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京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(薬科学) / 甲第21715号 / 薬科博第106号 / 新制||薬科||11(附属図書館) / 京都大学大学院薬学研究科薬科学専攻 / (主査)教授 山下 富義, 教授 髙倉 喜信, 講師 樋口 ゆり子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico encontrado em grandes quantidades no cigarro, em medicamentos e alimentos, além de ser um dos mais importantes metabólitos tóxicos do benzeno (BZ). Temos mostrado que a exposição sistêmica à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Complementando estas investigações, o objetivo do presente projeto foi investigar o efeito da exposição ambiental à HQ sobre o recrutamento leucocitário para o pulmão induzido pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS) e sobre os eventos celulares envolvidos neste processo, bem como sobre a formação de adutos de DNA no tecido pulmonar. Para tanto, 12,5, 25 ou 50 ppm de HQ ou veículo (solução salina 5% de etanol) foram nebulizadas em caixa de exposição (60 mL/1h; 5 dias) onde 5 camundongos Swiss machos estavam alocados. Uma hora após as últimas exposições, a inflamação pulmonar foi induzida pela inalação de LPS (0,1 mg/mL; 10 min). Os animais expostos à HQ e na vigência ou ausência de inflamação foram empregados para: 1) coleta do lavado broncoalveolar (LBA) três horas após a inalação de LPS para quantificação do número de leucócitos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); 2) coleta de sangue para quantificação do número de leucócitos circulantes antes e 3 horas após a inalação de LPS (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); para a quantificação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos de animais não inflamados induzida ou não pelo formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) in vitro (citometria de fluxo); para obtenção de plasma para quantificação de malonaldeído (HPLC) e de neutrófilos para quantificação de espécies reativas de oxigênio intracelular (EROs; citometria de fluxo) de animais não inflamados pelo LPS; 3) coleta de tecido pulmonar para quantificação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais e para quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) 3 horas após a inalação de LPS e para quantificação de adutos de DNA em tecido de animais não inflamados. Adicionalmente, a concentração de HQ na caixa de exposição foi quantificada por HPLC. Os resultados obtidos mostraram que a exposição à HQ não afetou os números de leucócitos circulantes, mas reduziu o número de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) no LBA; aumentou a atividade de MPO no tecido pulmonar; reduziu a expressão de L-selectina em PMN estimulados in vitro pelo fMLP; aumentou a expressão de β2 integrinas em PMN na vigência ou ausência (basal) de estimulação pelo fMLP; aumentou a expressão de β3 integrinas e PECAM-1 em condições basais; aumentou a formação de EROs por PMN; não alterou a expressão das moléculas de adesão endoteliais PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, JAM-C, P e Eselectinas e VE-Caderina; não aumentou significantemente a formação de adutos 8-oxo-7,8-dihidro- 2\'-desoxiguanosina e 1,N2-propano-2\'-deoxiguanosina no tecido pulmonar; aumentou a concentração de malonaldeído plasmático. A saturação da concentração de HQ na caixa de exposição foi 10 vezes menor que as preconizadas para a exposição ocupacional pelas agências regulamentadoras, indicando que mesmo a baixas concentrações de exposição, a HQ prejudica a resposta do hospedeiro a um agente infeccioso. O mecanismo tóxico pode estar relacionado à ativação das células na circulação, dependente da produção de espécies reativas de oxigênio, e que a toxicidade pode não ser detectada na ausência de resposta do organismo ao trauma. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound found in large quantities in cigarettes, medicines and food, besides it is one of the most important toxic metabolites of benzene (BZ). We have shown that systemic exposure impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of environmental exposure to HQ on leukocyte recruitment to the inflamed lung induced by lipolissacarideo of E. coli (LPS), the cell events involved in this process, and adducts formation on DNA of pulmonary tissue cells . For that 12.5, 25, or 50 ppm of HQ or vehicle (saline solution with 5% of ethanol) we aerosolized into an exposure box (60 mL/1h; 5 days) containing 5 male Swiss mice. One hour after the last exposures, the pulmonary inflammation was induced by LPS inhalation (0.1 mg/mL; 10 min). Animals exposed to HQ in presence or absence of inflammation were used for: 1) BAL collection three hours after LPS inhalation to quantify the leukocytes in BAL (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); 2) blood collection to quantify the circulating leukocytes before and three hours after LPS inhalation (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); to quantify the expression of adhesion moleculas in leukocytes from non-inflamed animals induced or not for formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) in vitro (flow citometry); to obtain blood plasma and quantify the formation of malondialdehyde (MDA; HPLC) and neutrophils to quantify the intracellular generation of reactive oxygen spices (ROS; flow citometry) from non-inflamed animals; 3) pulmonary tissue collection to quantify the expression oh adhesion molecules on endothelial cells and quantify the mieloperoxydase (MPO) activity, three hours after LPS inhalation and to quantify the DNA adducts on pulmonary tissue obtained from non-inflamed animals. Additionally, the concentration of HQ in the exposure box was quantified by HPLC. The results showed that exposure to HQ did not affect the numbers of circulating leukocytes, but reduced the number of polymorphonuclear leukocytes (PMN) and mononuclear (MN) in BAL, increased the activity of MPO in lung tissue; reduced the expression of L-selectin in PMN stimulated by fMLP in vitro, increased the expression of β2 integrins in PMN in the presence or absence (basal) stimulation by fMLP, increased the expression of β3 integrin and PECAM-1 in basal conditions; increased ROS formation by PMN, did not alter the expression of endothelial adhesion molecules PECAM-1, VCAM- 1, ICAM-1, JAM-C, P and E-selectin and VE-Cadherin; not significantly increased the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-desoxyguanosine e 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine adducts in lung tissue; increased the concentration of plasma malondialdehyde. The concentration of HQ into the exposure box was 10 times lower than those recommended for occupational exposure from regulatory agencies, indicating that even at low exposure concentrations, HQ affect the host response to an infectious agent. The toxic mechanism may be related to activation of circulating cells, dependent on the generation of reactive oxygen species, and toxicity can not be detected in the absence of body response to trauma.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico encontrado em grandes quantidades no cigarro, em medicamentos e alimentos, além de ser um dos mais importantes metabólitos tóxicos do benzeno (BZ). Temos mostrado que a exposição sistêmica à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Complementando estas investigações, o objetivo do presente projeto foi investigar o efeito da exposição ambiental à HQ sobre o recrutamento leucocitário para o pulmão induzido pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS) e sobre os eventos celulares envolvidos neste processo, bem como sobre a formação de adutos de DNA no tecido pulmonar. Para tanto, 12,5, 25 ou 50 ppm de HQ ou veículo (solução salina 5% de etanol) foram nebulizadas em caixa de exposição (60 mL/1h; 5 dias) onde 5 camundongos Swiss machos estavam alocados. Uma hora após as últimas exposições, a inflamação pulmonar foi induzida pela inalação de LPS (0,1 mg/mL; 10 min). Os animais expostos à HQ e na vigência ou ausência de inflamação foram empregados para: 1) coleta do lavado broncoalveolar (LBA) três horas após a inalação de LPS para quantificação do número de leucócitos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); 2) coleta de sangue para quantificação do número de leucócitos circulantes antes e 3 horas após a inalação de LPS (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); para a quantificação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos de animais não inflamados induzida ou não pelo formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) in vitro (citometria de fluxo); para obtenção de plasma para quantificação de malonaldeído (HPLC) e de neutrófilos para quantificação de espécies reativas de oxigênio intracelular (EROs; citometria de fluxo) de animais não inflamados pelo LPS; 3) coleta de tecido pulmonar para quantificação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais e para quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) 3 horas após a inalação de LPS e para quantificação de adutos de DNA em tecido de animais não inflamados. Adicionalmente, a concentração de HQ na caixa de exposição foi quantificada por HPLC. Os resultados obtidos mostraram que a exposição à HQ não afetou os números de leucócitos circulantes, mas reduziu o número de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) no LBA; aumentou a atividade de MPO no tecido pulmonar; reduziu a expressão de L-selectina em PMN estimulados in vitro pelo fMLP; aumentou a expressão de β2 integrinas em PMN na vigência ou ausência (basal) de estimulação pelo fMLP; aumentou a expressão de β3 integrinas e PECAM-1 em condições basais; aumentou a formação de EROs por PMN; não alterou a expressão das moléculas de adesão endoteliais PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, JAM-C, P e Eselectinas e VE-Caderina; não aumentou significantemente a formação de adutos 8-oxo-7,8-dihidro- 2\'-desoxiguanosina e 1,N2-propano-2\'-deoxiguanosina no tecido pulmonar; aumentou a concentração de malonaldeído plasmático. A saturação da concentração de HQ na caixa de exposição foi 10 vezes menor que as preconizadas para a exposição ocupacional pelas agências regulamentadoras, indicando que mesmo a baixas concentrações de exposição, a HQ prejudica a resposta do hospedeiro a um agente infeccioso. O mecanismo tóxico pode estar relacionado à ativação das células na circulação, dependente da produção de espécies reativas de oxigênio, e que a toxicidade pode não ser detectada na ausência de resposta do organismo ao trauma. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound found in large quantities in cigarettes, medicines and food, besides it is one of the most important toxic metabolites of benzene (BZ). We have shown that systemic exposure impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of environmental exposure to HQ on leukocyte recruitment to the inflamed lung induced by lipolissacarideo of E. coli (LPS), the cell events involved in this process, and adducts formation on DNA of pulmonary tissue cells . For that 12.5, 25, or 50 ppm of HQ or vehicle (saline solution with 5% of ethanol) we aerosolized into an exposure box (60 mL/1h; 5 days) containing 5 male Swiss mice. One hour after the last exposures, the pulmonary inflammation was induced by LPS inhalation (0.1 mg/mL; 10 min). Animals exposed to HQ in presence or absence of inflammation were used for: 1) BAL collection three hours after LPS inhalation to quantify the leukocytes in BAL (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); 2) blood collection to quantify the circulating leukocytes before and three hours after LPS inhalation (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); to quantify the expression of adhesion moleculas in leukocytes from non-inflamed animals induced or not for formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) in vitro (flow citometry); to obtain blood plasma and quantify the formation of malondialdehyde (MDA; HPLC) and neutrophils to quantify the intracellular generation of reactive oxygen spices (ROS; flow citometry) from non-inflamed animals; 3) pulmonary tissue collection to quantify the expression oh adhesion molecules on endothelial cells and quantify the mieloperoxydase (MPO) activity, three hours after LPS inhalation and to quantify the DNA adducts on pulmonary tissue obtained from non-inflamed animals. Additionally, the concentration of HQ in the exposure box was quantified by HPLC. The results showed that exposure to HQ did not affect the numbers of circulating leukocytes, but reduced the number of polymorphonuclear leukocytes (PMN) and mononuclear (MN) in BAL, increased the activity of MPO in lung tissue; reduced the expression of L-selectin in PMN stimulated by fMLP in vitro, increased the expression of β2 integrins in PMN in the presence or absence (basal) stimulation by fMLP, increased the expression of β3 integrin and PECAM-1 in basal conditions; increased ROS formation by PMN, did not alter the expression of endothelial adhesion molecules PECAM-1, VCAM- 1, ICAM-1, JAM-C, P and E-selectin and VE-Cadherin; not significantly increased the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-desoxyguanosine e 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine adducts in lung tissue; increased the concentration of plasma malondialdehyde. The concentration of HQ into the exposure box was 10 times lower than those recommended for occupational exposure from regulatory agencies, indicating that even at low exposure concentrations, HQ affect the host response to an infectious agent. The toxic mechanism may be related to activation of circulating cells, dependent on the generation of reactive oxygen species, and toxicity can not be detected in the absence of body response to trauma.

L'immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire (ICBs) est un traitement prometteur pour les patients atteints de mélanome ; cependant, seule une petite sous-population en tire un bénéfice à long terme. Un des défis pour améliorer l'efficacité et étendre le bénéfice des ICBs aux patients non répondeurs est de concevoir des approches innovantes permettant de transformer les tumeurs dites "froides ou désertes pour les cellules immunitaire" en tumeurs dites "chaudes ou infiltrées par les cellules immunitaires" qui sont éligibles aux ICBs. Nous avons étudié l'impact du ciblage du gène de l'autophagie Beclin1 sur le paysage immunitaire des tumeurs de mélanome B16-F10. Nos résultats ont démonté que ce ciblage inhibait significativement la croissance tumorale B16-F10 et augmentait l'infiltration des leucocytes CD45+. Le phénotypage immunitaire a révélé une augmentation de l'infiltration de cellules NK (Natural Killer) actives, de macrophages inflammatoires et résidents de type 1, de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD8+ actifs. L’inhibition de la croissance tumorale Becn1- n'était plus observée par la déplétion des CD8+ de l'hôte, soulignant ainsi leur rôle dans le contrôle du développement de ces tumeurs. Nos résultats ont démontré que La régulation du paysage immunitaire des tumeurs Becn1- était associée à une modulation du réseau de cytokines/chémokines dans le microenvironnement tumoral (TME). Ainsi, les tumeurs Becn1- présentaient une signature de cytokines inflammatoires (comprenant CCL5, CXCL10 et IFNg) qui pourrait être responsable de l'établissement de microenvironnement inflammatoire permissif aux cellules CD8. Nous avons révélé que la surexpression de l'IFNg dans le TME des tumeurs Becn1- était responsable de l'induction de PD-L1 sur les cellules tumorales par la voie d'activation JAK/STATs. En conclusion, cette étude met en évidence Beclin1 comme une cible majeure, capable d'induire l'infiltration des cellules effectrices immunitaires dans les mélanomes en induisant une signature inflammatoire. Elle fournit également la preuve de concept pour combiner des inhibiteurs d'autophagie avec les ICBs comme une approche de pointe pour améliorer leur efficacité. / Immune Checkpoint Blockades (ICBs)-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for melanoma patients; however only a small subset of patients reaps a long term benefit. One of the major challenges to enhance the efficacy and extend the benefit of ICBs to non-responder patients is to design innovative approaches allowing the switch of “immune desert cold tumors” to “immune infiltrated hot tumors" which are eligible for ICB-based therapies. Here, we investigated the impact of targeting the early autophagy gene Beclin1 on the immune landscape of B16-F10 melanoma tumors. We found that targeting Beclin1 (Becn1-) significantly inhibited B16-F10 tumor growth and increased the infiltration of CD45+ leukocytes into the tumor bed. Immune phenotyping revealed an increased infiltration of active Natural Killer (NK) cells, inflammatory and resident type 1 macrophages, dendritic cells, and active CD8+ T lymphocytes. The inhibition of Becn1- tumor growth was no longer observed by depleting host CD8+ T cells, thus highlighting their major role in the control of Becn1- B16-F10 tumor development. We showed that Beclin1-dependent regulation of the immune landscape was associated with profound modulation of the cytokine/chemokine network in the tumor microenvironment (TME). Importantly, we revealed that Becn1- tumors displayed an inflammatory cytokine signature (comprised, but not restricted to, CCL5, CXCL10 and IFNg) that could be responsible for the switch from cold non T-inflamed to hot T-inflamed tumors. Mechanistically, we reported that the overexpression of IFNg in Becn1- TME was responsible for the induction of Programed Death ligand-1 (PD-L1) on tumor cells through the activation of JAK/STATs pathway. Overall, this study highlights Beclin1 as a valuable target, able to drive immune effectors cells into the melanoma tumors by inducing an inflammatory signature. This study provides the proof of concept for combining drugs inhibiting early autophagy process along with ICBs as a cutting-edge approach to improve their efficacy.

Background: Periodontal disease has been associated with gestational complications and both conditions have a high prevalence in rural populations from developing regions. A cross-sectional study was carried out to explore the relationship between periodontal inflamed surface area (PISA), blood pressure (BP), and, serum uric acid levels (UA) in a group of rural North Chinese pregnant women in the third trimester of pregnancy. Methods: Three hundred and thirty-five rural women aged 20–34 years, with normal body mass index (BMI) were examined in a cross-sectional study during their third trimester of gestation. Exclusion criteria were history of pregnancy complications,multiple pregnancy, smoking habits, diabetes, hypertension or any known infectious disease. Socio-demographic variables, including age and socioeconomic status (SES), systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) readings, serum UA levels, and PISA values were recorded. A structural equation model was implemented with two constructed latent variables including “Dem” (comprising of age and SES category to represent unobserved demographic variables) and, “BP” (comprising of SBP and DBP to account for measurement error and lack of multiple BP readings). The model accounted for co-variance of BP and UA, and implemented simultaneous regressions for BP and UA as outcomes, upon Dem and PISA values as exogenous variables. Results: The median PISA score was 1,081.7 (IQR = 835.01), reflecting high levels of periodontal inflammation in the sample. SEM showed a significant association of PISA with BP (estimate = 0.011, 95%CI = 0.009–0.012 p < 0.001) and UA (estimate = 0.001, 95% CI = 0.001–0.001, p < 0.001). Conclusion: Higher PISA values were significantly associated with higher blood pressure and uric acid levels among rural pregnant women in a cross-sectional sample from a center in North China after accounting for a latent demographic construct derived from age and SES.