Circa l’1% della popolazione mondiale è colpita da celiachia. I celiaci sono costretti a seguire una dieta priva di glutine e molto spesso quest’ultima risulta essere sbilanciata e/o carente in molti nutrienti. Recentemente, l’uso di matrici alternative al frumento, come pseudocereali, legumi e cultivar di riso pigmentate sta riscuotendo grande interesse a causa del loro elevato quantitativo di composti bioattivi (polifenoli). Quindi, considerando l’importanza attuale dei polifenoli sia nella formulazione tecnologica che nella promozione di aspetti salutistici degli alimenti senza glutine, lo scopo di questa tesi è stata basata su: 1) profilazione dei polifenoli in matrici prive di glutine (farine non di frumento, legumi, pseudocereali e frutta secca) e loro proprietà antiossidanti in vitro; 2) valutazione dell’impatto di trattamenti termici e di fermentazioni microbiche sul profilo fenolico di queste matrici prive di glutine; 3) valutazione del ruolo dei polifenoli come inibitori degli enzimi amilolitici; e 4) valutazione del destino dei polifenoli caratterizzanti alimenti senza glutine durante processi in vitro simulanti digestione gastrointestinale e fermentazione fecale. I polifenoli sono stati analizzati sfruttando tecniche di metabolomica mirata/non-mirata. / Around 1% of world population is affected by coeliac disease. Coeliac people are constrained to follow a strict gluten free (GF) diet and very often this latter is unbalanced and lacks in many nutrients. In the last years, the exploitation of alternative crops or underutilized species, such as pseudocereals, legumes and pigmented cereal cultivars, is gaining interest because of their amount and profile of bioactive compounds, such as polyphenols. Therefore, considering the actual importance of polyphenols for both the formulation of GF foods and their health-promoting properties, the current PhD thesis was based on: 1) the profiling of polyphenols in GF raw materials (such as non-wheat flours, legumes, pseudocereals and nuts) and their in vitro antioxidant activities; 2) the evaluation of the impact of different heat treatments and microbial fermentations on the phenolic profile of GF raw materials; 3) the investigation of polyphenols in GF foods as inhibitors of digestive enzymes; and 4) the assessment of the fate of polyphenols characterizing GF foods during simulated in vitro gastrointestinal and fermentation processes. Polyphenols were analysed by means of targeted/untargeted metabolomics-based approaches (i.e., high resolution chromatography and mass spectrometry platforms).

Foram realizados seis experimentos in vitro com o objetivo de avaliar a eficiência de diversos microrganismos em solubilizar uma fluorapatita proveniente de Catalão, Goiás. Também foram avaliados os efeitos de doses de fluorapatita, do tempo de cultivo e da solubilização parcial da fluorapatita com ácido sulfúrico sobre a solubilização biológica do fosfato de rocha. O estudo foi realizado à temperatura ambiente utilizando-se uma solução de glicose com nutrientes minerais ou vinhaça esterilizada e não-esterilizada como meios de cultura. Seis culturas de fungos filamentosos foram selecionadas por terem apresentado elevado poder de solubilização em meio contendo glicose e nutrientes. Destas, duas culturas de Aspergillus niger foram mais eficientes em solubilizar a fluorapatita em todas as condições de cultivo estudadas. Nos cultivos com prazos superiores há 21 dias ocorreram os maiores teores de fósforo solúvel. Aspergillus niger apresentou maior solubilização em baixas doses, e Penicillium sp em doses elevadas. Correlações entre pH e fósforo solubilizado dependeram dos meios de cultivo empregados. Não houve mudança na composição mineralógica da fluorapatita devido ao ataque fúngico, embora Aspergillus niger tenha solubilizado uma quantidade de fósforo equivalente à encontrada em fluorapatita 25% solubilizada por H2SO4 / Six experiments were carried out in vitro in order to evaliuate the effectiveness of several microrganisms in solubilizing a fluorapatite proceeding from Catalão, State of Goiás, Brazil. It was also evaluated the effects of rates of applied fluorapatita, time of cultivation, and previous partial solubilization on the biological solubilization of the rock phosphate. The study was conducted at ambient temperature using a glucose plus nutrients solution, as well as a sterilized and non-sterilized sugar cane vinasse as culture medium. Six filamentous fungi were selected as the most effective phosphate solubilizers when the culture medium was glucose plus nutrients solution. Among these, two cultures of Aspergillus niger were the most effective under any of the studied culture conditions. The highest levels of soluble phosphate were observed when the cultivation period was longer than 21 days. Aspergillus niger showed the highest solubilization rates at low levels of fluorapatite, whereas Penicillium sp was most effective at the higher levels. The composition of the culture media influenced the phosphorus solubilization by fungi, so that the correlation between pH and soluble phosphate varied depending on the medium used. No changes in the mineral composition of the fluorapatite due to fungal activity was observed, although Aspergillus niger had solubilization an amount of phosphate equivalent to that found in the fluorapatite 25% solubilized by sulfuric acid

O presente trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologia in vitro e associá-la à mutagênese, e avaliar plantas V 5 e V6 quanto aos caracteres agronômicos de produção em área de ocorrência da doença fusariose, visando ao melhoramento genético da pimenta-do-reino para obtenção de plantas tolerantes e/ou resistentes à doença fusariose. A aplicação das técnicas in vitro iniciou-se através da obtenção de plantas doadoras de explantes, a partir de estacas em casa-de-vegetação e, de sementes e embriões zigóticos in vitro. O processo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas de plantas obtidas in vitro através do estabelecimento de condições adequadas de cultivo em meios de cultura apropriados para multiplicação de gemas, enraizamento e obtenção de "plantlets", e de tipo de substrato para aclimatação e formação de mudas. Após a definição deste processo, gemas de plantas de casa-de-vegetação foram submetidas a diferentes tratamentos de assepsia e as sobreviventes micropropagadas. Seleção in vitro foi estabelecida ao cultivar isolados patogênicos do fungo Fusarium solani f. sp. piperis em meio Czapek-Dox e, através da curva de crescimento foi estabelecido o período de 28 dias de cultivo mais adequado para obtenção de filtrado da cultura do fungo. Diferentes concentrações de filtrado e formas de esterilização foram testadas em meio de cultura de multiplicação de gemas e determinou-se a concentração de 55% do filtrado do fungo (v/v) sob a esterilização por duas autoclavagens, adequada para causar 100% de mortalidade de gemas susceptíveis à doença. Simultaneamente, testes de radiossensitividade foram desenvolvidos através da irradiação gama em gemas in vitro e a dose de 20Gy foi escolhida para indução de mutações. As gemas irradiadas que passaram por vários ciclos de multiplicação e sobreviveram ao agente seletivo, filtrado de cultura do fungo, estão sendo clonadas para serem submetidas à seleção artificial com esporos do fungo em casa-de-vegetação, seleção natural em campo de ocorrência da doença e avaliação agronômica. Testes indicaram, a concentração de 2x10 6 esporos/ml em suspensão e a aplicação no solo do fungo adequada para seleção em casa-de-vegetação. As plantas V5 e V6 avaliadas em campo quanto a mortalidade e caracteres de produção apresentaram performance semelhante às plantas da cultivar original quanto à média de comprimento de espiga (8,4 cm), peso (4,42g) e número de frutos (40 frutos) por espiga, peso de 100 frutos (10,67g) e rendimento de pimenta preta (> 30%). Entretanto, melhores resultados para a média de produção de pimenta verde (3.290g) e sobrevivência em área de ocorrência da fusariose. As análises por componentes principais e variáveis canônicas apresentaram divergência genética entre as plantas originadas por estacas que sofreram irradiação gama e aquelas da cultivar original. / The purposes of the present work were to develop in vitro technology, associating it with mutagenesis, and to evaluate the V5 and V6 plants based on agronomical characters of production in Fusarium incidence areas, aiming at the genetic improvement of black pepper to obtain tolerant and/or resistant plants to the disease. The use of in vitro techniques started with the production of explant donor plants from greenhouse-grown cuttings and from seeds and in vitro zygotic embryos. The micropropagation process was developed using young shoots of in vitro plants by establishment of proper growing conditions in culture media for multiplication, rooting and production of plantlets, and by determining a suitable substrate type for acclimatization and growing of plantlets. After the process was defined, young shoots obtained from greenhouse grown plants underwent different aseptic treatments and the surviving plantlets were micropropagated. In vitro selection was carried out by cultivating pathogenic isolates of Fusarium solani f. sp. piperis in Czapek-Dox medium and, by using a growing curve, the most suitable growing period (28 days) for obtaining the fungus culture filtrate was defined. Different filtrate concentrations and sterilization techniques were tested in culture medium for young shoot multiplication. A concentration of 55% (v/v) of fungus filtrate under sterilization by double autoclavation was considered adequate to cause 100% mortality of fusariosis susceptible young shoots. Simultaneously, radiosensitivity tests were carried out through gamma irradiation of in vitro young shoots and dose of 20Gy was selected for mutation induction. Irradiated young shoots which underwent several multiplication cycles and survived the selective agent, fungus culture filtrate, are being cloned in order to be submitted to artificial selection with the fungus spores in greenhouse, to natural selection in a disease incidence area and to agronomical evaluation. These tests indicated that the concentration of 2x10 6 spores/ml in suspension and the application of the fungus on soil were appropriate for greenhouse selection. The V5 and V6 plants evaluated in field conditions for mortality and production characters showed similar performance to the original cultivar plants regarding average height (8.4 cm), weight (4.42g) and number of fruits (40 fruits) per spike, weight of 100 fruits (10.67g) and black pepper yield (>30%). However, better results were observed for average green pepper production (3,290g) and survival rates in a fusariosis incidence area. Analyses of principal components and canonic variables evidenced genetic divergence between plants grown from gamma-irradiated cuttings and the original cultivar ones.

Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2015-08-10T18:31:31Z No. of bitstreams: 3 license_text: 21490 bytes, checksum: 7ff346999f7486617a4302c4f2f02bc7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2015EvelineSimonetti.pdf: 2527066 bytes, checksum: ee30959f60e3f2443928f47e6896623c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2015-08-17T20:05:21Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_text: 21490 bytes, checksum: 7ff346999f7486617a4302c4f2f02bc7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2015EvelineSimonetti.pdf: 2527066 bytes, checksum: ee30959f60e3f2443928f47e6896623c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-17T20:05:21Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_text: 21490 bytes, checksum: 7ff346999f7486617a4302c4f2f02bc7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2015EvelineSimonetti.pdf: 2527066 bytes, checksum: ee30959f60e3f2443928f47e6896623c (MD5) / As doenças transmitidas por alimentos ocorrem por diversos motivos sendo principalmente devido à ingestão de alimentos contaminados por microrganismos patogênicos, dentre eles a Escherichia coli e Listeria monocytogenes. Uma das alternativas que vêm sendo estudada para minimizar a contaminação é o emprego de plantas como antimicrobiano de origem natural em produtos alimentícios. Desta forma o objetivo do presente estudo foi fornecer dados científicos a respeito de duas plantas nativas do RS ainda não estudadas, Eugenia anomala e Psidium salutare, para um potencial emprego como antimicrobiano natural em alimentos. Para tanto, avaliou-se a atividade antimicrobiana de extratos de E. anomala e P. salutare contra E. coli e L. monocytogenes através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pelo método de microdiluição, a capacidade antioxidante dos extratos por meio do método de redução do radical 1,1-difenil-2-picrilidrazil (DPPH) e a citotoxicidade in vitro empregando células CHO-K1. Os resultados obtidos mostraram que os extratos de acetato de etila e etanólico de ambas as espécies vegetais possuem ação antioxidante comparável a do padrão. Quanto à atividade antimicrobiana, somente o extrato hexânico de P. salutare apresentou tal ação sendo ela moderada (CIM=312,5 μg/mL) e à citotoxicidade todos os extratos apresentaram ação citotóxica sendo que o extrato clorofórmico de E. anomala e hexânico de P. salutare apresentaram elevada ação e os demais extratos moderada ação citotóxica a uma concentração de 100 μg/mL. Assim, o presente estudo demonstrou que as espécies vegetais estudadas apresentam potencial para emprego em antimicrobiano sendo necessária a otimização do processo de extração. / The foodborne diseases occur for various reasons and mainly due to the ingestion of food contaminated by pathogenic micro-organisms, including Escherichia coli and Listeria monocytogenes. One of the alternatives that have been studied to minimize contamination is the use of plants as an antibacterial of natural origin in food products. Therefore, the objective of this study is to provide scientific data on two native plants of RS have not studied, Eugenia anomala and Psidium salutare for a job potential as natural antimicrobial in food. To this end, we evaluated the antimicrobial activity of extracts of E. and P. anomala salutare against E. coli and L. monocytogenes by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) by the broth microdilution method, the antioxidant activity of the extracts by means of method of reducing the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical and in vitro cytotoxicity using CHO-K1 cells. The results showed that the extracts of ethyl acetate and ethanol of both species have antioxidant activity comparable to the standart. As for antimicrobial activity, only the hexane extract of P. salutare showed such action being her moderate (MIC = 312.5 μg/mL) and cytotoxicity all extracts showed cytotoxic action of which the chloroform extract of E. anomala and hexane P. salutare presented high action and the other moderate cytotoxic action extracts at a concentration of 100 μg/mL. Thus, the present study showed that plant species have potential for use in antimicrobial requiring the optimization of the extraction process.

Made available in DSpace on 2018-08-01T23:26:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10243_66-Drielly Stephania Gouvea.pdf: 1399699 bytes, checksum: e6b26f6146f35ffd98e203f6bc0a8018 (MD5) Previous issue date: 2016-06-28 / A embriogênese somática é o processo de desenvolvimento de embriões a partir de células somáticas. Objetivou-se com este trabalho analisar a eficiência de reguladores de crescimento nas diferentes fases da embriogênese somática indireta a partir de plantas in vitro do mamoeiro hermafrodita hibrido UENF/Caliman 01. Discos foliares destas brotações foram inoculadas em meio de indução (MI): meio MS (Murashige; Skoog, 1962), com concentração total de sais, e suplementado com auxinas, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)(6; 9; 12; 15 e 18 μM) e ácido 4- clorofenoxiacético (4-CPA)(19; 22; 25; 28 e 31 μM). Os tratamentos foram dispostos em delineamento inteiramente casualizados (DIC), com cinco repetições, e cinco explantes por repetição. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e as médias comparadas pelo teste de Skott-Knott em nível de 5% de significância. Ao transcorrer, 90 dias da indução, visualizou-se a formação de alguns embriões somáticos nos calos friáveis formados. As concentrações da auxina 2,4-D, foram inibitórias, ocorrendo somente a formação de calos de coloração marromclara, os quais tiveram resultados inferior a 20% na formação de embriões somáticos, enquanto a suplementação com 4-CPA resultou em 96% de calos embriogênicos para a concentração de 25 μM. Os calos embriogênicos, foram ix transferidos para o meio de maturação (MM): MS sem regulador de crescimento; ABA ácido abiscísico (0,5 μM); ABA (0,5 μM) + CA carvão ativo (15 g L-1); ABA (0,5 μM) + CA (30 g L-1); ABA (0,5 μM) + PEG polietilenoglicol (60 g L-1) durante 30 dias. Foram observadas diferenças significativas entre os meios de maturação testados, uma reação positiva em relação a quantidade de embriões desenvolvidos e os efeitos de cada tratamento. O meio de maturação constituído de ABA 0,5 μM + CA 30 g L-1 foi o mais eficiente no desenvolvimento de embriõessomáticos cotiledonares. Estes embriões cotiledonares maduros, foram inoculados em meio de germinação (MG): MS sem regulador de crescimento; GA3 (0,5 mg L-1); GA3 (1,0 mg L-1) e GA3 (1,5 mg L-1).

Submitted by Bruno Martinucci null (martinucci.bruno@ibb.unesp.br) on 2017-03-23T12:44:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação.pdf: 4223949 bytes, checksum: 231b0f2acac0e4ee8296d480b95afa5d (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-23T15:00:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martinucci_b_me_bot.pdf: 4223949 bytes, checksum: 231b0f2acac0e4ee8296d480b95afa5d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T15:00:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martinucci_b_me_bot.pdf: 4223949 bytes, checksum: 231b0f2acac0e4ee8296d480b95afa5d (MD5) Previous issue date: 2017-02-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer de próstata (CaP) continua a ser uma das principais causas de morte entre os homens. Mesmo com suas altas taxas de mortalidade e incidência, pouco ainda se sabe sobre os aspectos moleculares desta doença. Entre os diversos fatores envolvidos na carcinogênese prostática, elementos da matriz extracelular (MEC) desempenham papel fundamental. Na próstata, a fibronectina (FN), proteína multimodular que tem sido relacionada ao desenvolvimento de múltiplos tipos de câncer, a migração e invasão celular, tem sua expressão restrita ao compartimento estromal. Contudo, no desenvolvimento tumoral, o padrão de expressão da FN é alterado, com secreção desregulada e falta de organização da matriz. Desta forma, para investigar o impacto da FN no CaP, as células neoplásicas LNCaP foram expostas somente à FN solúvel (25μg/mL) e em combinação com uma membrana basal. Nossos resultados demonstraram que quando a FN é o elemento predominante, as células tumorais desenvolvem um comportamento invasivo e resistência à apoptose. No entanto, na presença de uma membrana basal, a FN diminuiu o potencial maligno e metastático destas células, que neste novo ambiente exibiam perfil de expressão gênica mais semelhante às células RWPE-1, linhagem celular que ilustra as características do epitélio prostático normal. Consequentemente, sabendo que a relação entre as células tumorais e a MEC é regulada em múltiplos níveis, os microRNAs emergiram como importantes moléculas reguladoras. Portanto, também investigamos o impacto da FN na expressão de miRNAs em células LNCaP e PC-3. Nossos resultados mostraram que cinco miRNAs apresentavam expressão diferencial (miR-21, miR-29b, miR-125b, miR-221 e miR-222) após exposição à FN. Para uma análise mais profunda, analisamos a expressão regular de possíveis mRNAs alvos destes miRNAs em dados de RNAseq disponíveis, construímos redes de interação protéica baseadas no banco de dados STRING e realizamos as análises de enriquecimentos de via e de função gênica para avaliarmos de maneira mais abrangente os possíveis efeitos desta proteína. De maneira geral, nosso estudo mostrou que a FN pode estar envolvido na progressão do CaP através da modulação de vias de sinalização, como PI3K/AKT, resposta a drogas e hipóxia. Desta forma, acreditamos que nossos resultados fornecem a base para estudos futuros, abordando o papel da FN no crescimento tumoral, particularmente no contexto de evolução/progressão do câncer de um tumor primário sólido para um estado circulante transitório. / Prostate cancer (PCa) continues to be a leading cause of death among men. Even with its high mortality and incidence rates, little is known about the molecular aspects of this disease. Among the various factors involved in the carcinogenesis of the prostate, components of the extracellular matrix (ECM) play key roles. In the prostate, fibronectin (FN), a multimodular protein that has been linked to the development of multiple cancers and involved with cell migration and invasion, has its expression restricted to the stromal compartment. However, in tumor development, the pattern of expression of FN becomes altered, with deregulated secretion and a lack of matrix organization. Thus, in order to investigate the impact of FN on PCa, the neoplastic cells LNCaP were exposed only to soluble FN (25μg/mL) or in combination with a basement membrane. Our results demonstrated that when FN is the predominant element, tumor cells develop an invasive behavior and become resistant to apoptosis. However, in the presence of a basement membrane, FN decreases the malignant and metastatic potential of these cells, which in this new environment displayed a gene expression profile more similar to the RWPE- 1 cells, a cell line that illustrates the characteristics of the normal prostate epithelium. Consequently, knowing that the relationship between tumor cells and the ECM is regulated at multiple levels, microRNAs have emerged as important regulatory molecules. Therefore, we also investigated the impact of FN on the expression of miRNAs in LNCaP and PC-3 cells. Our results showed that five miRNAs exhibited differential expression (miR-21, miR-29b, miR- 125b, miR-221 and miR-222) after exposure to FN. For a more in-depth analysis, we analyzed the basal expression of mRNAs possibly targeted by these miRNAs in published RNAseq data, constructed protein interactions networks based on the STRING database, and performed pathway enrichment and gene function analyzes to evaluate more comprehensively the possible effects of this protein. Overall, our study showed that FN may be involved in the progression of PCa through the modulation of signaling pathways, such as PI3K/AKT, drug response and hypoxia. Thus, we believe that our results provide the basis for future studies addressing the role of FN in tumor development, particularly in the context of cancer progression from a solid primary tumor to a transient circulating state. / FAPESP: 2014/25702-0

Ce travail porte sur la fonctionnalisation en volume et/ou en surface et la caractérisation multi-échelle de films minces de chitosane utilisés en ingénierie tissulaire. L’ajout des nanoliposomes à base de lécithine naturelle (végétale ou marine) et un traitement plasma sont employés pour réaliser ces deux fonctionnalisations. De nombreuses analyses des caractéristiques physico-chimiques et « structurales » de films minces ont montré que lorsqu’on ajoute 10 % de nanoliposomes dans les films de chitosane, l’hydrophobicité de la surface s’améliore de 18 à 36 %, ce fait est attribué à la présence de composants polaires. La cristallinité est légèrement augmentée ; à 37 °C, le module d’Young diminue de 6 GPa environ jusqu’à près de 4 GPa ; aucune nouvelle liaison ne se crée entre le chitosane et les nanoliposomes ; une diminution de degré de déacétylation est observée, qui pourrait être associée à la conformation des nanoliposomes ajoutés en volume aux films de chitosane. Le traitement plasma a réussi à modifier la structure de surface du chitosane seul et du chitosane mélangé aux nanoliposomes par greffe de groupements actifs (groupes amine, C-O, COOH, -OH). En revanche, dans notre cas, les liaisons hydrogène entre les groupes polaires créés par le traitement plasma peuvent être éliminées partiellement après un temps donné, ce qui limite l’application du traitement. Ensuite, des études préliminaires sur la biocompatibilité in vitro et la biodégradabilité in vitro sont réalisées pour les films de chitosane et du chitosane mélangé aux nanoliposomes. Les cellules souches mésenchymateuses sont utilisées pour l’étude de la première, et une solution de PBS contenant 10 mg/L de lysozyme pour la seconde. Les propriétés physico-chimiques des films de chitosane mélangé aux nanoliposomes marines, leur faible cytotoxicité aux cellules et leur stabilité dans la solution de PBS contenant du lysozyme leur permettent d’être utilisés comme matrice de support dans le domaine de la médecine régénérative / This work focused on functionalized chitosan thin films in the bulk and/or on the surface by nanoliposomes based on natural lecithin (plant and marine) and plasma treatment. Various techniques were used for physicochemical properties analysis of functionalized thin films. The results showed that by adding the nanoliposomes into the chitosan scaffold, the surface wettability of thin films increased from 18 % to 36 %. The crystallinity degree was slightly improved in blend thin films. Any new bond was determined by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), which confirmed that there is no chemical interaction between the nanoliposomes and chitosan. The Young’s modulus of blend thin films deceased from 6 GPa to 5 GPa. The morphological, nanomechanical properties and adhesion force of each scaffold system determined by Scanning Probe Microscopy (HarmoniXTM mode) showed that the fish nanoliposomes/chitosan thin film had the most similar properties compared to the pure chitosan thin film. The surface of chitosane films and nanoliposomes/chitosane blend films were modified by the plasma treatment. Functional groups (amine groups, C-O, COOH, -OH) are grafted onto the surface enhancing thus the surface energy of the films. But the hydrogen bonds between the polar groups introduced by the treatment can be destroyed after a given time; the author proposed that the functionalization in the bulk by adding of nanoliposomes provided more stable and greater possibility of new materials producing than the functionalization at the surface by plasma treatment for potential tissue engineering application. Then, in vitro biocompatibility preliminary study was carried using human mesenchymal stem cells (hMSCs); and in vitro biodegradability study was tested in the phosphate buffered saline (PBS) mixed with 10 mg/L lysozyme. The films of chitosan functionalized by salmon nanoliposomes showed more interesting as matrix extracellular for regenerative medicine applications because of their physico-chemical properties, low cytotoxicity and the stability inside the PBS and lysozyme solutions.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T18:55:13Z No. of bitstreams: 1 117110032.pdf: 700015 bytes, checksum: 794f9c0fa96f18e2200227f043531c61 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T18:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 117110032.pdf: 700015 bytes, checksum: 794f9c0fa96f18e2200227f043531c61 (MD5) Previous issue date: 2013-08-02 / A maturação in vitro (MIV) é um dos pontos críticos da produção in vitro de embriões bovinos, sendo que vários fatores podem interferir na MIV, como a tensão de oxigênio e a densidade de oócitos por volume de meio. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da tensão de oxigênio associada a diferentes densidades de oócitos durante a MIV. Para tanto, três experimentos foram conduzidos com oócitos bovinos obtidos de ovários de abatedouro. O experimento I consistiu na avaliação da maturação citoplasmática e nuclear, o experimento II na avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e atividade antioxidante, e o experimento III na avaliação das taxas de fecundação in vitro. Após a seleção, os oócitos foram submetidos a MIV distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos: Tratamento 1:10/5%: 1 oócito em 10μl de meio de MIV em 5% de O 2 ; Tratamento 1:10/20%: 1 oócito em 10μl de meio em 20% de O 2 ; Tratamento 1:20/5%: 1 oócito em 20μl em 5% de O 2 e Tratamento 1:20/20%: 1 oócito em 20μl de meio em 20% de O 2 . A MIV foi conduzida em grupos de 15 oócitos em meio TCM 199 modificado, acrescido de FSH, LH, EGF, soro de égua em estro (SEE) e piruvato por 24h. Decorrido o período de MIV foi conduzida a fecundação in vitro em gotas de 300μl de meio Fert-TALP, sendo realizada pelo co-cultivo de oócitos e espermatozóides (2x10 6 sptz/mL) selecionados por gradientes de mini-Percoll por 18h. No experimento I, as taxas de maturação nuclear (69,66%) e maturação citoplasmática (71,55%) foram similares entre os tratamentos (P>0,05). No experimento II, a produção de ROS foi avaliada nos oócitos e no meio de MIV, assim como a atividade antioxidante foi avaliada após 24 h de MIV. A produção de ROS pelos oócitos foi superior nos tratamentos com baixa tensão de oxigênio (5%; 13,3UF) em relação a alta tensão de oxigênio (20%; 7,0UF) independentemente da densidade de oócitos (P<0,05). Os níveis de ROS detectados no meio de MIV foram superiores nos tratamentos com alta densidade de oócitos (1:10) independentemente da tensão de oxigênio (P<0,05). A atividade da SOD (21,3UI) e os níveis de GSH (6,95 nmol GSH/ml) mensurados nos oócitos foram similares entre os tratamentos (P>0,05). As taxas de fecundação e penetração foram superiores nos tratamentos com 20% de O 2 e com alta densidade de oócitos (1:10; 48,8%) em relação aos tratamentos 1:10/5% (29,5%) e 1:20/20% (29,1%; P<0,05). Adicionalmente a taxa de polispermia foi maior no tratamento com alta tensão de oxigênio e baixa densidade de oócitos. (1:20/20%; 27.8%) em relação ao tratamento 1:10/20% (13,41%; P<0,05). Os resultados deste estudo mostram interação entre a tensão de oxigênio e a densidade de oócitos aumentando a produção de ROS em determinadas associações e influenciando posteriormente as taxas de fecundação in vitro de oócitos bovinos. / The in vitro maturation is one of the critical points on in vitro production of bovine embryos so many factors can do an interference on IVM, like oxygen tension and oocyte density by volume of medium. The aim of this study was evaluate the effects of association of oxygen tension with different oocyte density during IVM Three experiments were performed with bovine oocytes obtained from abattoir ovaries, on experiment I was performed the nuclear and cytoplasmic evaluation, on the experiment III the biochemical assay of ROS production and antioxidant activity and on experiment III was realized the evaluation of in vitro fertilization. After selection, the oocytes were randomly distributed in 4 treatments: Treatment 1:10/5%: 1:10µl in 5% of O2; Treatment 1:10/20%: 1:10µl in 20% of O2; Treatment 1:20/5%: 1:20µl in 5% of O2; Treatment 1:20/20%: 1:20µl in 20% of O2. The IVM was performed in droplets (150µl or 300µl) of TCM 199 plus FSH, LH, EGF, EMS and pyruvate. The IVF were performed in droplets (300µl) of Fert-TALP. Was realized IVF with oocytes and spermatozoa (2x106 sptz/mL) selected by Percoll density gradients for 18h. On experiment I, the nuclear maturation rates (69.66%) and reorganization mitochondrial (71.55%) rates were similar among treatments (P>0.05). In Experiment II, the ROS production in oocytes, IVM medium and antioxidant activity were evaluated after 24 h of IVM. ROS production in oocytes was higher on treatments with low tension (5%; 13.3 UF) than 20% oxygen tension (7.0 UF) independently of oocyte density (P<0.05). ROS levels on IVM medium was higher on treatments with high oocyte density (1:10) independently of oxygen tension (P<0.05). The GSH levels (6.95 nmol GSH/ml) and SOD activity (21.3UI) were similar among treatments (P>0.05). The rates of normal fertilization and normal penetration were higher in treatments with 20% of O2 with high oocyte density (1:10;48.8%) than treatments 1:10/5% (29.5%) and 1:20/20% (29.1%; P<0.05). In addiction the polysperm rates were higher on treatment with high oxygen tension and low oocyte density (1:20/20%; 27.8%) than treatment 1:10/20% (13.4%; P<0.05). The results of this study show an interaction between oxygen tension and oocyte density, that increase ROS production on certain associations and subsequently affects the IVF rates. / The viruses are significant important pathogenic agents of several animal species, including cattle. In Brazil, several viral agents causing infections have been described in cattle and they produce significant economic losses. The identification of animals infected by a virus can be performed in different ways; however, definitive confirmation requires demonstration of the agent or immune response. For this purpose, various methods with the capacity to detect the viral particle, biological activity, genome, viral antigens, or specific immune response have been developed. Immunoassays are widely used in laboratory routine for detection of viral antigens in clinical or research. These assays exhibit good sensitivity, specificity and easy for implantation. The immunoassay methodologies are based on the employment of monoclonal or polyclonal antibodies specific to the viral antigens. Therefore, the aim of this study was to produce polyclonal antibodies for some bovine virus, and evaluate their reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot tests. For this purpose, strains and/or isolates of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), bovine herpesvirus type 2 (BoHV-2), bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), bovine herpesvirus type 5 gE deleted (BoHV-5 gEΔ), bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bluetongue virus (BTV), and vaccinia virus (VACV) were amplified in cell culture and the supernatant were used to immunize rabbits. The animals were immunized five times by the subcutaneous route, and five days after the last boost the blood was collected. The serum was obtained by centrifugation. The serum was diluted (1:100 a 1:204.800) and used as primary antibodies in the immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. The working dilution was selected among those produced specific reaction with infected cells and absent or weak background in control cells. The antiserum showed higher reactivity in immunoperoxidase technique than the immunofluorescence and slot blot. The antiserum of the BoHV-1, BoHV-5, BVDV and BRSV presented the reactivity when tested with heterologous isolates in immunofluorescence, immunoperoxidase assays. In summary, that the polyclonal antibodies raised in rabbits have high concentrations of specific antibodies, which were demonstrated by the reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. Additionally, these reagents can be considered an important tool for the detection and characterization of various bovine viruses in diagnostic and research routine.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa los tres tiempos de co-incubación entre gametos bovinos durante la fecundación In vitro, para luego determinar las tazas de división y desarrollo embrionario al día 7 post fecundación. Ovocitos bovinos fueron obtenidos mediante aspiración folicular, fueron madurados In vitro y luego se inseminaron con una concentración de 1,5x106 esp/ml en medio TL-STOCK a 38,5º C, 5% de CO2 y atmósfera saturada de humedad. Luego de 6 horas (T1=245), 12 horas (T2=278) y 18 horas (T3=287) de co-incubación, los Complejos Cumulus-Ovocito (CCOs) con los espermatozoides adheridos al cumulus, se retiraron de las gotas de fecundación y fueron lavados y transferidos a gotas con medio de incubación. Los presuntos cigotos se cultivaron In vitro, en un primer cultivo en medio KSOM y posteriormente en medio de cultivo SOF hasta el término de la evaluación del desarrollo embrionario. La evaluación del efecto tiempos de cocultivo sobre las tasa de división y de blastocistos se realizó mediante la prueba paramétrica de análisis de varianza A las 72 horas de fecundación se obtuvieron tasas de división, ≥ 2 células de: 38.3%, 63.3% y 73.4% para los grupos T1, T2 y T3 respectivamente. Al comparar las tasas de división, sólo se encontró diferencia estadística significativa entre los grupos T1 y T2 y T1 y T3, (p<0.05). Al día 7 de cultivo, la tasa de desarrollo de blastocistos fue de 24.4%; 21.6% y 24.6% para los grupos T1, T2 y T3 respectivamente, no encontrándose diferencia estadística significativa entre los grupos. Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que no existe diferencia estadística entre los tres grupos evaluados respecto al desarrollo embrionario al estadio de blastocisto, lo cual sugiere que al co-incubar gametos bovinos por 6,12 ó 18 horas se pueden obtener embriones de las mismas características que los obtenidos con los protocolos tradicionales. / Tesis

Tese de mestrado. Estatística Aplicada e Modelação. 2005. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar