Inflammasome sind große intrazelluläre Multiproteinkomplexe und stellen einen wichtigen Bestandteil des angeborenen Immunsystems dar. Sie werden durch eine Vielzahl mikrobieller Moleküle, Gefahrensignale und kristalliner Substanzen aktiviert und führen zur Produktion von reifem IL-1β. In dieser Arbeit wurde der Fokus auf zwei Vertreter dieser Inflammasome gelegt, dem AIM2 und NLRP3 Inflammasom. Ersteres wird über intrazytoplasmatische DNA aktiviert und Defekte in seiner Regulation sind beispielsweise pathogenetisch relevant bei der chronischen Entzündung im Rahmen einer Psoriasis (Dombrowski et al. 2011) oder bei der Entstehung von Kolonkarzinomen mit Mikrosatelliteninstabilität (Woerner et al. 2007). Das NLRP3 Inflammasom kann durch unterschiedlichste Substanzen, wie z.B. Cholesterolkristalle, ATP, SDS oder Uratkristalle aktiviert werden. Pathogenetisch von Bedeutung ist eine Fehlregulation u.a. bei der Entstehung von CEDs. Ziel dieser Arbeit war es, Kolonadenom und –karzinomzelllinen auf die Induzierbarkeit des AIM2 und NLRP3 Inflammasoms zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden die Zelllinien entsprechend der Inflammasom-typischen Signalwege stimuliert, bzw. mit dsDNA transfiziert, und anschließend mittels RT-qPCR, ELISA und Western Blot die AIM2- und/oder IL-1β Genexpression, sowie die IL-1β Proteinsekretion bestimmt. In den untersuchten Darmzelllinien konnte unter den gewählten Versuchsmodalitäten weder eine funktionelle AIM2, noch eine funktionelle NLRP3 Inflammasomaktivierung nachgewiesen werden. Ein möglicher Grund hierfür könnte das Fehlen von für die Signalkaskade wichtigen Proteinen in den Kolonzelllinien sein. Dieses könnte erklärt werden durch die Überlegung, dass sich die verwendeten Kolonadenom- und karzinomzelllinien im Vergleich zu normalen Kolonzellen in einem zu stark entdifferenzierten Zustand befanden und somit zur Inflammasomaktivierung nicht mehr in der Lage waren. Vielleicht bedarf es auch anderer Zytokinstimulations- bzw. Transfektionszeiten, um eine IL-1β Sekretion in den Kolonzelllinien zu induzieren. / Inflammasomes are intracellular multiprotein complexes that play an important role in the response of the innate immune system. Aim of this work was to investigate how colon adenoma cell lines and colon carcinoma cell lines react to stimulation with danger associated molecular patterns and transfection of double-stranded DNA and whether oligomerisation and activation of the AIM2 and NLRP3 Infalmmasome with subsequent IL-1 beta release is performed.

Background: Systemic hypertension is a risk factor of age-related macular degeneration (AMD), a chronic inflammatory disease. Acute hypertension is caused by increased extracellular osmolarity after intake of dietary salt (NaCl). We determined in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells whether high extracellular NaCl alters the gene expression of inflammasome-associated proteins, and whether autocrine/paracrine purinergic (P2) receptor signaling contributes to the NaCl-induced NLRP3 gene expression. Methodology/Principal Findings: Hyperosmolarity was induced by the addition of 100 mM NaCl or sucrose to the culture medium. Gene and protein expression levels were determined with real-time RT-PCR and Western blot analysis, respectively. IL-1β and IL-18 levels were evaluated with ELISA. Nuclear factor of activated T cell 5 (NFAT5) expression was knocked down with siRNA. High extracellular NaCl induced NLRP3 and pro-IL-1β gene expression, while the gene expression of further inflammasome-associated proteins (NLRP1, NLRP2, NLRP6, NLRP7, NLRP12, NLRC4, AIM2, ASC, procaspase-1, pro-IL-18) was not altered or below the detection threshold. The NaCl-induced NLRP3 gene expression was partially dependent on the activities of phospholipase C, IP3 receptors, protein kinase C, the serum and glucocorticoid-regulated kinase, p38 MAPK, ERK1/2, JNK, PI3K, and the transcription factors HIF-1 and NFAT5. Pannexin-dependent ATP release and P2Y1 receptor activation is required for the full induction of NLRP3 gene expression. High NaCl induced a transient increase of the NLRP3 protein level and a moderate NLRP3 inflammasome activation, as indicated by the transient increase of the cytosolic level of mature IL-1β. High NaCl also induced secretion of IL-18. High extracellular NaCl induces priming of the NLRP3 inflammasome in RPE cells, in part via P2Y1 receptor signaling. The inflammasome priming effect of NaCl suggests that high intake of dietary salt may promote local retinal inflammation implicated in the development of AMD.

Die vorliegende Dissertation hat sich mit der Fragestellung beschäftigt, inwiefern die Einzelnukleotid-Polymorphismen (kurz SNP) rs10754558 und rs35829419 des NLRP3-Gens mit einer Suszeptibilität für eine NAFL und/oder NASH assoziiert sind. Die Studienkohorte bestand aus 202 Teilnehmern der Würzburger NAFLD-Kohorte der Universitätsklinik Würzburg, 159 NAFLD-Patienten, die im Rahmen der Fettlebersprechstunde der Universitätsklinik Würzburg behandelt wurden und 43 gesunde Kontrollen. Voraussetzung für die Aufnahme in das Patientenkollektiv der durch die Ethikkomission genehmigten Studie war zuallererst die Aufklärung und Zustimmung des Patienten, außerdem eine klinisch oder histologisch diagnostizierte Fettlebererkrankung. Sekundäre Ursachen einer Fettleber oder andere Lebererkrankungen waren Ausschlusskriterien. Alle Teilnehmer erhielten eine Blutentnahme, 97 NAFLD-Patienten eine Leberbiopsie, davon 10 perkutan und 87 subkapsulär im Zuge einer bariatrischen OP. Die Genotypisierung übernahm das Labor der Universitätsklinik Homburg, die weiteren Analysen der Blutwerte, der peripheren und intrahepatischen Immunzellen und die Begutachtung der Leber-Histologie fanden an der Universitätsklinik Würzburg im Rahmen eines vorherigen Forschungsvorhabens statt (Rau et al., 2016). Für beide SNPs war das Hardy-Weinberg-Equilibrium im Studien- sowie Patientenkollektiv erfüllt. Zwischen den einzelnen Genotypen und dem Vorliegen einer NAFL und/oder NASH fanden sich für beide SNPs keine signifikanten Zusammenhänge. Für den Wildtyp CC des SNP rs10754558 ergaben sich in der Studienkohorte signifikant höhere AST-Mediane (p=0,018) und häufiger hochnormale (in den oberen 20 % des Normbereichs) ALT-Werte (p=0,02) im Vergleich zu den Genotypen CG und GG. Hier lässt sich über eine protektive Rolle des Minor Allels in Bezug auf Leberwerterhöhungen spekulieren. Da bisher die Funktion von rs10754558 im NLRP3-Gen noch nicht ausreichend erforscht ist, sollten Untersuchungen auf transkriptioneller Ebene folgen und Studien mit anderen Polymorphismen des NLRP3-Gens und mit NAFLD-assoziierter Gene durchgeführt werden, um eine mögliche Assoziation mit anderen für die Entwicklung der NAFLD relevanten SNPs nicht zu übersehen. In der Analyse mit den Entzündungswerten zeigten sich für die Genotypen CG und GG signifikant erhöhte Frequenzen von Th1-Zellen im peripheren Blut (p=0,003). Zusätzlich lässt sich das vermehrte Vorkommen von Th1-Zellen auch im Rahmen der bestehenden Adipositas bzw. des metabolischen Syndroms im Sinne einer low grade inflammation interpretieren (s. Diskussion). Immerhin sind 95 % der NAFLD-Patienten der Studienkohorte von Adipositas betroffen. Die Ergebnisse zu SNP rs35829419, einer gain-of-function Variante im NLRP3-Gen, waren nur eingeschränkt beurteilbar, da keine homozygoten Allel-A-Träger vorlagen und die Stichprobenzahl für die Analyse der intrahepatischen Immunzellen viel zu gering war, um aussagekräftig sein zu können. In der gesamten Kohorte stellte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem heterozygoten Genotyp von rs35829419 und einer erhöhten Frequenz an Th2-Zellen (p=0,024) im peripheren Blut heraus. Innerhalb der NAFLD gingen frühere Studien bisher eher von einer Th1-dominierten Immunantwort aus (Bertola et al., 2010), wenn nicht gar einer Th2-Defizienz (Guebre-Xabier et al., 2000). Das hier vorliegende Ergebnis könnte immerhin auf eine höhere entzündliche Aktivität bei Minor-Allelträgern hindeuten. Die weitere Untersuchung mit größeren Stichproben und weiteren Polymorphismen, die in der NAFLD-Pathogenese bekanntermaßen eine Rolle spielen, erscheint auch für den SNP rs35829419 sinnvoll. Im Hinblick auf die zunehmende Prävalenz der NAFLD als Volkskrankheit der westlichen Welt wird die personalisierte Medizin, inklusive Prävention, Diagnostik und Therapie immer mehr an Bedeutung zunehmen. Die Identifizierung von genetischen Risikovarianten, die an der Pathogenese der NAFLD beteiligt sind, ist ein erster Schritt auf dem Weg hin zu besseren Therapiemöglichkeiten. / This dissertation has dealt with the question of the extent to which the single nucleotide polymorphisms (SNP) rs10754558 and rs35829419 of the NLRP3 gene are associated with susceptibility to NAFL and/or NASH. The study cohort consisted of 202 participants of the Würzburg NAFLD cohort of the University Hospital Würzburg, 159 NAFLD patients who were treated during the fatty liver consultation hours of the University Hospital Würzburg and 43 healthy controls. The prerequisite for inclusion in the patient population of the study approved by the ethics committee was first and foremost the information and consent of the patient, as well as a clinically or histologically diagnosed fatty liver disease. Secondary causes of fatty liver or other liver diseases were exclusion criteria. All participants received a blood sample, 97 NAFLD patients a liver biopsy, of which 10 percutaneously and 87 subcapsular in the course of bariatric surgery. The genotyping was carried out by the laboratory of the University Hospital Homburg, the further analyses of the blood values, the peripheral and intrahepatic immune cells and the assessment of the liver histology took place at the University Hospital Würzburg as part of a previous research project (Rau et al., 2016). For both SNPs, the Hardy Weinberg equilibrium was fulfilled in the study and patient collective. There were no significant associations between the individual genotypes and the presence of NAFL and/or NASH for either SNP. For the wild type CC of SNP rs10754558, significantly higher AST medians (p=0.018) and more frequently highly normal (in the upper 20% of the normal range) ALT values (p=0.02) were found in the study cohort compared to the genotypes CG and GG. Here one can now speculate about a protective role of the minor allele with regard to liver value increases. Since the function of rs10754558 in the NLRP3 gene has not yet been sufficiently researched, studies at the transcriptional level should follow and studies with other polymorphisms of the NLRP3 gene and with NAFLD-associated genes should be carried out in order not to overlook a possible association with other SNPs relevant for the development of NAFLD. The analysis with the inflammation values showed significantly increased frequencies of Th1 cells in peripheral blood for the genotypes CG and GG (p=0.003). In addition, the increased occurrence of Th1 cells can also be interpreted in the context of existing obesity or metabolic syndrome in the sense of low-grade inflammation (see discussion). After all, 95% of NAFLD patients in the study cohort are affected by obesity. The results for SNP rs35829419, a gain-of-function variant in the NLRP3 gene, could only be assessed to a limited extent because there were no homozygous allele A carriers and the sample number for the analysis of intrahepatic immune cells was far too small to be meaningful. Throughout the cohort, there was a significant association between the heterozygous genotype of rs35829419 and an increased frequency of Th2 cells (p=0.024) in peripheral blood. Within NAFLD, previous studies have tended to assume a Th1-dominated immune response (Bertola et al., 2010 ), if not Th2 deficiency (Guebre-Xabier et al., 2000). The present result could at least indicate a higher inflammatory activity in minor allele carriers. Further investigation with larger samples and other polymorphisms, which are known to play a role in NAFLD pathogenesis, would also be useful for SNP rs35829419. In view of the increasing prevalence of NAFLD as a widespread disease in the Western world, personalized medicine, including prevention, diagnostics, and therapy, will become increasingly important. The identification of genetic risk variants involved in the pathogenesis of NAFLD is a first step towards better treatment options.

Diese Dissertation (Monographie) wurde in Abteilung für Kardiologie des Uniklinikums Leipzig durchgeführt. Zusammenfassend zeigen die Experimente, dass extrazelluläre NLRP3 Oligomere von Makrophagen internalisiert werden und eine pro-inflammatorische und chemoattraktive Wirkung besitzen.

Background: Systemic hypertension is a risk factor of age-related macular degeneration (AMD), a chronic inflammatory disease. Acute hypertension is caused by increased extracellular osmolarity after intake of dietary salt (NaCl). We determined in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells whether high extracellular NaCl alters the gene expression of inflammasome-associated proteins, and whether autocrine/paracrine purinergic (P2) receptor signaling contributes to the NaCl-induced NLRP3 gene expression. Methodology/Principal Findings: Hyperosmolarity was induced by the addition of 100 mM NaCl or sucrose to the culture medium. Gene and protein expression levels were determined with real-time RT-PCR and Western blot analysis, respectively. IL-1β and IL-18 levels were evaluated with ELISA. Nuclear factor of activated T cell 5 (NFAT5) expression was knocked down with siRNA. High extracellular NaCl induced NLRP3 and pro-IL-1β gene expression, while the gene expression of further inflammasome-associated proteins (NLRP1, NLRP2, NLRP6, NLRP7, NLRP12, NLRC4, AIM2, ASC, procaspase-1, pro-IL-18) was not altered or below the detection threshold. The NaCl-induced NLRP3 gene expression was partially dependent on the activities of phospholipase C, IP3 receptors, protein kinase C, the serum and glucocorticoid-regulated kinase, p38 MAPK, ERK1/2, JNK, PI3K, and the transcription factors HIF-1 and NFAT5. Pannexin-dependent ATP release and P2Y1 receptor activation is required for the full induction of NLRP3 gene expression. High NaCl induced a transient increase of the NLRP3 protein level and a moderate NLRP3 inflammasome activation, as indicated by the transient increase of the cytosolic level of mature IL-1β. High NaCl also induced secretion of IL-18. High extracellular NaCl induces priming of the NLRP3 inflammasome in RPE cells, in part via P2Y1 receptor signaling. The inflammasome priming effect of NaCl suggests that high intake of dietary salt may promote local retinal inflammation implicated in the development of AMD.

Das NLRP3-Inflammasom spielt eine bedeutende Rolle in der Pathogenese der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD). Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Priming, als auch Aktivierung des Inflammasoms abhängig von der extrazellulären NaCl-Konzentration sind. Zahlreiche intra- und extrazelluläre Signalwege zeichnen sich dafür verantwortlich. Die Aktivierung wurde mittels Western Blot nachgewiesen und ist zeitlich stark begrenzt.:Abkürzungsverzeichnis III 1. Einleitung 6 1.1 Das retinale Pigmentepithel 6 1.2 Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) 7 1.2.1 Trockene altersabhängige Makuladegeneration (dry AMD) 8 1.2.2 Feuchte altersabhängige Makuladegeneration (wet AMD) 9 1.3 Inflammatorische Prozesse im Zusammenhang mit AMD 9 1.3.1 Aktivierung des Komplementsystems 9 1.3.2 Inflammasome als Trigger der angeborenen Abwehr 10 1.3.3 Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei trockener AMD 12 1.3.4 Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei feuchter AMD 13 1.4 Hypoxie als Risikofaktor für AMD 14 1.5 Bluthochdruck als Risikofaktor für AMD 14 2. Aufgabenstellung 15 3. Materialien und Methoden 16 3.1 Materialien 16 3.1.1 Chemikalien 16 3.1.2 Substanzen zur Zellstimulation 18 3.1.3 Geräte und sonstige Materialien 20 3.1.4 Primerpaare 22 3.1.5 Antikörper für Westernblotting 23 3.1.6 ELISA-Kits 23 3.2 Methoden 23 3.2.1 Zellkultivierung 23 3.2.2 Zellstimulation 24 3.2.3 siRNA Transfektion 24 3.2.4 RNA-Präparation 25 3.2.5 cDNA-Synthese 25 3.2.6 quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 26 3.2.7 Agarose-Gelelektrophorese 27 3.2.8 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung nach Bradford 28 3.2.9 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 29 3.2.10 Westernblot 30 3.2.11 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 31 3.3 Statistische Auswertung 32 4. Ergebnisse 33 4.1 Expression der RNA von Inflammasomproteinen 33 4.2 Osmotische Regulation der Genexpression von Inflammasomproteinen 33 4.3 Beteiligte Intrazelluläre Signalwege an der NaCl-induzierten Expression von NLRP3 35 4.4 Einfluss Rezeptor-gesteuerter Signalwege auf die NaCl-induzierte Genexpression von NLRP3 38 4.4.1 Wachstumsfaktorrezeptoren 39 4.4.2 Purinerge Rezeptoren, Adenosinrezeptoren 40 4.5 Einfluss von Transkriptionsfaktoren auf die NaCl-induzierte NLRP3-Expression 41 4.6 Ein erhöhter NaCl-Gehalt bewirkt eine vorübergehende Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 42 4.7 Beteiligung der P2Y1–Rezeptoraktivierung an der NaCl-induzierten Expression angiogener Faktoren 43 5. Diskussion 45 5.1 Die Genexpression von Inflammasomproteinen wird osmotisch reguliert 45 5.2 Beteiligung intrazellulärer Signalwege an der NaCl-induzierten Expression von NLRP3 47 5.3 Die NaCl-stimulierte Genexpression von NLRP3 wird durch Rezeptor-gesteuerte Signalwege beeinflusst 47 5.4 Einfluss der Transkriptionsfaktoren auf die NaCl-induzierte NLRP3-Expression 48 5.5 Ein erhöhter NaCl-Gehalt bewirkt die vorübergehende Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 49 5.6 Beteiligung der P2Y1-Rezeptoraktivierung an der NaCl-induzierten Expression angiogener Faktoren 50 5.7 Klinische Relevanz der gewonnenen Erkenntnisse 50 5.8 Bedeutung der Erkenntnisse für die Pathogenese und Therapie der AMD 50 6. Zusammenfassung 54 7. Literaturverzeichnis 59 8. Anlagen 68 8.1 Abbildungsverzeichnis 68 8.2 Tabellenverzeichnis 69 8.3 Lebenslauf 70 8.4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 71 8.5 Danksagung 72 8.6 Nachweis der Teilnahme an der Vorlesung zur „Guten Wissenschaftlichen Praxis“ 73

Die Prävalenz von Adipositas, definiert durch einen BMI >30 kg/m2, und assoziierter Erkrankungen wie Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM), kardiovaskulärer Erkrankungen, und einiger Krebsentitäten nimmt weltweit dramatisch zu und bedingt das erhöhte Mortalitätsrisiko dieser Patientengruppe (Kopelman 2000; Stevens et al. 2012). Daneben lässt sich oft eine Adipositas-assoziierte, geringgrade, chronische Entzündung beobachten, die in den letzten Jahren als entscheidender Faktor in der Pathogenese dieser Komorbiditäten erkannt wurde (Spranger et al. 2003). Als Reaktion auf metabolische Veränderungen im viszeralen Fettgewebe (VAT) wird das Immunsystem aktiviert und Immunzellen mobilisiert (Strissel et al. 2007; O’Rourke et al. 2011). Besonders die Zahl der Fettgewebsmakrophagen (ATM) nimmt durch lokale Proliferation und vermehrte Einwanderung von Monozyten um ein Vielfaches zu, bis sie die dominante Immunzellpopulation im VAT darstellen (Weisberg et al. 2003). Sie sind durch einen proinflammatorischen M1-Phänotyp gekennzeichnet und sezernieren Zytokine wie Il-1β und IL-18, die nach Ausschwemmung in den peripheren Blutkreislauf eine systemische Immunantwort auslösen und die Sensitivität der Gewebe für Insulin über molekulare Wechselwirkungen erheblich abschwächen (Rui et al. 2002; Castoldi et al. 2016). Die daraus entstehende Insulinresistenz und schließlich T2DM wird deshalb nunmehr als Folge einer entzündlichen Fettgewebsdysfunktion verstanden, in deren Pathogenese die aktivierten ATM eine Schlüsselrolle einnehmen (Donath und Shoelson 2011). Die Produktion von IL-1β und IL-18 wird über einen zytosolischen Proteinkomplex, das Inflammasom, reguliert. Die Aktivierung dessen erfolgt nach initialer Sensitivierung durch Bindung eines Botenstoffs an den Rezeptor NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) (Groslambert und Py 2018). Zu den diversen Faktoren, die NLRP3 aktivieren, gehört die G-Protein-vermittelte Aktivierung durch extrazelluläres Kalzium (exCa2+) bei Bindung an den Calcium-sensing Rezeptor (CaSR) (Lee et al. 2012; Rossol et al. 2012). In einem Zellmodell mit humanen, aus peripheren Monozyten differenzierten Makrophagen (MDM) konnte nach Stimulation der Zellen mit exCa2+ eine dosisabhängige Steigerung der IL-1β-Produktion verzeichnet werden (Thrum et al. 2019, Manuskript eingereicht). Der erste Teil dieser Arbeit widmete sich deshalb der Frage, ob MDM bei Adipositas stärker als im schlanken Zustand auf exCa2+ reagieren und dieses Ion in der Folge als Faktor diskutiert werden müsste, der maßgeblich zur Entzündung im VAT beiträgt. Im Rahmen einer klinischen Studie wurden 31 adipöse und 23 nichtadipöse Probanden rekrutiert, die sich einer klinischen Untersuchung und Blutentnahme unterzogen. Als Zellmodell dienten MDM, die über sieben Tage in Medium mit 10 % autologem humanem Serum gereift waren, um eine phänotypische Differenzierung wie im Milieu des VAT zu gewährleisten. Nach einem Priming mit Lipopolysaccharid (LPS) wurden die Zellen mit exCa2 stimuliert und anschließend die IL-1β-Konzentration im Überstand mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ermittelt. Tatsächlich ließ sich eine deutlich höhere Zytokinexpression in der adipösen Kohorte nachweisen. Von diesen Probanden wiesen 20 erhöhte Werte des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein (CRP) im Blut auf (> 5 mg/l), was nach Ausschluss anderer Ursachen als Zeichen einer geringgradigen, Adipositas-induzierten Entzündung gewertet wurde. Elf der adipösen Probanden zeigten CRP-Werte < 5 mg/l. Eine im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich erhöhte IL-1β-Konzentration auch in dieser Gruppe ließ darauf schließen, dass die gesteigerte entzündliche Aktivität der MDM einer klinisch messbaren systemischen Aktivierung des Immunsystems vorausgeht und somit wahrscheinlich nicht Folge, sondern Mitverursacher der Adipositas-assoziierten Entzündung ist. Die sensitivere Reaktion der MDM in der adipösen Kohorte kann unterschiedlich interpretiert werden. Zum einen ist es möglich, dass eine bei Adipositas erhöhte Expression der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms die zelluläre Antwort auf aktivierende Reize wie exCa2+ verstärkt (Stienstra et al. 2010; Vandanmagsar et al. 2011). Zum anderen könnte ein höherer CaSR-Besatz an der Oberfläche der MDM bei Adipositas speziell das exCa2+ zum Gefahrensignal rangieren lassen (Malecki et al. 2013). Dafür spricht, dass sich die Werte des ionisierten Kalziums im Plasma zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschieden, sich jedoch ausschließlich in der adipösen Kohorte eine positive Korrelation zwischen ionisiertem Plasma-Kalzium und IL-1β-Sekretion nach Stimulation mit exCa2+ abzeichnete. In einem nächsten Schritt wäre es nötig, die Expression des CaSR und der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms der ATM bei Adipositas und im schlanken Zustand zu untersuchen. Ein weiteres Augenmerk lag auf der Beeinflussung der Aktivierung der ATM durch Faktoren, die das Milieu im VAT bestimmen. Hier wurden in den letzten Jahren besonders Mikrogewebshypoxie und Adipokine (wie Chemerin, Leptin, Progranulin oder FABP4) als proinflammatorische Mediatoren beschrieben (O’Rourke et al. 2011; Jung und Choi 2014). Um zu untersuchen, ob ein kostimulatorischer Einfluss dieser Faktoren auf die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ vorliegt, wurden MDM nichtadipöser Probanden mit und ohne Hypoxie bzw. ausgewählte Adipokine stimuliert. Während es unter dem Einfluss von Hypoxie zwar nicht absolut, aber dafür schon bei geringeren exCa2+-Konzentrationen zu einem Anstieg der IL-1β-Sekretion kam, konnte für die Adipokine weder nach Differenzierung mit ebenjenen und anschließender Stimulation, noch bei Kostimulation eine signifikante Veränderung in der Reaktion der MDM festgestellt werden. Für Zellen in hypoxischer Umgebung wurde eine erhöhte Expression proinflammatorischer Zytokine oder auch von CaSR beschrieben, was die Steigerung der Sensitivität gegenüber exCa2+ erklären würde (Yu et al. 2011; Pak et al. 2016). Auch hier sind weitere Studien mit komplexeren Systemen nötig, um die Abläufe in ihrer Gänze darzustellen. Ein dritter Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der fluoreszenzmikroskopischen Darstellung der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ und von ASC-Specks. Das Protein ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) ist Komponente des NLRP3-Inflammasoms und akkumuliert nach dessen Aktivierung im Zellplasma. Dort formt es einen Komplex, der Speck genannt wird und nach dem Zelltod umliegende Zellen stimulieren und eine Ausbreitung der Entzündung vorantreiben kann (Masumoto et al. 1999; Franklin et al. 2014). Leider gelang es im Rahmen dieser Doktorarbeit nicht, die Entstehung eines Specks zu zeigen. Nach Anfärbung von mit LPS und exCa2+ stimulierten MDM durch fluoreszenz-markierte Antikörper gegen ASC und NLRP3, konnten neben einer über die Zeit zunehmenden Expression dieser Proteine auch Strukturen gesehen werden, bei denen es sich um Specks handeln könnte. Auch wenn der Beweis dafür fehlt, stellt dies einen interessanten Ansatz dar, der in zukünftigen Studien weiter verfolgt werden sollte, besonders mit Hinblick auf die Fragen, ob im VAT bei Adipositas mehr ASC-Specks vorhanden sind, ob die Zellen adipöser und schlanker Organismen unterschiedlich darauf reagieren und ob ggf. eine Kostimulation von ASC-Specks und exCa2+ vorliegt. Diese Arbeit trägt dazu bei, unser Verständnis der komplexen Abläufe bei Adipositas zu verbessern und die entscheidende Funktion der Fettgewebsmakrophagen in der Entstehung der Adipositas-assoziierten Entzündung zu belegen. Es konnte gezeigt werden, dass extrazelluläres Kalzium bei Adipositas einen wichtigen Einflussfaktor für die Aktivierung der Makrophagen darstellt. In Zukunft kann dies als Anknüpfungspunkt für weitere Forschungsprojekte dienen und so bei der Entwicklung neuer Medikamente und innovativer Biomarker zur Bekämpfung der stetigen Zunahme von Adipositas und der Adipositas-assoziierten Mortalität helfen.

Hintergrund und Fragestellung: Das NLRP3-Inflammasom ist Teil des angeborenen Immunsystems und spielt eine wichtige Rolle für pro-inflammatorische Prozesse im Rahmen der sterilen Entzündung und der Pathogenese der Atherosklerose. Das NLRP3-Inflammasom wird nicht nur durch molekulare Strukturen von Krankheitserregern, sondern auch durch endogene Gefahrensignale, wie beispielsweise oxidiertes LDL, Cholesterinkristalle, oxidativer Stress oder extrazelluläres ATP, aktiviert. Bei Aktivierung bilden sich hochmolekulare NLRP3-Inflammasomkomplexe, bestehend aus dem NLRP3-Rezeptor, dem Adapterprotein ASC und dem vom Adapterprotein gebundenen Effektorenzym Caspase-1. Im Zuge der Inflammasom-Aktivierung kommt es zur Induktion von Pyroptose, einem programmierten und mit Entzündung assoziierten Zelltod, der mit einer Porenbildung in der Zellmembran einhergeht. Dabei werden pro-inflammatorische Zytokine in ihre bioaktiven Formen gespalten und in den extrazellulären Raum freigesetzt. Neben den Zytokinen können auch ganze Inflammasomkomplexe freigesetzt werden, wodurch diese ebenfalls in die Blutzirkulation gelangen. Die Bedeutung und Wirkung dieser extrazellulären NLRP3-Inflammasome ist noch weitgehend unbekannt. Daher wurde in den beiden wesentlichen Fragestellungen der Arbeit untersucht, ob Endothelzellen extrazelluläre Inflammasomkomplexe internalisieren und dadurch pro-atherogene Effekte ausgelöst werden können und ob zirkulierende Inflammasomkomplexe im menschlichen Blut nachgewiesen werden können. Methoden und Ergebnisse: Extrazelluläre Inflammasomkomplexe konnten aus Zellüberstand von mit Inflammasom-Aktivatoren behandelten humanen Monozyten isoliert werden. Mittels Western-Blot erfolgte der Nachweis des Adapterproteins ASC und des NLRP3-Rezeptors. Durch den NLRP3-Inhibitor MCC950 konnte eine Reduktion der Freisetzung von Inflammasomkomplexen in den Zellüberstand gezeigt werden. Für die Untersuchungen der Wirkung extrazellulärer Inflammasomkomplexe auf Endothelzellen wurde eine Methode zur Isolation von fluoreszenzmarkierten NLRP3-YFP-Inflammasomkomplexen aus einer stabilen NLRP3 (p.D303N)-YFP HEK-Zelllinie etabliert. Histologische Analysen zeigten, dass diese von humanen koronaren Endothelzellen aufgenommen werden können. Die immunhistochemischen Befunde bestätigten sich in der Durchflusszytometrie (Image StreamR). Die Auswertung der immunfluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen ergab, dass im Mittel 9 % ± 2,3 % der humanen umbilikalvenösen Endothelzellen und 26 % ± 9,6 % der humanen koronararteriellen Endothelzellen NLRP3-YFP-Inflammasomkomplexe internalisierten. Expressionsanalysen zeigten, dass durch die Behandlung von humanen Endothelzellen mit NLRP3-Inflammasomkomplexen eine signifikant gesteigerte Produktion des Oberflächenadhäsionsmoleküls ICAM1 induziert wird. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen waren die mRNA-Expression 2,5-fach und die Proteinlevel 6,9-fach erhöht. Die funktionelle Relevanz wurde durch den Nachweis einer vermehrten Adhäsion von Monozyten deutlich. Mit Calcein gefärbte Monozyten wurden vier Stunden mit koronararteriellen Endothelzellen inkubiert. Die anschließend photometrisch erhobenen Daten zeigten eine um 49,6% verstärkte Adhäsion von Monozyten an die vorher mit extrazellulären Inflammasomkomplexen behandelten Endothelzellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die Monozytenadhäsion an das Endothel stellt einen essentiellen Schritt in der Pathogenese der Atherosklerose dar. Diese Zellkultur-Ergebnisse zeigen, dass das extrazelluläre NLRP3-Inflammasom relevanten Einfluss auf das Endothel nehmen kann. Um die klinische Relevanz von extrazellulären NLRP3-Inflammasomen zu eruieren, wurde humanes Serum auf das Adapterprotein ASC hin untersucht. Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurde die Messung von ASC bei Patienten mit Sepsis als Positivkontrolle im Vergleich zu gesunden Probanden als Negativkontrolle etabliert und validiert. Im Western-Blot konnte gezeigt werden, dass Patienten mit Sepsis mehr ASC-Komplexe aufweisen als gesunde Probanden. Dieser Befund konnte in der quantitativen Auswertung mittels ASC-ELISA bestätigt werden. Es waren signifikant höhere ASC-Konzentrationen in den Serumproben der Patienten mit Sepsis (3,2 ± 0,7 ng/ml) als in gesunden Kontrollen (0,3 ± 0,1 ng/ml) nachweisbar. Diskussion: Diese Ergebnisse zeigen, dass extrazelluläre NLRP3-Inflammasomkomplexe von humanen koronararteriellen Endothelzellen aufgenommen werden und dort pro-atherosklerotische Prozesse induzieren. Die erhobenen Daten weisen damit auf eine neue Domäne der zellulären Signaltransduktion hin, welche für Endothelzellen und im Rahmen der sterilen Entzündung relevant scheint. Die Messung erhöhter ASC-Spiegel im Serum von Sepsis-Patienten lässt ebenfalls eine Assoziation von Inflammasomkomplexen mit im Körper ablaufender systemischer Inflammation annehmen. Auf dem Boden der Befunde müssen weitere Studien beantworten, ob sich die Quantifizierung zirkulierender Inflammasomkomplexe als Biomarker oder zur Risikostratifizierung eignet. Des Weiteren unterstützen die Daten zukünftige Ansätze einer therapeutischen Modulation des intra- und des extrazellulären NLRP3-Inflammasoms.

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Monocytes and macrophages are mediator cells of cartilage and bone erosion in the synovia of rheumatoid arthritis (RA) patients due to secretion of the inflammatory cytokine Interleukin-1β (IL-1β). Calcium, phosphate and fetuin are liberated from the affected bone matrix, and the formation of calciproteinparticles (CPPs) is likely. IL-1β production in monocytes in vitro is stimulated by high concentrations of extracellular calcium. Additionally, the rise of extracellular calcium concentrations leads to increased macropinocytosis in mononuclear phagocytes. Flow cytometry analyses in this study show that peripheral blood monocytes from patients with RA perform more calcium stimulated macropinocytosis of the fluorescent dye calcein than monocytes from healthy donors. Stimulation of monocytes with calcium and preformed CPPs leads to more IL-1β production, quantified using ELISA, by monocytes from RA patients. Experiments with macrophages show similar results. Furthermore calcium-stimulated macropinocytosis and IL-1β secretion are significantly positively correlated. However, there was no connection of in vitro findings and the severity of RA in patients.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatoide Arthritis 1 1.1.1 Epidemiologie und Klinik der rheumatoiden Arthritis 1 1.1.2 Ätiopathogenese der rheumatoiden Arthritis 1 1.2 Monozyten und Makrophagen 3 1.2.1 Inflammasomaktivierung und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen 4 1.2.2 Makropinozytose in Monozyten und Makrophagen 6 1.2.3 Beitrag der Monozyten und Makrophagen zur rheumatoiden Arthritis 7 1.3 Kalzium – lokale Dysregulation trotz systemischer Regulation 9 1.3.1 Entstehung von Kalziumproteinpartikeln 10 1.3.2 Kurzportrait des G-Protein-gekoppelten Kalziumrezeptors CaSR 11 2 Fragestellungen 13 3 Forschungsdesign, Material und Methoden 15 3.1 Forschungsdesign 15 3.2 Materialien 15 3.2.1 Laborgeräte 16 3.2.2 Verbrauchsmaterialien 17 3.2.3 Materialien und Chemikalien 17 3.2.4 Medien, Lösungen und Puffer 19 3.2.5 Stimulanzien und Inhibitoren 20 3.2.6 Fluoreszenzfarbstoffe 20 3.2.7 Software 20 3.3 Methoden 21 3.3.1 Separation von PBMCs mittels Ficolldichtegradientenzentrifugation 21 3.3.2 Separation von Monozyten mittels negativer Magnetseparation 22 3.3.3 Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen in Zellkulturbeuteln 23 3.3.4 Makropinozytose von Monozyten und Makrophagen in der Durchflusszytometrie 23 3.3.4.1 Makropinozytose von Calcein in Monozyten 24 3.3.4.2 Makropinozytose fluoreszenzgefärbter Kalziumproteinpartikel in Monozyten und Makrophagen 25 3.3.4.3 Inhibition der Makropinozytose in Monozyten 26 3.3.4.4 Auswertung der am Durchflusszytometer generierten Rohdaten mit FlowJo 26 3.3.5 Makropinozytose von Monozyten in der Fluoreszenzmikroskopie 28 3.3.6 Bestimmung der Interleukin-1β-Produktion von Monozyten und Makrophagen mittels ELISA 29 3.3.7 Erhebung des DAS28 33 3.3.8 Bestimmung von Laborparametern 33 3.4 Statistische Auswertung 33 4 Ergebnisse 35 4.1 Charakterisierung der Kohorten 35 4.2 Vorversuche zur Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffes für die Detektion der Makropinozytose 37 4.3 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 39 4.3.1 Kalziumstimulierte Calceinaufnahme von Monozyten 39 4.3.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion von Monozyten 44 4.4 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 47 4.4.1 Kalziumstimulierte Aufnahme fluoreszierender Kalziumproteinpartikel 47 4.4.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion in Monozyten unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 51 4.5 Stimulation von Makrophagen mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 53 4.5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytose von fluoreszierenden Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 53 4.5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion mit und ohne Zugabe von Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 54 4.5.3. Visualisierung von Monozyten und Makrophagen nach 16 Stunden Inkubation 57 4.6 Korrelation zwischen kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion 59 5 Diskussion 61 5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytoseaktivität von Monozyten und Makrophagen 61 5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 64 5.2.1 Auswirkung der Phosphatkonzentration im Zellkulturmedium auf die kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 65 5.2.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 66 5.3 Zusammenhang von kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 70 5.4 Ausblick und offene Fragen 71 6 Zusammenfassung der Arbeit 73 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 88 9 Danksagung 89