in den BWCFF-S-Organoiden. Die BWCFF-S-ähnlichen Organoide mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile, die durch Gen-Editierung der Kontroll-Zelllinie CRTDi011-A generiert wurden, zeigten nahezu in allen Analysen vergleichbare Ergebnisse wie die Patientinnen-eigenen BWCFF-S-Organoide mit derselben Mutation und belegten somit, dass sich durch Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems isogene Kontrollen herstellen lassen. Durch Migrationsassays mit Neurosphäroiden und Organoiden konnte eine gravierend veränderte Migration der neuralen BWCFF-S-Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt werden. Schlussfolgerung: Die Modellierung des BWCFF-S in den zerebralen Organoiden entschlüsselte den zellulären Pathomechanismus der mikrozephalen kortikalen Malformation. Die Veränderung der Ausrichtung der mitotischen Spindel in den APs und dem dadurch entstehenden Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung führt zu einer Reduktion des Progenitorzellpools und einer verfrühten Neurogenese. Die verringerte Anzahl der Progenitorzellen in der VZ der zerebralen Organoide spiegelt sich in der verminderten Größe der VZs wider. Beide BWCFF-S-assoziierten Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1 führten zu einer veränderten Ausrichtung der Teilungsebene in den APs. Die deutliche Einschränkung der neuralen Migration wurde jedoch nur bei Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt, was einen ersten Hinweis auf die Isoform-spezifische Funktion der beiden Aktinproteine liefert.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis X Tabellenverzeichnis XIII 1. Einleitung 1 1.1. Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziales-Syndrom 1 1.1.1. Das klinische Bild und genetische Ursachen 1 1.1.2. Neurologische Symptome und kortikale Malformationen beim BWCFF-S 3 1.2. Aktin 5 1.2.1. Die sechs Aktin-Isoformen 5 1.2.2. Das Aktin-Zytoskelett 5 1.2.3. Die Funktionen des Aktin-Zytoskeletts 8 1.2.4. Das Aktin-Zytoskelett im zentralen Nervensystem (ZNS) 10 1.3. Neuro- und Kortikogenese des humanen Gehirns 12 1.4. Zerebrale Organoide als Modellsysteme für neurologische Entwicklungsstörungen 15 1.5. Ziele dieser Arbeit 20 2. Material 21 2.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien 21 2.2. Chemikalien und Kits 23 2.3. Lösungen für die Molekularbiologie 25 2.4. Medien für die Zellkultur 25 2.5. Puffer und Lösungen für Immunfluoreszenz-Analysen 27 2.6. Primer 28 2.7. Guide RNAs (gRNAs), Templates und Cas9 28 2.8. Primäre Antikörper 29 2.9. Sekundäre Antikörper und DNA-Fluoreszenzfarbstoff 30 2.10. Zelllinien 30 2.11. Humanes fetales Gehirngewebe 32 2.12. Software 33 3. Methoden 34 3.1. Molekularbiologische Methoden 34 3.1.1. DNA-Isolierung 34 3.1.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 34 3.1.3. Gelelektrophorese 35 3.1.4. Aufreinigung der PCR-Produkte 35 3.1.5. Sanger-Sequenzierung 36 3.2. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 36 3.2.1. Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in iPS-Zellen 36 3.2.2. Kultivierung der iPS-Zellen 37 3.2.3. Gen-Editierung der iPS-Zellen mit CRISPR/Cas9 37 3.3. Differenzierung von iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neurone 39 3.3.1. Kultivierung von Neuronen im XonaChip® 39 3.4. Differenzierung von iPS-Zellen in Vorderhirn-Organoide (forebrain organoids) 40 3.5. Differenzierung von iPS-Zellen in zerebrale Organoide (whole brain organoids) 42 3.6. Migrationsassay mit Neurosphäroiden 43 3.7. Migrationsassay mit zerebralen Organoiden (radiale Migration) 44 3.8. Immunfluoreszenz-Analysen 44 3.8.1. Färbeprotokoll für βCYA und γCYA in Einzelzellen, Organoiden und humanem fetalem Gewebe 45 3.8.2. Protokoll für Immunfluoreszenz-Färbungen mit Antigen-Demaskierung durch Sieden 45 3.9. Mikroskopie 46 3.10. Bildanalyse und Datenerhebung 46 3.10.1. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen für die Analyse der Verteilung von βCYA und γCYA in Einzelzellen, zerebralen Organoiden und humanem fetalen Gehirngewebe 46 3.10.2. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen von Einzelzellen und zerebralen Organoide 47 3.10.3. Quantifizierungen verschiedener Größen der zerebralen Organoide 47 3.10.4. Bildbearbeitung der Aufnahmen der zerebralen Organoide nach dem Migrationsassay 49 3.11. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) 49 3.12. RNA-Einzelzell-Sequenzierung von zerebralen Organoiden 50 3.13. Analyse der RNA-Einzelzell-Sequenzierdaten der zerebralen Organoide 50 3.14. Statistik 51 4. Ergebnisse 53 4.1. Bestätigung der pathogenen Aktin-Varianten in den Patientinnen-spezifischen iPS- und editierten iPS-Zelllinien 53 4.2. Die beiden Aktin-Isoformen βCYA und γCYA zeigen ein überlappendes Expressionsmuster im humanen fetalen Gewebe des Neokortex 55 4.3. Isoform-spezifische intrazelluläre Anreicherung von βCYA und γCYA in neuralen Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neuronen 58 4.4. Gehirn-Organoide als Krankheitsmodell für die BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 62 4.4.1. Das Vorderhirn-Protokoll konnte nicht reproduziert werden 62 4.4.2. Differenzierung von Kontroll- und BWCFF-S-iPS-Zelllinien in zerebrale Organoide nach dem Lancaster-Protokoll und erfolgreiche Etablierung des Organoidmodells für Analysen des zellulären Pathomechanismus des BWCFF-S 63 4.5. Zerebrale BWCFF-S-Organoide rekapitulieren die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 64 4.5.1. Die Analyse der Lokalisierung von βCYA und γCYA zeigt keine Unterschiede zwischen zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoiden und ist ähnlich der Verteilung im humanen fetalen Neokortex 67 4.5.2. Zerebrale BWCFF-S-Organoide sind signifikant kleiner im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 70 4.5.3. BWCFF-S-Organoide zeigen eine signifikant verminderte Größe der Ventrikel-ähnlichen Strukturen mit reduzierter Anzahl der Progenitorzellen 75 4.5.4. BWCFF-S-Organoide zeigen keine Unterschiede in Proliferation und Apoptose im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 78 4.5.5. Apikale Progenitorzellen (APs) von BWCFF-S-Organoiden teilen sich vermehrt horizontal statt vertikal 81 4.5.6. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine Veränderung in der Ausrichtung der Zellteilungsebene im Vergleich zur Kontrolle 82 4.5.7. BWCFF-S-Organoide zeigen eine veränderte Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit apikaler Anreicherung von Mikrotubuli in Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)- und Immunfluoreszenz-Analysen 85 4.5.8. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine abnormale Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit einer Anreicherung von Mikrotubuli an der apikalen Oberfläche der VZ 89 4.6. BWCFF-S-NPCs zeigen ein abnormales Migrationsver-halten im Neurosphäroid-Migrationsassay 91 4.7. Zerebrale BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile zeigen kaum Migration von neuralen Zellen 93 4.8. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung zeigt Veränderungen in den Zellpopulationen von BWCFF-S-Organoiden und eine reduzierte Anzahl der RGs und Neurone 96 5. Diskussion 106 5.1. βCYA und γCYA zeigen in Gewebeschnitten des humanen fetalen Neokortex sowie zerebralen Organoiden ein überlappendes Expressionsprofil, weisen aber intrazellulär eine Isoform-spezifische Anreicherung auf 107 5.2. Zerebrale Organoide eignen sich für die Modellierung der mit dem BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 108 5.3. Die asymmetrische, horizontale Zellteilung von APs in BWCFF-S-Organoiden führt zu einer vorzeitigen Neurogenese und erklärt die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 110 5.4. Die Änderung der Orientierung der mitotischen Spindel in den apikalen Progenitorzellen weist auf eine gestörte Interaktion zwischen Mikrotubuli und dem Aktin-Zytoskelett hin 113 5.5. Die BWCFF-S-Organoide zeigen keine grundlegenden strukturellen Veränderungen der AJ 114 5.6. Editierte BWCFF-S-ähnliche Organoide mit cr. ACTB p.Thr120Ile zeigen eine ähnliche Pathologie wie BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile 115 5.7. Limitationen des zerebralen Organoidmodells müssen bei der Krankheitsmodellierung berücksichtig werden 117 5.8. Die BWCFF-S-Mutation ACTB p.Thr120Ile führt zu Migrationsstörungen von neuralen Zellen 119 5.9. BWCFF-S-Organoide haben eine reduzierte Anzahl von RGs und Neuronen 120 6. Ausblick 123 7. Zusammenfassung 125 8. Summary 128 9. Literaturverzeichnis 130 10. Anhang 142 10.1. Charakterisierung der reprogrammierten und editierten iPS-Zellklone 142 10.2. Auswertungsstrategie für die intrazelluläre Verteilung von βCYA und γCYA in NPCs und Neuronen 146 10.3. Werte der Winkel der Zellteilungsebenen der APs in der Anaphase 146 10.4. Immunfluoreszenz-Analysen des Adhäsions-Verbindungs-gürtels 148 10.5. Zusätzliche Daten der RNA-Einzelzell-Sequenzierung 149 11. Danksagung i 12. Veröffentlichungen iv 13. Erklärung zum Antrag auf Eröffnung des Promotionsverfahrens vi 14. Eidesstattliche Versicherung vii