Made available in DSpace on 2016-12-08T16:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV09MA040.pdf: 1813024 bytes, checksum: fd828a9db77a0c94957d7cf4a2f333a1 (MD5) Previous issue date: 2009-02-03 / The fungus Stenocarpella maydis usually can cause corn stalk and ear rot. There is little data on the genetic resistance of maize plants to S. maydis. The Stenocarpella resistance has been investigated around the world by artificial inoculation techniques with inoculum produced mostly in fragments of maize plant and sorghum and oats grains. The amount of inoculum produced by these techniques is low, require a long period of incubation to gave a satisfactory inoculum levels. Despite of the substrate, temperature and luminosity are essential factors to stimulate the pathogens sporulation. The objective of this study was to determine an easy, quick and reproducible method by relative low cost to induce the S. maydis sporulation. The experiments were carry out at the Plant Pathology Laboratory at the Centro de Ciências Agroveterinárias- CAV/UDESC during the years 2007/08. The S. maydis monosporic isolate was obtained from commercial crops naturally infected in the Aberlado Luz County, Santa Catarina State. Preliminary were carry out a experiment with 20 potentials natural substrates from grains and leaves and stalks fragments of different plants like, sorghum, wheat, white oat, black oat, rye, barley and maize , with the objective to select the most promising substates. Were discarded 13 substrates by not present desirable features in any stage of preparation, maintenance, production and conidia amount. The remained 07 natural substrates based in grains of sorghum, wheat, white and black oat, rye, barley and maize were submitted to temperatures of 21, 24, 27, 30 and 33ºC on continuous light systems and darkness by period of 12 hours Each substrate was soaked in 100 mL of water for 24 hours in Erlenmeyer. After removal of excess water, the grains were sterilized twice in autoclave by 20 min at 127ºC. In each flask were added three disks of fungus mycelium. The material was incubated in growth chamber according to the different temperatures and light regimes. For each treatment three replicates were used. The assessment of the conidia number per gram of grains and conidia viability were measured at 15 days of incubation. The data of conidia number per gram of grain and conidia viability were transformed into √ (x +1) and subjected to analysis of variance and compared by Bonfferroni test by 1% of significance. Subsequent tests were done with the best natural substrates with the objective to evaluate differences between cultivars and the incubation period on the conidia production and viability. Many cereal grains, oil seeds and crushed fragments of maize can not be used as substrates to induce S. maydis sporulation. The grains of barley, black oat and wheat were the best ones for S. maydis conidia production and viability. The barley grain was the natural substrate that showed the biggest conidia production. The conidia production and viability were influenced by temperature and photoperiod. The S. maydis developed better at temperature of 27ºC and 12 h of photoperiod. There is conidia number variation among barley cultivars, which was not checked for viability of conidia. Same procedure was performed with Stenocarpella macrospora, however not obtained enough for measurement of spore production and germination of conidia. Keywords: Conidia. Diplodia. inoculum production. Zea mays / O fungo Stenocarpella maydis comumente causa podridão do colmo e da espiga em milho. Pouca informação existe sobre a resistência genética de plantas de milho à S. maydis. A resistência à Stenocarpella vem sendo investigada em diversas partes do mundo por técnicas de inoculação artificial a partir de inóculo produzido, principalmente, em fragmentos da planta de milho e grãos de sorgo e aveia. Neste caso, a quantidade de inóculo produzido é baixa, necessitando longo período de incubação para a produção de inóculo em níveis satisfatórios. Além do substrato, temperatura e luminosidade são fatores essenciais para estimular a esporulação dos fitopatógenos. O objetivo deste trabalho foi determinar um método fácil, rápido, reproduzível e de baixo custo para a indução à esporulação de S. maydis. O experimento foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia Centro de Ciências Agroveterinárias da Universidade do Estado de Santa Catarina, CAV/UDESC, Lages, SC, em 2008. O isolado monospórico do fungo foi obtido de grãos de milho naturalmente infectados oriundos de lavouras comerciais de município de Abelardo Luz, SC. Previamente foram realizados ensaios com 20 possíveis substratos naturais a partir de compostos de grãos, fragmentos de folhas e colmos de plantas como sorgo, trigo, aveia branca, aveia preta, centeio, cevada e milho a fim de selecionar os mais promissores. Foram descartados 13 diferentes substratos naturais que não apresentaram caracteristicas desejáveis em qualquer etapa de preparação, manutenção, produção e contagem de conídios. Os 07 substratos naturais de grãos de sorgo, trigo, aveia branca, aveia preta, centeio, cevada e milho, foram submetido às temperaturas de 21, 24, 27, 30 e 33ºC, em regimes de luz contínua, escuro e por período de 12 horas. Cada substrato foi embebido em 100 mL de água por 24 horas em Erlenmyers. Após a remoção do excesso de água os grãos foram esterilizados por duas autoclavagens por 20 min a 127ºC. Em cada Erlenmeyer foram inseridos três discos de micélio do fungo. O material foi incubado em câmara de crescimento nas respectivas temperaturas e regimes de luz. Para cada tratamento foram utilizadas três repetições. A avaliação do número de conídios por grama de grãos e a viabilidade dos conídios foi quantificada aos 15 dias de incubação. Os dados do número de conídios/g de grãos e a viabilidade dos conídios foram transformados em √(x+1) e submetidos a análise de variância e comparados pelo teste de Bonfferroni a 1% de significância. Posteriormente foi realizado ensaio com o melhor substrato natural com o objetivo de avaliar diferenças entre cultivares e tempo de incubação na produção e viabilidade de conídios. Muitos grãos de cereais, oleaginosas e fragmentos de milho não podem ser usados como substratos para induzir a esporulação de S. maydis. Os grãos de cevada, aveia preta e trigo foram os melhores para produção e viabilidade de conídios de S. maydis. A cevada foi o substrato natural que apresentou a maior produção de conídios. A produção de conídios e a viabilidade são influenciadas pela temperatura e fotoperiodo, sendo que S. maydis responde melhor a temperatura de 27 ºC e fotoperíodo 12 h. Existe variação entre cultivares de cevada para número de conídios, o que não foi verificado para viabilidade de conídios. Procedimento igual foi realizado com Stenocarpella macrospora, no entanto não se obteve esporulação suficiente para mensuração da produção e germinação de conídios

The enzymatic conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars is a promising approach for producing renewable fuels and chemicals. However, the cost of the fungal enzymes usually employed in this process remains a significant bottleneck for manufacturing low value-added products from biomass. A potential route to increase hydrolysis yield, and thereby to reduce hydrolysis cost, would be to supplement the fungal enzymes with their lacking enzymatic activities, such as Beta-glucosidase. To produce such enzymes at a low cost, the bacterium Escherichia coli is a strong contender, owing to its ability to grow rapidly on simple and inexpensive media, and to achieve high levels of productivity. Nevertheless, there is hardly any techno-economic analysis of low-value protein production using E. coli in the literature, and, more generally, there are very few techno-economic analyses of low-value protein production ever reported, with the exception of cellulase production by Trichoderma reesei. In particular, the biotechnological application of recombinant E. coli platforms equipped with toxin-antitoxin systems to ensure plasmid stability remains largely unexplored, and its economic impact, unknown. As such, this work presents a comprehensive techno-economic analysis of the industrial production of a low-cost enzyme (Beta-glucosidase) using both E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, a modified BL21(DE3) strain equipped with a toxin-antitoxin system for plasmid maintenance. Moreover, this study describes the actual cloning and expression of a Beta-glucosidase enzyme into E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, and the development of a novel inoculum production scheme that exploits the features of the SE1 strain, based on repeatedly recycling a fraction of the inoculum cells. The results of the techno-economic analysis project an enzyme production cost of 316 US$/kg in the baseline scenario, which is considerably higher than the values reported in the literature for the fungal cocktails. The facility-dependent cost, which is strongly associated with the cost of equipment, accounts for roughly half of the estimated cost, while the cost of raw materials, especially IPTG and glucose, and the cost of consumables are all quite significant. However, the simulation of multiple scenarios and optimization measures suggest that the enzyme cost can be substantially reduced on many fronts, such as: substituting the carbon source for cheaper alternatives; reducing the amount of IPTG used for induction; using an E. coli strain capable of extracellular production; or eliminating the steps of concentration and stabilization of the enzyme, in the case of on-site enzyme utilization. Developing E. coli strains capable of high rEnzyme volumetric productivities can also significantly reduce the cost of the enzyme, up to approximately 135 US$/kg in the scenario of highest productivity. In addition, based on the experimental results with the E. coli SE1 system, an inoculum recycle strategy that avoids the need of an extensive seed train was simulated, resulting in a significant reduction of the enzyme cost. Finally, the combination of multiple process improvements could lead to an enzyme cost near 20 US$/kg of protein, which comes close to the cost of fungal cellulases and demonstrates the great biotechnological potential of recombinant E. coli platforms. / A conversão enzimática de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis é uma via promissora para a produção de combustíveis e produtos químicos renováveis. No entanto, o custo das enzimas fúngicas usualmente empregadas nesse processo permanece um gargalo significativo para a fabricação de produtos de baixo valor agregado a partir de biomassa. Uma possível estratégia para aumentar o rendimento da hidrólise e, assim, reduzir seu custo, seria suplementar as enzimas fúngicas com suas atividades enzimáticas deficientes, tais como a enzima Beta-glicosidase. Para produzir tais enzimas a um baixo custo, a bactéria Escherichia coli é uma forte candidata, dada a sua capacidade de crescer rapidamente em meios simples e baratos e de alcançar altos níveis de produtividade. No entanto, na literatura quase não há análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado utilizando E. coli e, de forma mais geral, há muito poucas análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado publicadas, com exceção da produção de celulases por Trichoderma reesei. Em particular, a aplicação biotecnológica de plataformas recombinantes baseadas em E. coli dotadas de sistemas toxina-antitoxina para garantir a estabilidade plasmidial segue em larga medida inexplorada, e seu impacto econômico, desconhecido. Assim, este trabalho apresenta uma análise técnico-econômica abrangente da produção industrial de uma enzima de baixo custo (Beta-glicosidase) usando E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, uma cepa de BL21 (DE3) modificada que possui um sistema toxina-antitoxina para manutenção plasmidial. Além disso, este estudo descreve a clonagem e expressão de uma Beta-glicosidase em E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, assim como o desenvolvimento de um novo método de produção de inóculo que tira proveito das peculiaridades da linhagem SE1, baseado em reciclar repetidamente uma fração das células do inóculo. Os resultados da análise técnico-econômica apontam para um custo de produção da enzima de 316 US$/kg no cenário-base, valor consideravelmente superior àqueles relatados na literatura para os coquetéis fúngicos. Os custos de overhead da planta, que estão fortemente associados ao custo de aquisição dos equipamentos, são responsáveis por aproximadamente metade do custo total, enquanto o custo de matérias-primas, especialmente IPTG e glicose, e o custo de consumíveis são bastante significativos. Porém, a simulação de múltiplos cenários e medidas de otimização sugerem que o custo da enzima pode ser substancialmente reduzido em muitas frentes, tais como: a substituição da fonte de carbono por alternativas mais baratas; a redução da quantidade de IPTG usado para indução; a utilização de cepas capazes de produzir a enzima extracelularmente; ou a eliminação das etapas de concentração e estabilização da enzima, em caso de utilização da enzima in situ. O desenvolvimento de cepas de E. coli capazes de atingir altas produtividades volumétricas de rEnzima também pode reduzir significativamente o seu custo, chegando a US$ 135/kg no cenário de maior produtividade. Com base nos resultados experimentais com a linhagem E. coli SE1, uma estratégia de reciclagem de inóculo que evita a necessidade de um extenso trem de inoculação também foi simulada, gerando significativa diminuição do custo da enzima. Por fim, a combinação de múltiplas melhorias no processo poderia levar a um custo de enzima em torno de 20 US$/kg de proteína, valor que se aproxima do custo das celulases fúngicas e que demonstra o grande potencial biotecnológico de plataformas de expressão baseadas em E. coli recombinante.

Alternaria dauci e A. solani são duas espécies de fungos fitopatogênicos reconhecidamente difíceis de esporular em meio de cultura. Isto dificulta as inoculações artificiais e, conseqüentemente, prejudica o processo de seleção de genótipos de cenoura e tomate resistentes às doenças causadas por estes fungos. Este trabalho teve o objetivo de verificar a influência de alguns fatores, aplicados na incubação, sobre o crescimento micelial e esporulação das duas espécies fúngicas. Diferentes meios de cultura (BDA, aveia e V8), temperatura (15, 20, 25, 30 e 35 °C), comprimentos de onda da luz usada na incubação (amarela, azul, branca, NUV, verde e vermelha), tipos de estresse aplicado à colônia (raspagem, UV, irradiação de microondas e temperatura de 100 °C) e fotoperíodos (luz / escuro, respectivamente, de 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 e 0 h / 24 h) foram testados. Após a determinação dos melhores fatores, o método desenvolvido neste trabalho foi comparado ao método tradicionalmente utilizado (BDA, 25 °C, 12 h luz branca / 12 h escuro e raspagem da colônia), utilizando diversos isolados de ambas as espécies. Os resultados indicaram o meio V8-ágar e a temperatura de 25 °C como os mais favoráveis ao crescimento e esporulação. Os diferentes comprimentos de onda utilizados tiveram influência marcante na esporulação, sendo o NUV o mais estimulante. Todos os tipos de estresse aplicados induziram esporulação, porém, a raspagem das colônias proporcionou os melhores resultados. O fotoperíodo 12 h luz NUV / 12 h escuro foi o que mais estimulou a esporulação. Observou-se que, de modo geral, períodos de escuro maiores que os períodos de luz aplicados após o estresse da colônia, favoreceram a esporulação. Dessa forma, o processo desenvolvido neste trabalho consistiu de incubação em meio V8-ágar, temperatura de 25 °C, raspagem da colônia e fotoperíodo de 12 h luz NUV / 12 h escuro. Este procedimento mostrou-se nitidamente superior ao tradicionalmente utilizado para crescimento e esporulação de ambas as espécies. / Alternaria dauci e Alternaria solani are two phytopathogenic fungus species known for difficult sporulation in culture media. This hampers artificial inoculations and, consequently, affects the selection process of carrot and tomato genotypes resistant to the diseases caused by these fungi. This study had the objective of verifying the influence of some factors applied during incubation on mycelia growth and sporulation of the two fungus species. Different culture media (BDA, oat and V8), temperature (15, 20, 25, 30 and 35 °C), light wavelengths during incubation (yellow, blue, white, NUV, green, and red), stress types applied to the colony (scratching, UV, microwave irradiation, and temperature of 100 °C) and photoperiods (light / dark, respectively, of 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 h and 0 h / 24 h) were tested. Upon determination of the best factors, the method developed in this study was compared to the traditional procedure (BDA, 25 °C, 12 h white / 12 h dark light and scratching of the colony), with different isolates of both species. Results indicated the V8-agar media and a temperature of 25 °C as most favorable for growth and sporulation. The different wavelengths had a marked influence on sporulation and NUV was the most stimulating. All applied stress types induced sporulation, but best results were obtained with scratching of the colonies. The 12 h light / 12 h dark photoperiod stimulated sporulation most. In general, longer dark than light periods after the stress of the colony favored sporulation. The procedure developed in this study consisted of incubation in V8-agar media, a temperature of 25 °C, scratching of the colony and a 12 h light / 12 h dark photoperiod. This process is clearly superior to the traditional method for growth and sporulation of both species.

Alternaria dauci e A. solani são duas espécies de fungos fitopatogênicos reconhecidamente difíceis de esporular em meio de cultura. Isto dificulta as inoculações artificiais e, conseqüentemente, prejudica o processo de seleção de genótipos de cenoura e tomate resistentes às doenças causadas por estes fungos. Este trabalho teve o objetivo de verificar a influência de alguns fatores, aplicados na incubação, sobre o crescimento micelial e esporulação das duas espécies fúngicas. Diferentes meios de cultura (BDA, aveia e V8), temperatura (15, 20, 25, 30 e 35 °C), comprimentos de onda da luz usada na incubação (amarela, azul, branca, NUV, verde e vermelha), tipos de estresse aplicado à colônia (raspagem, UV, irradiação de microondas e temperatura de 100 °C) e fotoperíodos (luz / escuro, respectivamente, de 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 e 0 h / 24 h) foram testados. Após a determinação dos melhores fatores, o método desenvolvido neste trabalho foi comparado ao método tradicionalmente utilizado (BDA, 25 °C, 12 h luz branca / 12 h escuro e raspagem da colônia), utilizando diversos isolados de ambas as espécies. Os resultados indicaram o meio V8-ágar e a temperatura de 25 °C como os mais favoráveis ao crescimento e esporulação. Os diferentes comprimentos de onda utilizados tiveram influência marcante na esporulação, sendo o NUV o mais estimulante. Todos os tipos de estresse aplicados induziram esporulação, porém, a raspagem das colônias proporcionou os melhores resultados. O fotoperíodo 12 h luz NUV / 12 h escuro foi o que mais estimulou a esporulação. Observou-se que, de modo geral, períodos de escuro maiores que os períodos de luz aplicados após o estresse da colônia, favoreceram a esporulação. Dessa forma, o processo desenvolvido neste trabalho consistiu de incubação em meio V8-ágar, temperatura de 25 °C, raspagem da colônia e fotoperíodo de 12 h luz NUV / 12 h escuro. Este procedimento mostrou-se nitidamente superior ao tradicionalmente utilizado para crescimento e esporulação de ambas as espécies. / Alternaria dauci e Alternaria solani are two phytopathogenic fungus species known for difficult sporulation in culture media. This hampers artificial inoculations and, consequently, affects the selection process of carrot and tomato genotypes resistant to the diseases caused by these fungi. This study had the objective of verifying the influence of some factors applied during incubation on mycelia growth and sporulation of the two fungus species. Different culture media (BDA, oat and V8), temperature (15, 20, 25, 30 and 35 °C), light wavelengths during incubation (yellow, blue, white, NUV, green, and red), stress types applied to the colony (scratching, UV, microwave irradiation, and temperature of 100 °C) and photoperiods (light / dark, respectively, of 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 h and 0 h / 24 h) were tested. Upon determination of the best factors, the method developed in this study was compared to the traditional procedure (BDA, 25 °C, 12 h white / 12 h dark light and scratching of the colony), with different isolates of both species. Results indicated the V8-agar media and a temperature of 25 °C as most favorable for growth and sporulation. The different wavelengths had a marked influence on sporulation and NUV was the most stimulating. All applied stress types induced sporulation, but best results were obtained with scratching of the colonies. The 12 h light / 12 h dark photoperiod stimulated sporulation most. In general, longer dark than light periods after the stress of the colony favored sporulation. The procedure developed in this study consisted of incubation in V8-agar media, a temperature of 25 °C, scratching of the colony and a 12 h light / 12 h dark photoperiod. This process is clearly superior to the traditional method for growth and sporulation of both species.