Das Prostatakarzinom (PCa) ist der häufigste maligne Tumor des Urogenitaltraktes und stellt nicht nur in Deutschland die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung des Mannes dar. Dem PSA wird im klinischen Alltag eine bedeutende Rolle für Diagnostik, Therapie und Verlauf der PCa-Erkrankung zugeschrieben, allerdings ist die größte Schwachstelle des PSA-Screenings die geringe Spezifität, welche häufig zu Überdiagnostik führt und letztendlich in Übertherapie endet. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Versorgungsqualität und Versorgungsrealität von Patienten mit einem neu diagnostizierten PCa zu untersuchen und zu beurteilen. Hierfür wurde ein umfangreicher Datensatz von 38.560 Patienten untersucht, wobei das Hauptaugenmerk dabei auf der Häufigkeitsverteilung der PSA-Werte für PCa-Patienten verschiedener Alters- und Gleason-Gruppen lag, um daraus Aussagen über mögliche Grenzwerte ableiten zu können. Die Auswertung der Versorgungsdaten zeigte, dass in dem untersuchten Patientenkollektiv sowohl altersspezifische als auch gleasonspezifische PSA-Grenzwerte erkennbar sind. Der Grenzwert von 4 ng/ml zur Biopsieindikation scheint in der Praxis eine Orientie-rungshilfe zu sein, allerdings sollte dieser Wert auch differenziert bzgl. verschiedener Einflussfaktoren betrachtet werden und bedeutet anscheinend in der Versorgungsrealität nicht, dass sofort eine invasive Diagnostik bzw. Therapie durchgeführt wird. Vor allem in Hinblick auf die große Zahl an Überdiagnosen bzw. Übertherapien, die das PSA-Screening hervorrufen kann ist es wichtig, Strategien zu entwickeln, um Männer mit einem insignifikanten PCa vor möglichen Folgeschäden zu schützen. Bei einem im Vergleich zum Grenzwert erhöhten PSA-Wert sollte der Patient zunächst engmaschig überwacht werden bevor eine invasive Diagnostik durchgeführt wird. Konzepte der Spezifitätserhöhung wie PSA-Dichte, PSA-Anstiegsgeschwindigkeit und PSA-Verdopplungszeit konnten die Spezifität allerdings nur teilweise verbessern. Gleichzeitig zeigt die vorliegende Untersuchung, dass die Dokumentation des PSA bei der Früherkennung im Rahmen eines Versorgungsforschungsprojektes funktioniert, da die Daten sowohl wissenschaftlichen Erkenntnissen entsprechen, gleichwohl den Versorgungsalltag dokumentieren, der auch im Spannungsfeld der PSA-Diskussion zu sehen ist.

Metalloxidnanopartikel gewinnen eine zunehmend größere Bedeutung aufgrund ihres immer weiter reichenden Einsatzes in verschiedensten Produkten. Somit steigt auch die Wahrscheinlichkeit für den Menschen mit derartigen Partikeln in Berührung zu kommen. Deswegen ist eine Untersuchung der Toxizität derartiger Substanzen unumgänglich, um ein Risikoassessment durchführen zu können. Methoden: Die Zellkultivierung der A549 Zellen erfolgte in RPMI supplementiert mit 10% FKS. Alle Toxizitätstests wurden mit mit FKS supplementiertem Medium und mit RPMI ohne FKS durchgeführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Zellvitalität mit Hilfe des MTT-Tests und das Auftreten von Apoptose und Nekrose mit Hilfe des Annexin-V-Propidiumiodid-Assays bestimmt. Weiterhin wurde die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine Interleukin-1, TNF-α, Eotaxin und MCP-1 durch die Zellen in Zytokin-ELISAs untersucht. Ergebnisse: Zinkoxid Nanopartikel führen zu einer Verringerung der Zellvitalität und lösen überwiegend Nekrosen der verwendeten A549 Zellen aus. Ceroxid Nanopartikel wirken nicht zytotoxisch und lösen weder Apoptose noch Nekrose aus.:0 Referat 1 1 Einleitung 7 1.1 Nanotechnologie – Nutzen und Gefahren 7 1.2 Toxizitätsuntersuchungen von Nanopartikeln 10 1.3 Zielstellung 12 2 Wissenschaftlicher Hintergrund 14 2.1 Eintrittspforten von Nanopartikeln 14 2.1.1 Eintrittspforten von Nanopartikeln in den Organismus 14 2.2 Biologische Reaktionen auf Zellschädigungen 14 2.2.1 Zellzyklus und Wachstumshemmung 14 2.2.2 Apoptose 15 2.2.3 Nekrose 18 2.2.4 Entzündung 20 2.3 Physiko-chemische Eigenschaften von Nanopartikeln im Hinblick auf ihre Wechselwirkung mit Zellen und Organismen 23 2.4 Biologische Wirkungen von Nanopartikeln 28 3 Materialen 33 3.1 Geräte 33 3.1.1 BD FACSCalibur 33 3.1.2 Tecan Infinite Reader M200 35 3.1.3 Sonstige Laborausrüstung 36 3.1.4 Verbrauchsmaterialien 37 3.2 Zellen 38 3.3 Chemikalien 38 3.3.1 Nanopartikel 38 3.3.2 Chemikalien für Zellkultur 39 3.3.3 Sonstige Chemikalien und Kits 39 4 Methoden 41 4.1 Zellkultivierung von A549 41 4.2 Zellaussaat für Versuchsansätze 42 4.3 Nanopartikelpräparation 43 4.3.1 Begriffsbestimmung Ultraschallbehandlung 43 4.3.2 Herstellung der Nanopartikelstammlösungen 43 4.3.3 Nanopartikelpräparation mit FKS 43 4.3.4 Nanopartikelpräparation ohne FKS 44 4.4 Nanopartikelexposition 46 4.5 MTT-Test 46 4.5.1 Theoretische Grundlagen 46 4.5.2 Labortechnische Durchführung 47 4.6 Annexin-V/Propidiumiodid-Assay 47 4.6.1 Prinzip der Annexin-V/Propidiumiodid-Färbung 47 4.6.2 Labortechnische Durchführung 49 4.6.3 Datenauswertung 49 4.7 Zytokin-ELISAs 52 4.7.1 Prinzip eines Enzyme-Linked-Immunsorbent-Assay (ELISA) 52 4.7.2 Labortechnische Durchführung der Zytokin-ELISAs 54 4.8 Statistische Auswertung 55 5 Ergebnisse 56 5.1 Dispergierung der Nanopartikel 56 5.2 Nanotoxizität von Zinkoxid 57 5.2.1 Nanotoxizität von Zinkoxid in Anwesenheit von FKS 57 5.2.2 Nanotoxizität von ZnO in Abwesenheit von FKS 63 5.3 Nanotoxizität von Ceroxid 72 5.3.1 Nanotoxizität von Ceroxid in Anwesenheit von FKS 72 5.3.2 Nanotoxizität von Ceroxid in Abwesenheit von FKS 76 6 Schlussfolgerungen und Diskussion 82 6.1 Herstellung homogener Nanopartikeldispersionen 82 6.2 Zinkoxid Nanopartikel wirken zytotoxisch auf A549 Zellen 85 6.3 Die Abwesenheit von FKS im Medium verstärkt die Effekte der ZnO NP 88 6.4 Die primäre und sekundäre Partikelgröße von ZnO-NP hat keinen Einfluss auf ihre Zytotoxizität 89 6.5 Ceroxid Nanopartikel wirken nicht zytotoxisch 90 6.6 Spezifisches Gefährdungspotential von Nanomaterialien 92 7 Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit 96 8 Lebenslauf 97 9 Danksagung 98 10 Anhang 99 10.1 Abkürzungsverzeichnis 99 10.2 Abbildungsverzeichnis 100 10.3 Literaturverzeichnis 102

Die Entdeckung der RNA‐Interferenz (RNA‐i) als ein natürlicher Prozess der Genregulation sorgte auf Grund des möglichen Einsatzes für therapeutische Zwecke für großes Interesse. Probleme beim Transport der RNA‐i‐induzierenden kleinen RNA‐Moleküle (siRNAs) traten vor allem hinsichtlich Ladungsverhältnissen, Instabilität und Molekulargewicht auf. Um diese Probleme zu lösen, wurden zunehmend Transportsysteme aus Nanopartikeln untersucht. Die verwendeten Polyethylenimine (PEIs) sind positiv geladene, verzweigt oder linear aufgebaute Polymere, welche mit RNAs (siRNA, miRNA) Komplexe bilden. Modifikationen der PEI‐Kom‐ plexe können zu einem effektiveren Transport der RNA, zu veränderten pharmakokinetischen Eigenschaften und zu einer verbesserten Biokompatibilität führen. Der Erfolg dieser therapeu‐ tischen Nanopartikel ist insbesondere von der effizienten zellulären Aufnahme, der Fähigkeit der Gewebepenetration und vom Erreichen der Zielzellen abhängig. Der Großteil der bisheri‐ gen Untersuchungen von PEIs wurde an Zellkulturen durchgeführt. Die hier erzielten Ergeb‐ nisse lassen sich jedoch nur schwer auf komplexe in‐vivo‐Systeme übertragen. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Anwendung der PEIs an Tumorschnitt‐ kulturen untersucht. Dafür wurde zuerst die Kultivierung von 350 μm durchmessenden Dünn‐ schicht‐Präparaten von Xenotransplantat‐Tumoren aus PC3 und U87 Zelllinien etabliert. Eine erfolgreiche Kultivierung konnte über 14 Tage durchgeführt werden. An bestimmten Zeit‐ punkten nach Kultivierungsbeginn (Tag 1, 3, 5, 7 und 14) wurden die Morphologie und die Vitalität (Apoptose, Proliferation) durch eine HE‐ oder immunhistochemische Färbung be‐ stimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Morphologie der Tumorzellen sowie die Prolifera‐ tion und Apoptose über den gesamten Kultivierungszeitraum erhalten blieben. Im nächsten Schritt wurde sowohl der Transport der siRNA von nicht‐modifizierten und modi‐ fizierten PEIs als auch der Transport durch deren Lipopolyplex‐Derivate (PEI‐siRNA‐Komplexe mit Liposomenhülle) analysiert. Für die Visualisierung der Komplexe wurde fluoreszenzmar‐ kierte siRNA verwendet. Die PEI‐siRNA‐Komplexe wurden auf die Schnittkulturen gegeben und über 24 Stunden kultiviert. In der mikroskopischen Analyse und ihrer Quantifizierung erfolgte die erste Einschätzung der Gewebepenetration. Es zeigten sich Unterschiede in der Gewebe‐ penetration der verschiedenen Nanopartikel, abhängig von deren Oberflächenladung. Um die biologische Aktivität der Nanopartikel in lebenden Zellen besser evaluieren zu können, wurde im dritten Schritt der Knockdown eines endogenen Genproduktes untersucht. Zielgen war hier das Onkogen Survivin, welches ein wichtiger endogener Überlebensfaktor der Tu‐ morzellen darstellt. Es gelang der Nachweis eines durch PEI‐siRNA‐Komplexe vermittelten Knockdowns des Survivin‐Gens. Insgesamt konnten somit Gewebeschnittkulturen als Grundlage für die ex‐vivo Untersuchung von Nanopartikeln etabliert werden. Es konnten nicht nur Aussagen über die Gewebepenet‐ ration der Nanopartikel, sondern auch über ihre biologischen Aktivitäten in einer intakten Ge‐ webestruktur getroffen werden.:Bibliographische Beschreibung 3 1 Einleitung 5 1.1 Der Einsatz der RNA-Interferenz (RNA-i) und von Nanopartikeln in der Medizin 5 1.2 Die RNA-Interferenz 6 1.2.1 Der Prozess der RNA-Interferenz 6 1.2.2 Vor- und Nachteile der RNA-Interferenz 9 1.3 Nanopartikel als Transportsysteme der siRNA: Polyethylenimine 10 1.4 Die Transportfähigkeit von Polyethyleniminen und ihre Optimierung 12 1.5 Anwendung der Polyethylenimine in in-vivo-Systemen 14 1.6 Präklinische Tumormodelle 15 1.6.1 Zellkulturen 15 1.6.2 Xenograft-Modelle und Gewebeschnittkulturen 16 2 Fragestellung 18 3 Literatur 19 4 Publikationen 24 5 Anlagen 32 6 Zusammenfassung und Ausblick 33 7 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 36 8 Lebenslauf 37 9 Danksagung 40 10 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag 41 11 Teilnahmebestätigung: Vorlesung zur „Guten Wissenschaftlichen Praxis“ 42

In der Arbeit wurden mithilfe der Tumordokumentation am Regionalen Klinischen Krebsregister Leipzig (RKKR) die Daten von 5195 Lungenkarzinompatienten im 10-Jahres-Zeitraum von 2001 bis 2010 retrospektiv untersucht. Neben der Auswertung von Tumorcharakteristika sowie -spezifika mit zugehörigen Überlebensanalysen und deren Vergleich mit nationalen und internationa-len Publikationen, wurde außerdem die Dokumentationsqualität im RKKR Leipzig betrachtet. Die

Ziel der Studie war es, dass VITA Easyshade 5 mit dem VITA Easyshade 4 in Abhängigkeit von der Erfahrung des Benutzers in Bezug auf die gemessene Zahnfarbe zu vergleichen.

Lithiumdisilikatkeramik ist ein monolithisches, keramisches Material, welches hohe mechanische Stabilität mit transluzenten Elementen vereint und so der natürlichen Zahnhartsubstanz entspricht. Die Möglichkeit, Restaurationen aus diesem Material im chairside-Verfahren mit Hilfe von CAD/CAM-Technik herzustellen, gewährt der modernen Zahnmedizin ökonomische Vorteile, wie beispielsweise die Präparationsanalyse in Echtzeit, selektive Wiederholbarkeit des Abdruckes, digitales Archivieren, Versorgung in einer Sitzung, die damit verbundene sofortige bakteriendichte Versieglung der Dentinwunde und adhäsive Stabilisierung der Restzahnsubstanz. Außerdem ermöglicht es der modernen Zahnmedizin eine virtuelle Verlaufskontrolle und eine Datenfusion 15. Diese prospektive Studie hatte die Bewertung von im chairside-Verfahren hergestellten Lithiumdisilikatkeramikkronen nach 10 Jahren im Seitenzahngebiet sowohl hinsichtlich ihrer Überlebenswahrscheinlichkeit als auch ihrer Qualität zum Ziel. Es bestehen bereits Studien zu kurzzeitigen Untersuchungen dieser monolithischen Restauration sowie Arbeiten, die Langzeitergebnisse über laborgefertigte Kronen desselben Materials erheben. Für die monolithische Anwendung chairside-hergestellter Lithiumdisilikatkeramikkronen waren jedoch keine Langzeitstudien verfügbar. Zudem ist eine Evaluation über die langfristige, klinische Qualität dieser Kronen bisher nicht erfolgt. Einundvierzig Kronen aus Lithiumdisilikatkeramik wurden bei 34 Patienten (20 zahnmedizinische Fakultät/ 14 Zahnarztpraxis) im chairside-Verfahren hergestellt. Die Präparation erfolgte mittels abgerundeter Stufe oder einer ausgeprägten Hohlkehle. Außerdem wurde ein minimaler Substanzabtrag von 2 mm im Höckerbereich sowie 1,5 mm in der Fissur festgelegt. Die Restaurationen wurden optisch mit einer CEREC-3-Einheit abgeformt. Mit Hilfe der CEREC-Software 2.9 wurden die virtuellen Modelle zusammengefügt und die Kronen designt. Nach dem Sintern im Ofen erfolgte die Befestigung der Kronen mit einem selbstadhäsiven Zement. Die klinische Qualität der Kronen wurde nach den modifizierten Kriterien des US Public Health Service bewertet. Die Nachkontrollen fanden zur Baseline-Untersuchung sowie nach 12, 24, 36, 48, 60, 72 und 120 Monaten statt und beinhalteten die Erhebung der modifizierten USPHS-Kriterien. Die Kaplan-Meier-Analyse dieser Studie basiert auf der Überlebenswahrscheinlichkeit und der komplikationsfreien Rate. Zum Ausschluss einer Restauration führten Misserfolge. Diese wurden, wie auch die Komplikationen, in technische und biologische Ursachen unterteilt. Analog wurden Misserfolge auch als Komplikation gewertet. Bei den Nachuntersuchungen empfiehlt sich, immer nur eine Restauration pro Proband zu kontrollieren 41. Daher wurde in dieser Studie für die sieben Probanden, welche zwei Kronen erhielten, eine randomisierte Zuordnung mittels Randomisierungsliste durchgeführt, sodass jeweils nur eine Krone in der Nachuntersuchung betrachtet wurde. Die Pfeilerzahntopographie beschränkte sich auf den Seitenzahnbereich (10 Prämolaren-, 32 Molarenkronen). Die Probanden waren zu Studienbeginn im Durchschnitt 46,6 Jahre (±13,1; min. 26, max. 72; davon 62% weiblich). Die statistische Auswertung (IBM SPSS Statistics 22, IBM Ehningen, Deutschland) der Daten erfolgte mittels Kaplan-Meier-Analyse, Log-Rank-Test und Wilcoxon-Vorzeichenrangtest bei einem Signifikanzniveau von p=0,05. Nach durchschnittlich 10,1 Jahren wurden 26 Kronen untersucht und bewertet. Innerhalb dieses Untersuchungszeitraums traten fünf Fehler auf. Die Fraktur einer Krone nach 2,9 Jahren ist als technischer Fehler einzustufen, die Fraktur eines Zahnstumpfes nach 6,0 Jahren, die akute Exazerbation einer Parodontits apicalis chronica nach 6,1 Jahren sowie eine Wurzellängsfraktur nach 7,0 Jahren und eine erneuerungsbedürftige Krone, aufgrund einer kariösen Läsion am Kronenrand nach 10,0 Jahren wurden als biologische Fehler gewertet. Als Komplikationen galten zwei kariöse Läsionen am Kronenrand sowie die Dezementierung einer Krone nach zwei Jahren. Innerhalb der ersten 13 Monate ließ sich eine Sensibilitätsveränderung feststellen. Alle oben genannten Ereignisse traten an Molaren auf. Die Kaplan-Meier-Analyse für alle Kronen ergab eine Überlebenswahrscheinlichkeit von 83,5 % und eine komplikationsfreie Wahrscheinlichkeit von 71,0 % nach 10 Jahren. Bei der Analyse nach modifizierten USPHS-Kriterien nach 10 Jahren konnte eine fast ausschließliche Alpha-Bewertung festgestellt werden. Die Studie belegt das Auftreten einer geringen Anzahl von Fehlern und Komplikationen. Deshalb können Lithiumdisilkatkeramiken, die im chairside-Verfahren hergestellt wurden, für die Langzeitanwendung empfohlen werden.  :Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis III 1 Einführung 1 1.1 CAD/CAM 3 1.1.1 Digitale Abformung 6 1.1.2 Digitale Konstruktion 6 1.2 Keramik 9 1.2.1 Lithiumdisilikatkeramik 11 1.2.2 IPS e.max CAD 13 1.3 Befestigung 14 1.3.1 Konventionelle Befestigung 15 1.3.2 Adhäsive Befestigung 15 1.4 Langzeitstudien 17 1.5 Aufgabenstellung 18 2 Material und Methode 19 2.1 Studienpopulation 19 2.2 Präparationsrichtlinien 20 2.3 Abformung 21 2.4 Herstellung der Krone 21 2.5 Adhäsives Einsetzen 22 2.6 Nachkontrollen 22 2.7 Statistische Auswertung 23 2.7.1 Randomisierung 23 2.7.2 Überlebensanalyse 23 2.7.3 Qualitative Beurteilung der Restaurationen 24 3 Ergebnisse 25 3.1 Recall-Raten 25 3.2 Überlebensanalyse 25 3.2.1 Technische Komplikationen und Misserfolge 25 3.2.2 Biologische Komplikationen und Misserfolge 26 3.3 Qualitative Beurteilung nach modifizierten USPHS-Kriterien 29 3.3.1 Oberfläche 29 3.3.2 Farbe 30 3.3.3 Klebefuge 30 3.3.4 Integrität Zahn 31 3.3.5 Integrität Krone 32 3.3.6 Beschwerden 33 3.3.7 Compliance 34 4 Diskussion 35 4.1 Gegenstand der Diskussion 35 4.2 Methodische Stärken und Schwächen 35 4.3 Vergleich und Interpretation der Daten 36 4.3.1 Überlebensanalyse 36 4.3.2 Modifizierte USPHS-Kriterien 42 4.4 Ausblick 42 4.5 Schlussfolgerung 43 5 Zusammenfassung 44 6 Literaturverzeichnis 47 7 Abbildungsverzeichnis 52 8 Diagrammverzeichnis 53 9 Anhangsverzeichnis 54 10 Anhang 55 Eigenständigkeitserklärung 60 Publikationen 61 Danksagung 62

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Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Analyse der Matrixmetalloproteinase-2 in Aortenaneurysmen von Patienten mit bikuspider und trikuspider Aortenklappe eingereicht von: Katja Wolter angefertigt in/ an: Klinik für Herzchirurgie Herzzentrum Leipzig, Universität Leipzig Klinikdirektor: Prof. Michael A. Borger, MD, PhD Strümpellstraße 39, 04289 Leipzig betreut von: Prof. Dr. med. Christian D. Etz Dr. med. Josephina Haunschild Juni 2019 Die bikuspide Aortenklappe weist eine Inzidenz von 0,9 - 2 % auf und ist damit die häufigste kongenitale Herzklappenanomalie in der allgemeinen Bevölkerung (Fedak et al., 2005; Braverman et al., 2005). Nur bei 20 % der Patienten mit bikuspider Aortenklappe bleibt diese lebenslang funktionstüchtig (Collins et al., 2008; Butany et al., 2005, Michelena et al., 2008). Patienten mit bikuspider Aortenklappe haben oft ein erhöhtes Risiko für Komplikationen der Aorta ascendens. Aneurysmen treten häufiger und schwerer in jüngeren Jahren auf (Etz et al., 2010). Die Festigkeit der Aortenwand ist abhängig von der Balance zwischen Synthese und dem Abbau der extrazellulären Proteine. Der Verlust der Elastizität und der Aortencompliance begleitet möglicherweise langsam, aber fortschreitend die Dilatation der Aorta (Abaci et al., 2012). Matrixmetalloproteinasen gehören zur Familie der Proteasen, die eine wichtige Rolle in der Homöostase des Bindegewebes spielen (Stamenkovic et al., 2000; Sternlicht et al., 2001). Sowohl extrazelluläre als auch zelluläre Prozesse sind an der Pathogenese der Aortenaneurysmen beteiligt. Aneurysmen sind durch eine Schwäche und Deformierung der Architektur der Aorta gekennzeichnet und sind relativ häufig Ursache für den Tod durch Ruptur oder Dissektion (Mohamed et al., 2011). Die Aortendilatation bei Patienten mit bikuspiden Aortenklappe ist bedingt durch eine intrinsische Pathologie der Aortenwand, welche durch Medianekrose und -zerstörung charakterisiert ist (Abaci et al., 2012). Dies macht bikuspide Aortenklappen zu einer potentiell tödlichen Erkrankung (Tadros et al., 2009). Metalloproteinasen sind Bestandteile des Matrixstoffwechsels und beeinflussen so die Festigkeit der arteriellen Gefäßwand (Abaci et al., 2012). In der Aorta ascendens kommen hauptsächlich die Gelatinasen MMP-2 (Gelatinase A) und MMP-9 (Gelatinase B) vor, welche bevorzugt Kollagen Typ IV, teilweise auch Elastin und fibrilläres Kollagen abbauen (Abaci et al., 2012). Hintergrund der Studie waren Untersuchungen von Aortengewebe bikuspider Aortenklappenträger anderer Autoren, die Veränderungen der Matrixzusammensetzung bei Aortenaneurysmen von BAV-Patienten beschrieben (Wilton et al., 2007; Abaci et al., 2012). Daraus ergab sich die Hypothese, dass die Veränderung der Matrixenzyme bei BAV-Patienten eine Schwächung der Gefäßwand der Aorta ascendens bewirkt, die eine gehäufte Aneurymaausbildung erklärt. Fragestellung: Ist die Expression des MMP-2-Gens in der Gefäßwand aneurysmatisch veränderter Aorta ascendens bei BAV-Patienten im Vergleich zu TAV-Patienten erhöht und hat dies eine vermehrte Proteinmenge und Aktivität des Matrixenzyms in der Aortenwand zur Folge? Bestehen Mutationen im MMP-2-Gen, die diese Veränderung des Matrixenzyms erklären? Methoden: Es wurden Gefäßwandproben von Patienten mit aneurysmatisch erweiterter Aorta ascendens auf Veränderungen der Matrixmetalloproteinase-2 bei bikuspider und trikuspider Aortenklappe untersucht. Zunächst erfolgte die Bestimmung der Genexpression des Matrixenzyms MMP-2. Des Weiteren erfolgte die Quantifizierung des Enzyms im Aortengewebe der Probanden mittels Western Blot Analyse und ELISA. Außerdem wurde die Aktivität des matrixabbauenden Enzyms mittels Zymographie bestimmt. Weiterhin wurde die DNA aus den Aortenwandproben von BAV- und TAV-Patienten isoliert und die kodierende Region des MMP-2-Gens mittels High-Resolution-Melting-PCR (HRM-PCR) analysiert. Ergebnisse: Auf mRNA-Ebene zeigte sich eine signifikant erhöhte Expression der MMP-2 bei Patienten mit bikuspider Aortenklappe. Dies spiegelt sich auch in der Quantifizierung des MMP-2 Proteins in der Western Blot Analyse und im ELISA wider. Ebenso konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine erhöhte Enzymaktivität der MMP-2 in der Zymographie bei BAV Patienten nachgewiesen werden. Bei der HRM-Analyse zeigte sich in der Kohorte der BAV-Patienten eine Veränderung der Basenabfolge im MMP-2-Gen. Diskussion: Die bikuspide Aortenklappe ist die häufigste kongenitale kardiale Malformation und betrifft ca. 0,9 - 2 % der Bevölkerung . Sie ist mit einem erhöhten Risiko für Komplikationen, wie beispielsweise einem vermehrten Auftreten von Aortenaneurysmen, verbunden (Fedak et al., 2005; Yuan et al., 2010). Patienten mit BAV entwickeln zu etwa 26 % ein Aneurysma der Aorta ascendens (Ferencik et al., 2003; Roberts et al., 1991). Sie stellen ein erhöhtes Risiko für eine Aortendissektion dar. Die Studie zielte darauf ab Unterschiede in der Entstehung von Aneurysmen bei BAV-Patienten im Vergleich zu TAV-Patienten zu detektieren und eine Erklärung für das gehäufte Auftreten von Aneurysmen bei der Patientengruppe mit bikuspider Aortenklappe zu finden. Unter den in dieser Studie untersuchten Probanden wiesen 72 % der BAV-Patienten und nur 15 % der TAV-Patienten eine Aortenklappenstenose auf. Es traten also signifikant mehr Aortenstenosen bei Patienten mit BAV-Klappe auf. Diese Ergebnisse korrelieren mit Daten weiterer Studien, die ebenfalls zeigten, dass BAV-Patienten zur Ausbildung von Stenosen neigen und mit Aortenpathologien wie einer häufigeren Aneurysma-Ausbildung assoziiert sind (Michelena et al., 2011; Braverman et al., 2005; Fedak et al., 2002; Tadros et al., 2009; Ferencik et al., 2003; Ward et al., 2000). Die veränderte Hämodynamik ist als ein Faktor der gehäuften Erweiterung anzusehen. Aber auch genetische Faktoren, insbesondere diejenigen, die den Stoffwechsel der extrazellulären Matrix regulieren, wurden als maßgebliche Mechanismen für die Aneurysmabildung erkannt. Im Rahmen dieser Studie wurden aneurysmatisch veränderte Aortenproben von BAV- und TAV-Patienten untersucht, um Unterschiede in der Aktivität der Matrixmetalloproteinase-2 zu detektieren. In unserer untersuchten Kohorte zeigten im MMP-2 SNP rs243865 nur 39 % der BAV Patienten eine unveränderte Basenabfolge. Das bedeutet, dass BAV-Patienten gehäuft Mutationen im MMP-2-Gen aufweisen, die den Matrixstoffwechsel durch Überwiegen der Matrix-abbauenden Enzyme beeinflussen könnten. In der vorliegenden Arbeit wiesen BAV-Patienten, verglichen mit TAV-Patienten, eine signifikant höhere MMP-2 mRNA Expression auf, was zunächst keine Rückschlüsse auf die tatsächliche Proteinmenge und Aktivität des MMP-2-Enzyms im Aortengewebe zulässt. Jedoch zeigte sich sowohl eine erhöhte mRNA-Expression und ein vermehrter Proteingehalt an MMP-2 im untersuchten Gewebe als auch eine signifikant höhere MMP-2 Enzymaktivität im Aortengewebe von BAV-Patienten. Schlussfolgerung: Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Patienten mit bikuspider Aortenklappe und assoziiertem proximalen Aortenaneurysma eine erhöhte Enzymaktivität der Matrixmetalloproteinase-2 aufweisen und dies eine potenzielle Ursache für die Entstehung der Aneurysmen, durch einen vermehrten Abbau der extrazellulären Matrix, darstellt. In Einklang mit der Enzymaktivität steht eine erhöhte Proteinmenge, sowie auf mRNA-Ebene eine vermehrte Expression der MMP-2. Auch die Häufigkeit sogenannter single nucleotide polymorphisms weicht von der der Patienten mit trikuspider Aortenklappe und assoziiertem Aortenaneurysma ab. Ob dies funktionelle Auswirkungen hat bleibt unklar.:Inhaltsverzeichnis 2 Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung 7 1.1. Bikuspide Aortenklappe (BAV) 7 1.1.2. Inzidenz 8 1.1.3. Histologie 9 1.1.4. Genetik 9 1.2. Molekulare Veränderungen 10 1.2.1. Matrixmetalloproteinasen allgemein 10 1.2.2. Veränderung der Matrixmetalloproteinasen bei BAV-Patienten 12 1.2.3. Blutfluss 12 1.2.4. Aortenwandveränderungen 12 1.3. Pathologie 13 1.4. Assoziierte Erkrankungen 14 1.4.1. Marfan-Syndrom 14 1.4.2. Turner-Syndrom und Williams-Beuren-Syndrom 15 1.5. Familiäres und spontanes thorakales Aortenaneurysma (TAA) 16 1.5.1. Thorakales Aortenaneurysma (TAA) 16 1.6. Operative Versorgung von Aortenaneurysmen 17 1.6.1. Guidelines – Wann Ersatz (45 mm, ACC AHA Guidelines 2014) 17 1.6.2. Operative Verfahren 18 1.6.4. Bentall-Operation 20 1.6.5. Suprakoronarer Ascendensersatz 21 2. Zielstellung 22 3. Material 23 3.1. Geräte 23 3.2. Verbrauchsmaterialien 24 3.3. Chemikalien und kommerzielle Kits 25 3.4. verwendete Antikörper 28 3.5. Puffer und Lösungen 29 3.6. DNA Isolation 32 32 3.7. Gele für SDS-PAGE 33 3.8. Gel für Zymographie 33 3.7. Software 34 3.8. Materialien der High-Resolution-Melting-PCR 35 4. Methoden 36 4.1. mRNA Gen-Expressionsanalyse mittels Chip Array Analyse 36 (Firma OakLabs, Berlin) 36 4.2. DNA-Isolation aus humanen Aorten 37 4.2.1. Photometrische Erfolgskontrolle 38 4.3. SDS-Gelelektrophorese 39 4.4. Western Blot Analyse 40 4.5. Zymographie 41 4.5.1. MMP-2 Aktivitätsbestimmung mittels Zymographie 41 4.6. SNP-Analyse mittels High-Resolution-Melting-PCR 43 5. Ergebnisse 46 5.1. mRNA Gen-Expressionsanalyse mittels Chip Array Analyse (Firma OakLabs, Berlin) 46 5.1.1. genome-wide Gen-Expressionsanalyse des MMP-2-Gens 46 5.2. Analyse der MMP-2 SNPs als Ausdruck genetischer Variationen 48 5.2.1. Gene scanning der MMP-2 mittels High-Resolution-Melting-PCR 48 5.3. Untersuchung der Proteinmenge der MMP-2 mittels Western Blot Analyse 54 5.3. Analyse der MMP-2 Proteinexpression mittels Western Blot Analyse 56 5.4. Untersuchung der Proteinmenge der MMP-2 im ELISA 59 5.5. Untersuchung der Enzymaktivität der MMP-2 mittels Zymographie 61 5.6. Zusammenfassung 64 6. Diskussion 65 6.1. Die Patientenpopulation 65 6.2. Diskussion der MMP-2 SNPs als Ausdruck genetischer Variationen 67 6.3. MMP-2 Genexpression und quantitativer Vergleich der MMP-2 Proteinexpression 68 6.4. Aktivität des MMP-2-Enzyms 70 7. Schlussfolgerungen 73 8. Limitationen 74 9. Zusammenfassung der Arbeit 75 10. Literaturverzeichnis 79 11. Abbildungsverzeichnis 87 12. Tabellenverzeichnis 88 13. Danksagung 89 14. Eigenständigkeitserklärung 90 15. Lebenslauf 91

Die Anzahl an Frühgeburten ist in den letzten Jahren weltweit nicht gesunken und stellt einerseits Geburtsmediziner, Neonatologen und die betroffenen Familien vor große Herausforderungen und geht andererseits mit relevanten medizinischen und sozioökonomischen Folgen einher. Eine (aszendierende) intrauterine Infektion und ein folgendes Amnioninfektionssyndrom (AIS), stellen ein großes Risiko für eine drohende Frühgeburt und mögliche perinatale Infektion dar. Eine rechtzeitige Diagnostik ist dabei entscheidend. Das AIS ist in den meisten Fällen eine Verdachtsdiagnose, da klinische Infektionszeichen sowie CRP und Leukozyten im maternalen Blutserum zu unspezifisch sind bzw. erst spät pathologisch werden. Im Gegensatz dazu gibt es Hinweise, dass das Zytokin IL-6 aus dem Fruchtwasser eine bessere Sensitivität und Spezifität für die Erkennung eines AIS aufweist. Seit 2009 wird dieser Parameter im Fruchtwasser von Frauen mit dem V.a. ein AIS durch eine Amniozentese auch am Universitätsklinikum Leipzig bestimmt. Es gibt derzeit keine validierten Norm- und Grenzwerte, ab denen eine Entbindung erfol-gen muss. Die ausschlaggebende klinische Entscheidungsfindung ist, ob die Schwangerschaft weiter prolongiert werden kann, um fetale Komplikationen einer Frühgeburt zu vermeiden oder ob das Risiko eines Übertritts der Infektion auf den Fetus in utero zu hoch ist. Ziel der Arbeit war es, die Bedeutung von IL-6 im Fruchtwasser im Management des vorzeitigen Blasensprungs am UKL zu evaluieren. Dazu wurde ein Kollektiv von 48 Frauen mit vorzeitigem Blasensprung, die von 2009 bis 2017 mit dem V.a. AIS einer Amniozentese unterzogen wurden, untersucht. Die mütterlichen sowie fetalen laborchemischen und klinischen Parameter wurden mit IL-6 im Fruchtwasser in Zusammenhang gebracht. CRP (p = 0,011) und Leukozyten (p = 0,019) im mütterlichen Blut zeigten eine schwache positive Korrelation. Sie können als Hinweis auf ein entstehendes AIS gedeutet werden und die Selektion von Patientinnen für eine Amniozentese erleichtern. Klinische Parameter der Mutter, wie Fieber, Wehen oder Blutungen standen in keinem Zusammenhang mit IL-6 im Fruchtwasser. Folgt man der Literatur, ist der Erreger Ureaplasma urealyticum häufig für eine aszendierende Infektion verantwortlich. Er wurde bei 32,7% der untersuchten Frauen aus dem Vaginalabstrich isoliert. Zu IL-6 im Fruchtwasser konnte keine signifikante Korrelation hergestellt werden (p = 0,467). Die Zeiten vom Blasensprung bis zur Entbindung (p = 0,000) sowie zur Punktion (p = 0,007) und zwischen Punktion und Entbindung (p = 0,000) standen in einem signifikanten negativem Zusammenhang mit IL-6. Frauen mit einem höheren Entzündungswert wurden früher punktiert und haben eher entbunden, als Frauen mit einem niedrigen Wert. Dies deutet auf eine frühzeitige Selektion von Risikopatientinnen hin, bei denen eine unmittelbare klinische Konsequenz folgte. 93,3% der Neugeborenen waren Frühgeborene (< 37.0 SSW). Insgesamt zeigten sechs Neugeborene (12,2%) eine Early-Onset-Sepsis nach der Geburt. Eine Korrelation zu IL-6 im Fruchtwasser bestand nicht (p = 0,275). In 66,7% der Neugeborenen mit Sepsis war der IL-6-Wert im Fruchtwasser ≥ 50000 pg/ml und es wurde eine sofortige Entbindung veranlasst. Im Gesamtkollektiv sowie bei den Neugeborenen mit Sepsis konnte keine Korrelation zwischen IL-6 im Fruchtwasser mit IL-6 im Nabelschnurblut hergestellt werden. Es ist deshalb davon auszugehen, dass es sich bei IL-6 im Fruchtwasser eher um einen maternalen Marker handelt. Ein IL-6-Wert im Fruchtwasser ≥ 10000 pg/ml hatte eine Sensitivität von 66,7% und eine Spezifität von 56,1% in der Identifikation einer Early-Onset-Sepsis der Neugeborenen. Eine weitere Verbesserung könnte in Zukunft durch eine prospektiv angelegte Studie erzielt werden, um einen Grenzwert zu ermitteln, der ein optimales Management von Risikoschwangeren ermöglicht und einen bestmöglichen Entbindungszeitpunkt anzeigt, um die Anzahl der Neugeborenen mit Sepsis zu minimieren.:Inhaltsverzeichnis I. Abkürzungsverzeichnis IV II. Abbildungsverzeichnis VI III. Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Frühgeburt 2 1.1.1 Definition 2 1.1.2 Epidemiologie 2 1.1.3 Ätiologie 3 1.1.4 Vorzeitiger Blasensprung 6 1.1.5 Diagnostik 6 1.1.6 Therapie und Prävention 8 1.2 Amnioninfektionssyndrom 10 1.2.1 Definition 10 1.2.2 Entstehung 10 1.2.3 Mikrobiologie 13 1.2.4 Risiko für Mutter und Kind 14 1.2.5 Diagnostik 17 1.2.6 Therapeutische Maßnahmen 21 1.3 Zytokine 24 1.3.1 Definition 24 1.3.2 Einteilung 26 1.3.3 Auslöser einer Entzündungsreaktion 26 1.3.4 Interleukin-6 28 2 Fragestellung und Zielsetzung 30 3 Material und Methoden 31 3.1 Studienart 31 3.2 Patientenkollektiv 31 3.2.1 Ein- und Ausschlusskriterien 32 3.3 Erhobene Daten 32 3.3.1 Klinische Parameter der Schwangeren 32 3.3.2 Entbindungsparameter 33 3.3.3 Kindliche Parameter 34 3.4 Statistik 36 4 Ergebnis 37 4.1 Infektionsparameter im mütterlichen Blut und IL-6- Konzentration 37 4.2 Klinische Parameter der Schwangeren 38 4.2.1 Mütterliches Alter, Blasensprung und Punktion 38 4.2.2 Fieber, Wehentätigkeit und Blutung zur Punktion 39 4.2.3 Behandlungsbedürftiger Vaginalabstrich und antibiotische Therapie 39 4.3 Mehrfachpunktionen 43 4.4 Einfluss der Zeit zwischen Blasensprung, Punktion und Entbindung 44 4.4.1 Deskriptive Analyse 44 4.4.2 Zeitspannen im Zusammenhang mit IL-6 im Fruchtwasser 46 4.5 Entbindungsparameter 47 4.5.1 Grund der Entbindung 47 4.5.2 Entbindungsmodus 48 4.5.3 Fetales CTG am Punktionstag 49 4.6 Klinische Charakteristika der Neugeborenen 51 4.6.1 Fetales Geschlecht 51 4.6.2 Klinische Parameter nach Gestationsalter 51 4.6.3 Infektionsparameter der Neugeborenen 54 4.6.4 Intensivtherapie und Beatmung 54 4.7 Deskriptive Darstellung der Neugeborenen mit Early-Onset-Sepsis 55 4.8 Vergleich von Neugeborenen mit und ohne Early-Onset-Sepsis 58 4.8.1 IL-6 im Fruchtwasser 58 4.8.2 Laborchemische und klinische Parameter der Mutter 59 4.8.3 Entbindungsparameter 61 4.8.4 Fetale Anpassung nach der Geburt 63 5 Diskussion 65 5.1 Infektionsparameter in Serum und Fruchtwasser 65 5.2 Klinische Parameter der Schwangeren 67 5.3 Mikrobiologie 68 5.4 Zeitintervall bis zur Entbindung 71 5.5 Entbindungsparameter 73 5.6 Neonatales Outcome 75 5.7 Kritik und Ausblick 76 6 Zusammenfassung 78 7 Literaturverzeichnis 81 Anhang A 99 A1. Korrelationen klinischer und laborchemischer Charakteristika mit IL-6 99 A2. Klinische Parameter der Neugeborenen 101 A3. Korrelationen von Neugeborenen mit EOS und IL-6 im Fruchtwasser 102 A4. Vergleich der Neugeborenen mit und ohne Early-Onset-Sepsis 103 Anhang B 104 Outcome eines Zwillingspaares 104 Selbstständigkeitserklärung 105 Danksagung 106

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