CD137 und CD137L stellen ein Rezeptor-Liganden-Paar dar, welches auf vielen Immunzellen exprimiert wird und eine wichtige Rolle im Rahmen der Immunstimulation spielt. CD137L fungiert jedoch nicht nur als Ligand sondern auch als Rezeptor und vermittelt als ein solcher Signale in die ihn exprimierende Zelle. Neben seinem Vorkommen auf Immunzellen wird CD137L auch von einigen Tumorzellen exprimiert, unter anderem auch auf denen des Kolonkarzinoms. In dieser Tumorentität korreliert eine hohe CD137L-Expression mit dem Auftreten von Fernmetastasen und einer insgesamt schlechteren Prognose. Die genaue Rolle von CD137L im Kolonkarzinom ist bislang kaum erforscht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Auswirkungen einer CD137L-Aktivierung auf die Proliferation sowie die Proteinexpression und -sekretion von Kolonkarzinomzellen untersucht. Die Ergebnisse deuten erstmals darauf hin, dass die CD137L-Stimulation in vitro die Proliferation der entarteten Zellen reduziert und die Expression bzw. Sekretion der Proteine Vimentin, TLR7, VEGF und PDGF steigert. Hieraus wird geschlossen, dass eine Stimulation des von den Kolonkarzinomzellen exprimierten CD137L dazu führt, dass sich der Phänotyp der Tumorzellen von einem epithelialen in Richtung eines mesenchymalen Zelltyps verändert. Darüber hinaus werden vermehrt Proteine exprimiert und sezerniert, welche über unterschiedliche Signalwege an der Invasion und Migration der entarteten Zellen beteiligt sind. Folglich lässt sich annehmen, dass CD137L eine entscheidende Rolle im Metastasierungsprozess von humanen Kolonkarzinomzellen spielt. Sollte sich dies in weiterführenden Untersuchungen bestätigen, könnte eine pharmazeutische Beeinflussung der beteiligten Signalwege möglicherweise die Prognose von an Kolonkarzinomen erkrankten Patient:innen deutlich verbessern. / CD137 and CD137L represent a receptor/ligand-pair expressed on a variety of immune cells which exerts an important immunostimulatory effect. Besides its function as a ligand to CD137, CD137L also acts as a receptor itself, thereby transmitting signals into the cell via reverse signaling. Apart from being expressed on immune cells CD137L is also found on many tumor cells, including colon carcinoma cells. In this tumor entity the expression is positively correlated with distant metastases and poor prognosis, nevertheless little is known about the function of CD137L in the progression of colon cancer. The aim of this study was to investigate the effects of CD137L-mediated reverse signaling on protein expression and secretion in human colon cancer cells in vitro. The results indicate for the first time that a stimulation of the cells via CD137L induces a decreased proliferation and an increased expression or secretion of the proteins vimentin, TLR7, VEGF and PDGF. Reverse signaling via CD137L proposedly leads to a transition of the cancer cells from an epithelial to a mesenchymal phenotype. In addition, the increasingly expressed and secreted proteins presumably activate signaling pathways which are involved in the invasion and migration of the tumor cells. Hence it is suggested, that CD137L plays a crucial role in the process of metastasis of human colon cancer cells. Should this be confirmed by further studies, impairing this pathway could represent a promising new therapeutic approach which could improve the prognosis of patients suffering from colon cancer.

In dieser Arbeit wurden die histologischen und immunhistologischen Auswirkungen der Kombination aus Inhibition des PD-1/PD-1L-Checkpoints und PLOD-2-Blockade untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Immuntherapie anschlägt und dabei als Monotherapie die stärksten Tumornekrosen induzierte. Das Ansprechen auf die Immuntherapie mit BMS-1166 war jedoch sehr unterschiedlich. In der Kombination mit dem PLOD-2-Inhibitor Minoxidil wurden hingegen einheitlichere, aber auch geringere Nekroseanteile festgestellt. Dabei muss jedoch beachtet werden, dass die Kombinationsbehandlung die stärkste Auswirkung auf das Tumorwachstum hatte. So waren diese Tumore die kleinsten und leichtesten, was in Zusammenhang mit dem ausgeprägten kollagenen Netzwerk dieser Gruppe stehen könnte. Die Kombination zeigte keine Auswirkung auf die Tumorvaskularisierung und die Zellteilungsaktivität, sowie auch keine Auffälligkeiten bezüglich der Infiltration mit Immunzellen. Lungenmetastasen kamen in allen Behandlungsgruppen vor. Bei der Kombinationsbehandlung waren jedoch die durchschnittlich größten Lungenmetastasen festzustellen. In dieser Arbeit konnte keine klare signifikante Verbesserung der Brustkrebstherapie durch die Kombination von Inhibition der Kollagensynthese durch PLOD-2-Blockade und Inhibierung des PD-1/PD-1L-Checkpoints aufgezeigt werden. Das kollagene Netzwerk war auffällig und sollte genauer untersucht werden. Es lohnt sich weiter an Kombinationen aus Immuntherapeutikum und EZM-Destabilisierung zu arbeiten. Die TME muss dabei weiterhin Ansatzpunkt der Forschung bleiben, um eine erleichterte Penetration der Medikamente in den Tumor zu erzielen. Hier ist der Austausch des Medikaments zur EZM-Destabilisierung empfehlenswert. Die LOX-Inhibierung hat sich bereits in Kombination mit Chemotherapie als vorteilhaft erwiesen (Rossow et al., 2018) und sollte nachfolgend in einem ähnlichen Versuchsaufbau mit dem Immuntherapeutikum BMS-1166 ausprobiert werden. / In this thesis, the histological and immunohistological effects of the combination of PD-1/PD-1L checkpoint inhibition and PLOD-2 blockade were investigated. It was found, that the immunotherapy was effective and induced the strongest tumor necrosis as monotherapy. The response to immunotherapy with BMS-1166 was highly variable. In combination with the PLOD-2 inhibitor minoxidil, more uniform but also lower levels of necrosis proportions were observed. It must be noted, that the combination treatment had the strongest effect on tumor growth. Thus tumors were the smallest and lightest, which may be related to the pronounced collagenous network of this group. The combination showed no effect on tumor vascularization and cell division activity, as well as no abnormalities regarding infiltration with immune cells. Lung metastases occurred in all treatment groups. However, in the combination treatment group were observed the largest lung metastases. In this thesis, no clear significant improvement of breast cancer therapy could be shown with the combination of inhibition of collagen synthesis by PLOD-2 blockade and inhibition of the PD-1/PD-1L checkpoint. The collagen network was conspicuous and should be investigated further. It is worthwhile to further investigate combinations of immunotherapeutic agents and ECM destabilization. The TME must remain the starting point of research to facilitate drug penetration into the tumor. Here, the replacement of the Drug for ECM destabilization is recommended. LOX inhibition has already been shown to be beneficial in combination with chemotherapy (Rossow et al., 2018) and should be subsequently tested in a similar experimental setting with the immunotherapeutic BMS-1166.

Kurzzusammenfassung: Dank der Einführung von Immuncheckpointinhibitoren hat sich die Therapie fortgeschrittener onkologischer Erkrankungen in den letzten Jahren dramatisch verändert. Trotz außergewöhnlicher Erfolge profitieren viele Patienten jedoch weder akut noch langfristig von einer Behandlung, tragen aber alle ihre Risiken. Ein besseres Verständnis davon, bei welchen Patienten diese Therapieform wirkt, sowie prädiktive Marker werden daher dringend benötigt. Growth Differentiation Factor 15 (GDF-15) ist Teil der Transforming Growth Factor-β Superfamilie, weist in pathologischen Situationen wie Entzündungen und insbesondere bei Krebs sehr hohe Spiegel auf und besitzt in verschiedenen, auch onkologischen Erkrankungen einen starken prognostischen Wert. Möglicherweise könnte GDF-15 durch seine immunmodulierenden Eigenschaften dazu beitragen, dass Krebszellen im Körper nicht angegriffen werden, und die Wirksamkeit einer Immuncheckpointblockade (ICB) dadurch vermindern. Ziel der vorliegenden Pilotstudie war es zu untersuchen, ob ein Zusammenhang zwischen dem GDF-15-Spiegel und dem Erfolg einer ICB besteht. Hierfür wurden 37 Patienten verschiedener onkologischer Entitäten vor Beginn einer ICB auf ihre GDF-15-Spiegel untersucht, sowie nach zwölf bzw. bei Progressive Disease zum Teil auch nach vier Wochen Therapie. Die Bewertung des Therapieergebnisses erfolgte anhand der RECIST sowie der klinischen Präsentation. Ein Therapieerfolg wurde ab Erreichen einer Stable Disease klassifiziert. Die Rekrutierungszeit betrug 23 Monate ab Januar 2017. Die Untersuchungen zeigten vor Therapiebeginn einer ICB einen geringen Unterschied der GDF-15-Spiegel zwischen Patienten mit Therapieerfolg und Therapieversagen (Median des Therapieerfolgs: 0,63 ng/ml versus Median des Therapieversagens: 0,92 ng/ml). Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant. Dagegen zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem Anstieg des GDF-15-Spiegels unter Therapie und dem Therapieversagen einer ICB. Bei Therapieerfolg sank oder stagnierte der GDF-15-Spiegel im Median um - 0,01 ng/ml. Dagegen stieg er bei Therapieversagen im Median um + 0,7 ng/ml an (p < 0,01 r = 0,43). Auch die Höhe des GDF-15-Spiegels unter Therapie zeigte einen signifikanten Zusammenhang mit dem Therapieergebnis. Der GDF-15-Spiegel unter Therapie lag im Median bei Patienten mit Therapieerfolg bei 0,72 ng/ml, dagegen bei Patienten mit Therapieversagen bei 1,85 ng/ml (p < 0,01 r = 0,47). Ob der GDF-15-Spiegel vor Therapiebeginn die Wirksamkeit einer ICB vorhersagen kann, bleibt unklar, da in dieser Studie nur eine Tendenz aufgezeigt werden konnte, die in Folgestudien mit größeren Kohorten in den verschiedenen Entitäten untersucht werden sollte. Unsere Daten zeigen jedoch einen Zusammenhang zwischen einem steigenden bzw. erhöhten GDF-15-Spiegel unter Therapie mit dem Therapieergebnis einer ICB. Dieser Zusammenhang fügt sich gut in das Bild gegenwärtiger Diskussionen über immunmodulierende Eigenschaften von GDF-15 und seiner Rolle bei der Tumorprogression. Zugleich bestärkt das Studienergebnis die Annahme, in GDF-15 auch ein vielversprechendes Angriffsziel therapeutischer Ansätze gefunden zu haben. / Abstract: Thanks to the introduction of immune checkpoint inhibitors, therapy of progressed oncological diseases has changed dramatically in recent years. However, many patients benefit neither acutely nor in the long term from the treatment but bear all its risks. A better understanding of which patients profit from this therapy as well as predictive markers are therefore urgently needed. Growth Differentiation Factor 15 (GDF-15) is part of the Transforming Growth Factor-β superfamily. It shows raised levels in pathological situations such as inflammation and reaches especially in cancer remarkably high levels. It has a strong prognostic value in various, also oncological diseases. Possibly, GDF-15 helps cancer cells not to be attacked by the immune system and could thereby reduce the effectiveness of an immune checkpoint blockade (ICB). The aim of the presented pilot study was investigating whether there is a connection between the GDF-15 level and the success of an ICB. For this purpose, the GDF-15 level of 37 patients of different oncological entities were examined before the start of an ICB, as well as after twelve weeks of therapy, or in the case of progressive disease, after four weeks of therapy. The evaluation of the therapy results was based on RECIST and the clinical presentation. The time of recruitment was 23 months since January 2017. For the GDF-15 level before start of an ICB therapy, the investigations showed a small difference between patients with therapy success and therapy failure (median when success of the therapy: 0.63 ng/ml versus median when treatment failure: 0.92 ng/ml). But this difference was not statistically significant. In contrast, during therapy there was a significant connection between an increase in the GDF-15 level and therapy failure of the ICB. In case of successful therapy, the GDF-15 level fell or stagnated with a median of -0.01 ng/ml. In contrast, the GDF-15 level rose with a median of +0.7 ng/ml in case of therapy failure (p<0.01 r=0.43). Also, the absolute height of the GDF-15 level during therapy showed a significant connection with the therapy result. The median of the GDF-15 level during therapy of patients with therapy success was 0.72 ng/ml, but of patients with treatment failure was 1.85 ng/ml (p<0.01 r = 0.47). Whether the GDF-15 level can predict the effectiveness of an ICB before the start of therapy remains unclear, since this study could only show a trend that follow-up studies with larger cohorts for the different entities should further examine. However, our data show a correlation between increasing and increased GDF-15 levels under therapy with the therapy result of an ICB. This correlation fits well with current discussions about immunomodulating properties of GDF-15 and its role in tumor progression. Simultaneously, the study result confirms the assumption of GDF-15 being a promising target of new therapeutic approaches.

In der modernen Tumortherapie sind Checkpoint-Inhibitoren ein fester Bestandteil. Die Oberflächenproteine PD-L1 und PD-1 stellen die Angriffspunkte dieser spezifischen Therapie dar. Die Datenlage hinsichtlich PD-L1 in HNSCC ist sehr heterogen. Diese Arbeit beschäftigte sich daher mit der Expression von PD-L1 und PD-1 in einem Kollektiv von 118 Plattenepithelkarzinomen in Larynx und Hypopharynx und einer prognostischen Aussagekraft hinsichtlich mehrerer histopathologischer und epidemiologischer Faktoren. Außerdem wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen der Expression von PD-L1, PD-1 und CD5 als T-Zell-Marker in besagtem Kollektiv untersucht. Die IHC-Färbungen wurden lichtmikroskopisch an tissue micro arrays untersucht. Für die Auswertung von PD-L1 wurde der bereits etablierte Cologne-Score verwendet, welcher zum einen zunächst erweitert und anschließend zwecks einer fundierten statistischen Auswertung ergänzend modifiziert wurde. Für CD5 und PD-1 wurden eigene Cut-Off-Werte generiert. 48 % der Fälle waren PD-L1+, die Spannweite im Literaturvergleich schwankt zwischen 30 – 90 %. PD-1+ waren insgesamt 31% der Fälle, auch hier zeigen sich deutliche Abweichungen zu den vorliegenden Publikationen. Hinsichtlich der prognostischen Aussagekraft konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem T-Stadium und der PD-L1-Expression aufgezeigt werden. Ob dies Einfluss auf mögliche Behandlungsstrategien hat, bleibt Gegenstand weiterer Forschung. Auch im Literaturvergleich finden sich wiederholt signifikante prognostische Zusammenhänge, jedoch beziehen sich diese auf differente Faktoren. Ursächlich dafür sind aller Wahrscheinlichkeit nach Diskrepanzen in der PD-L1-Expression sowie deren Schwankungen durch äußere Einflüsse und nicht standardisierte Testverfahren. Es zeigten sich weiterhin Korrelationen zwischen den Markern, welche sich abschließend nicht alle gänzlich herleiten lassen. Zusammenfassend könnten einheitliche Testverfahren die Datenlage zu PD-L1 und PD-1 homogenisieren, auch mögliche Vortherapien sollten dementsprechend berücksichtigt werden. Allerdings erscheint die prognostische Aussagekraft von PD-L1 und auch von PD-1 insgesamt aufgrund der inkonstanten Expression hochgradig eingeschränkt, sodass sich in Zukunft vermehrt auf andere Marker konzentriert werden sollte. / Checkpoint inhibitors are an essential part of modern tumor therapy. The surface proteins PD-L1 and PD-1 are the targets of this specific therapy. But the data situation regarding PD-L1 in HNSCC is very heterogeneous. This study therefore dealt with the expression of PD-L1 and PD-1 in a collective of 118 squamous cell carcinomas in the larynx and hypopharynx and a prognostic significance with regard to several histopathological and epidemiological factors. Furthermore, a possible link between the expression of PD-L1, PD-1 and CD5 as a T cell marker has been studied. The IHC stains were examined by light microscopy on tissue micro arrays. The already established Cologne score was used for the evaluation of PD-L1. Initially this score was expanded and additionally has been modified for a substantiated statistical analysis. Separate cut-off values were generated for CD5 and PD-1. 48 % of the cases were PD-L1+, literature shows a range between 30 – 90 %. PD-1+ were a total of 31% of the cases, there were distinctly discrepancies from the existing publications too. With regard to the prognostic significance, a significant correlation between the T-stage and PD-L1 expression could be shown. Whether this has an impact on possible treatment strategies remains the subject of further research. Significant prognostic correlations are also repeatedly found in the literature comparison, but these refer to different factors. In all likelihood, this is due to discrepancies in PD-L1 expression and its fluctuations due to external influences and non-standardized test procedures. There were also correlations between the used markers, not all of them could be fully explained. In summary, common test procedures could homogenize the data on PD-L1 and PD-1, furthermore possible previous therapies should also be considered. However, the prognostic significance of PD-L1 and also of PD-1 is highly limited due to the inconstant expression, so that in the future more focus should be placed on other markers.

Background: Treatment options for poorly differentiated (PDTC) and anaplastic (ATC) thyroid carcinoma are unsatisfactory and prognosis is generally poor. Lenvatinib (LEN), a multi-tyrosine kinase inhibitor targeting fibroblast growth factor receptors (FGFR) 1-4 is approved for advanced radioiodine refractory thyroid carcinoma, but response to single agent is poor in ATC. Recent reports of combining LEN with PD-1 inhibitor pembrolizumab (PEM) are promising. Materials and methods: Primary ATC (n=93) and PDTC (n=47) tissue samples diagnosed 1997-2019 at five German tertiary care centers were assessed for PD-L1 expression by immunohistochemistry using Tumor Proportion Score (TPS). FGFR 1-4 mRNA was quantified in 31 ATC and 14 PDTC with RNAscope in-situ hybridization. Normal thyroid tissue (NT) and papillary thyroid carcinoma (PTC) served as controls. Disease specific survival (DSS) was the primary outcome variable. Results: PD-L1 TPS≥50% was observed in 42% of ATC and 26% of PDTC specimens. Mean PD-L1 expression was significantly higher in ATC (TPS 30%) than in PDTC (5%; p<0.01) and NT (0%, p<0.001). 53% of PDTC samples had PD-L1 expression ≤5%. FGFR mRNA expression was generally low in all samples but combined FGFR1-4 expression was significantly higher in PDTC and ATC compared to NT (each p<0.001). No impact of PD-L1 and FGFR 1-4 expression was observed on DSS. Conclusion: High tumoral expression of PD-L1 in a large proportion of ATCs and a subgroup of PDTCs provides a rationale for immune checkpoint inhibition. FGFR expression is low thyroid tumor cells. The clinically observed synergism of PEM with LEN may be caused by immune modulation. / Hintergrund: Die therapeutischen Optionen für das gering differenzierte (PDTC) und anaplastische (ATC) Schilddrüsenkarzinom sind limitiert, weshalb diese Erkrankungen überwiegend mit einer schlechten Prognose einhergehen. Lenvatinib (LEN) ist ein Multityrosinkinase-Inhibitor, der unter anderem die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren (FGFR) 1-4 inhibiert und zur Therapie des fortgeschrittenen radiojodrefraktären Schilddrüsenkarzinoms zugelassen ist. Es zeigt sich nur ein geringes Ansprechen auf die Monotherapie bei ATCs, wobei neuere Studien eine therapeutische Überlegenheit der Kombination aus LEN und dem PD-1-Inhibitor Pembrolizumab (PEM) beschreiben. Material und Methoden: Die Expression von PD-L1 wurde in ATC (n=93)- und PDTC (n=47)-Primärtumorgewebe von 1997-2019 aus fünf deutschen (Universitäts-)Kliniken mittels Immunhistochemie analysiert und mit dem Tumor Proportion Score (TPS) quantifiziert. Der Nachweis von FGFR1-4-mRNA wurde bei 31 ATC- und 14 PDTC-Gewebeproben mittels RNAscope In-situ-Hybridisierung quantifiziert. Als Kontrollgruppe wurde normales Schilddrüsengewebe (NT) und Gewebe von papillären Schilddrüsenkarzinomen (PTC) verwendet. Der primäre Endpunkt war das krankheitsspezifische Überleben (DSS). Ergebnisse: Eine PD-L1-Expression mit einem TPS ≥50% konnte in 42% der ATC- und in 26% der PDTC-Proben nachgewiesen werden. Die mediane PD-L1-Expression war in ATC-(TPS 30%) signifikant höher im Vergleich zu PDTC-Proben (5%; p<0,01) und NT (0%; p<0,001). 53% der PDTC-Proben zeigten eine PD-L1-Expression ≤5%. Die Expression von FGFR-mRNA war in allen Proben sehr gering, wobei die kombinierte FGFR1-4-Expression in PDTC- und ATC-Gewebe im Vergleich zu normalem Schilddrüsengewebe signifikant höher war (jeweils p<0,001). Es ergab sich keine Assoziation zwischen der PD-L1- und FGFR1-4-Expression mit dem krankheitsspezifischen Überleben. Schlussfolgerung: Eine hohe PD-L1-Expression in einem großen Anteil der ATCs und einem Viertel der PDTCs, könnte auf eine Rationale zur Therapieentscheidung für Immuncheckpoint-Inhibioren hinweisen. Die FGFR-Expression war in allen Schilddrüsenkarzinomen sehr gering. Der klinisch beobachtete Synergismus von PEM und LEN könnte durch immunmodulatorische Effekte hervorgerufen werden.

Introduction : Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus grave de l’adulte. Des études épidémiologiques ont mis en évidence que les antécédents d’allergie sont un facteur protecteur, soulignant le possible impact de l’immunité sur le GBM. Plusieurs études transcriptomiques ont également mis en évidence des signatures immunes plus ou moins associées à la survie. Matériel et méthodes : Pour clarifier ce lien et déterminer quels gènes immuns étaient les plus impliqués dans le GBM, nous avons étudié l’expression de 791 gènes immuns dans des échantillons de GBM et de cerveaux normaux. Les interactions entre les gènes immuns ont été étudiées par une analyse de co-expression. Nous avons ensuite recherché une association entre les gènes immuns et la survie selon 3 méthodes statistiques, avant d’établir un modèle de risque mathématique validé sur plusieurs jeux de données. Enfin, nous avons étudié les cellules immunes infiltrantes sur des échantillons de gliomes dont 73 GBM par cytométrie de flux. Résultats : Un profil d’expression génique différent significativement entre le cerveau normal et le GBM a été établi de manière robuste, mais pas au sein des GBM. L’analyse de co-expression a mis en évidence 6 modules dont 5 sont enrichis en gènes ayant un lien avec la survie. Cent huit gènes immuns ont une association significative avec la survie et un prédicteur de risque à 6 gènes immuns a permis de distinguer deux groupes de patients en fonction de leur survie, y compris chez les patients dont la tumeur a un promoteur MGMT méthylé et dans le sous-groupe de GBM proneuraux. Enfin, nous avons mis en évidence, dans tous les échantillons de GBM analysés, une infiltration leucocytaire par des cellules macrophagiques/microgliales et parfois par des cellules lymphocytaires ou granulocytaires. L’infiltration de lymphocytes uniquement est associée significativement avec la survie dans notre cohorte. Conclusion : Des gènes, impliqués dans diverses fonctions immunes, sont différentiellement exprimés entre le cerveau normal et le GBM et au sein des GBM. Un prédicteur à 6 gènes robuste a été établi, il sépare les patients en 2 groupes bas et haut risque y compris ceux ayant un bon pronostic. Nous avons enfin mis en évidence dans une série de GBM une infiltration de cellules immunes, dont une infiltration lymphocytaire associée positivement à la survie. / Background: Glioblastoma is the most common and lethal primary brain tumor in adults. Epidemiological studies have revealed that a history of allergies is a protective factor, thereby underlining the likely impact of the immune system on GBM. A number of transcriptomic studies have also identified immune signatures more or less associated with patient survival. Methods: In order to clarify and identify which immune-associated (IA) genes were the most involved in GBM, we studied the expression of 791 immune genes in GBM and normal brains samples. Interactions between IA genes were studied through an analysis of co-expression network. We then searched for a link between IA genes and patient survival according to 3 statistical methods, before defining a mathematical risk model based on different data sets. Finally, we studied the infiltrative immune population of 73 GBM by cytometry. Results: A significantly different profile of IA genes expression between healthy brains and GBM was consistently defined, but not among GBM. The analysis of co-expression network revealed 6 modules, 5 of which were enriched by genes associated with patient survival. 108 IA genes have a significant association with patient survival and the 6-IA gene risk predictor allowed us to distinguish two groups of patients according to their survival, including patients whose tumor had a methylated MGMT gene promoter and in the subset of proneural GBM. Finally, in every analyzed GBM sample, we have shown that there was a leukocyte infiltration by macrophages/microglial cells and sometimes by lymphocytes or granulocytes. Only the lymphocytes infiltration was significantly associated with the survival in our group of patients. Conclusion: IA genes that are involved in various immune functions are expressed differentially between healthy brains and GBM and amongst GBM. A robust 6-IA gene risk predictor was defined: it divides patients into two low and high risk groups, including those who have a good prognosis. Finally, we revealed an infiltration of immune cells in a series of GBM, only the lymphocytic infiltration was positively associated with patient survival.

Th. Méd.--Nancy 1, 1983. N°: 7.

In this work, bispecific antibodies were produced by coupling TNFR-specific antibodies with checkpoint inhibitors, tested for their functionality and compared with each other. This combination should enable a targeted TNFR activation in tumor tissue, where a high PDL1 expression is frequent and therefore the formation of oligomeric transactivating (TNFSF3-TNFRSF3)2 complexes should only occur there by binding to PDL1-expressing cells. These receptor-ligand complexes are a prerequisite for the agonistic activity of the antibodies. / In dieser Arbeit wurden bispezifische Antikörper durch Kopplung von TNFR-spezifischen Antikörpern mit Checkpoint-Inhibitoren hergestellt, auf ihre Funktionalität getestet und miteinander verglichen. Diese Kombination sollte eine gezielte TNFR-Aktivierung im Tumorgewebe ermöglichen, wo eine hohe PDL1-Expression häufig ist und daher die Bildung oligomerer transaktivierender (TNFSF3-TNFRSF3)2-Komplexe nur dort durch Bindung an PDL1-exprimierende Zellen erfolgen sollte. Diese Rezeptor-Liganden-Komplexe sind eine Voraussetzung für die agonistische Aktivität der Antikörper.

Today, a lot of proteomic research is aimed at discovering disease specific proteins. This requires theavailability of high-throughput, ultra-sensitive protein detection methods. Compartmentalized immunosequencing(cI-Seq) is a proximity-independent immuno-polymerase chain reaction (IPCR) based proteindetection method. Antigen recognition in cI-Seq is mediated by antibody pairs in which one of theantibodies is conjugated to a DNA-probe. The affinity recognition events occur in emulsion droplets inwhich the DNA-probes will be amplified through emulsion PCR (emPCR) and thereafter analyzed usingMassively Parallel Sequencing (MPS). The amplifiable nature of the DNA-probes improves the sensitivityof the detection, while the use of emulsion droplets and MPS increases the multiplex capacity andthroughput. Ultimately, cI-Seq enables analysis and detection even of lowly abundant proteins therebyincreasing the probability of discovering novel disease specific proteins. In this project, conjugation of DNA probes to antibodies was performed through two different approaches;Covalent Conjugation and Conjugation using Biotin and NeutrAvidin. Both of these approaches showedadvantageous and disadvantageous features. However, neither of them succeeded in producing stableconjugates in an efficient and reproducible manner. After conjugation, the DNA-conjugated antibodieswere used in immune complex formation. However, the immune complexes either failed to form or wereformed in an inefficient manner.

Il a été montré que les fonctions et la prolongation de la survie cellulaire des neutrophiles humains par les médiateurs de l'inflammation tendent à diminuer avec le vieillissement. Les protéines tyrosines phosphatase (PTPs), comme SHP-1, sont un des mécanismes qui permettent de moduler à la baisse et de terminer ces fonctions inflammatoires qui sont modulées par l'action des cytokines. Nous avons étudié le rôle des PTPs dans l'altération due au vieillissement des fonctions des neutrophiles humains. L'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique des PTPs a suggéré une dérégulation de l'activité phosphatasique avec le vieillissement. Cette dérégulation était confirmée aussi dans le cas de l'apoptose mesurée après 18 heures d'incubation. L'activité phosphatasique de SHP-1 purifiée par immunoprécipitation de neutrophiles de sujets jeunes ou âgés stimulés par le GM-CSF est altérée de façon significative après une minute de stimulation chez les sujets âgés. Dans les sujets jeunes SHP-1 est déplacée des radeaux lipidiques après 1 minute de stimulation par le GM-CSF alors que chez les sujets âgés, SHP-1 est présente à tous les temps de stimulation utilisés. Des immunoblots faits avec des anticorps anti-phosphotyrosine et anti-phosphosérine ont montré une augmentation de la phosphorylation en sérine dans les neutrophiles des sujets jeunes après une stimulation au GM-CSF alors que ce n'était pas le cas chez les sujets âgés. Nous avons aussi trouvé des altérations dans l'activation et le recrutement aux radeaux lipidiques de la Src kinase Lyn chez les neutrophiles des sujets âgés. De plus, nous avons démontré que SHP-1 est continuellement recrutée à Lyn chez les sujets âgés alors que cette interaction, qui est observée dans des cellules non stimulées chez les sujets jeunes, est défaite par la stimulation au GM-CSF. En conclusion, les altérations observées dans la modulation de l'activité de SHP-1 par le GM-CSF dans les radeaux lipidiques sont un des facteurs qui contribuent à la diminution des effets du GM-CSF sur les neutrophiles humains avec le vieillissement.