El presente estudio se realizó con el objetivo de evaluar y comparar la eficacia de dos tratamientos hormonales para la sincronización del celo e inseminación artificial a tiempo fijo en vacas cebuinas criadas al pastoreo en condiciones de trópico. Se seleccionaron 164 vacas de 2 a 4 partos, en condiciones ginecológicas óptimas, con parto normal y aparente actividad ovárica. Los animales fueron asignados al azar a uno de los 3 tratamientos en estudio: G1 (n= 34): aplicación de un análogo de progesterona, en forma de implante subcutáneo de silicona, que contiene 17ª –acetoxi-11b-metil-19 norpreg-4-en-3,20-diona por 10 días y simultáneamente una solución im de 5 mg de valerato de estradiol y 3 mg de norgestomet y al retirar el implante se aplicó 500 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada intramuscular, para realizar la IA a las 56 horas después de retirado el implante; G 2 (n= 32): Aplicación de .0105 mg de acetato de bucerelina, un análogo de GnRH (d 0) y 0.5 mg de cloprostenol (d 7) y una nueva dosis de del análogo de GnRH (d 9), para realizar la IA después de 16 horas; G3 (n= 98), considerado como grupo control y sometidas a observación diaria de celo, por un periodo de 30 días. Los datos fueron evaluados por CHI cuadrado. Los resultados obtenidos indican un porcentaje de preñez del 47.06, 40.63 y 10.2% para los tratamientos 1, 2 y 3 respectivamente, con diferencias entre los tratamientos 1 y 2 respecto del 3. la tasa de presentación de conducta de celo fue del 58.82%, 68.75% y 18.37% para los tratamientos 1, 2 y 3 respectivamente. La tasa global de preñez fue del 23.78%. Los resultados sugieren que no existe diferencia estadística significativa entre los grupos tratados, pero si respecto al grupo control (P menor 0.01). / --- Two hormonal protocols for synchronization of ovulation and timed artificial insemination (TAI) was evaluated in lactating beef cows, (n = 164), under grazing in Peruvian tropic. Group 1 (n = 34) received a progestin implant and a injection 5mg of oestradiol + 3 mg of norgestomet (d-0), implant was removal and 500UI of eCG injection (d-9) followed by fixed timed AI 52 a 54 h latter. Cows in the second group (32) received 0.0105 mg of bucerelina acetate (d 0), 0.5 mg de cloprostenol (d 7), and bucerelina acetate (d 9) followed by fixed timed AI 16 a 18 h. latter of the last GnRH injection. Cows in the control group, didn’t have received treatment, but they were observed to heat twice a day and inseminated 12 h after estrus behavior presentation. Pregnancy rates after only one AI 60 days after of breeding were similar between treatment, the proportion cows that pregnant in progesterone group was 47.06%, GnRH group was 40.63% and control group was 10.2%. Non statistical significance between treatments was determined.

El presente estudio se realizó con el objetivo de evaluar y comparar la eficacia de dos tratamientos hormonales para la sincronización del celo e inseminación artificial a tiempo fijo en vacas cebuinas criadas al pastoreo en condiciones de trópico. Se seleccionaron 164 vacas de 2 a 4 partos, en condiciones ginecológicas óptimas, con parto normal y aparente actividad ovárica. Los animales fueron asignados al azar a uno de los 3 tratamientos en estudio: G1 (n= 34): aplicación de un análogo de progesterona, en forma de implante subcutáneo de silicona, que contiene 17ª –acetoxi-11b-metil-19 norpreg-4-en-3,20-diona por 10 días y simultáneamente una solución im de 5 mg de valerato de estradiol y 3 mg de norgestomet y al retirar el implante se aplicó 500 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada intramuscular, para realizar la IA a las 56 horas después de retirado el implante; G 2 (n= 32): Aplicación de .0105 mg de acetato de bucerelina, un análogo de GnRH (d 0) y 0.5 mg de cloprostenol (d 7) y una nueva dosis de del análogo de GnRH (d 9), para realizar la IA después de 16 horas; G3 (n= 98), considerado como grupo control y sometidas a observación diaria de celo, por un periodo de 30 días. Los datos fueron evaluados por CHI cuadrado. Los resultados obtenidos indican un porcentaje de preñez del 47.06, 40.63 y 10.2% para los tratamientos 1, 2 y 3 respectivamente, con diferencias entre los tratamientos 1 y 2 respecto del 3. la tasa de presentación de conducta de celo fue del 58.82%, 68.75% y 18.37% para los tratamientos 1, 2 y 3 respectivamente. La tasa global de preñez fue del 23.78%. Los resultados sugieren que no existe diferencia estadística significativa entre los grupos tratados, pero si respecto al grupo control (P menor 0.01). / Two hormonal protocols for synchronization of ovulation and timed artificial insemination (TAI) was evaluated in lactating beef cows, (n = 164), under grazing in Peruvian tropic. Group 1 (n = 34) received a progestin implant and a injection 5mg of oestradiol + 3 mg of norgestomet (d-0), implant was removal and 500UI of eCG injection (d-9) followed by fixed timed AI 52 a 54 h latter. Cows in the second group (32) received 0.0105 mg of bucerelina acetate (d 0), 0.5 mg de cloprostenol (d 7), and bucerelina acetate (d 9) followed by fixed timed AI 16 a 18 h. latter of the last GnRH injection. Cows in the control group, didn’t have received treatment, but they were observed to heat twice a day and inseminated 12 h after estrus behavior presentation. Pregnancy rates after only one AI 60 days after of breeding were similar between treatment, the proportion cows that pregnant in progesterone group was 47.06%, GnRH group was 40.63% and control group was 10.2%. Non statistical significance between treatments was determined.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El presente trabajo tuvo como objetivo principal comparar el efecto de dos concentraciones espermáticas de inseminación artificial (IA) sobre las variables fertilidad y prolificidad en hembras porcinas. Se utilizaron dos dosis de IA (4,5 x 10 elevado a 9 y 3,0 por 10 elevado a 9 espermatozoides) y dos protocolos de inseminación (cerdas adultas y chanchillas), midiendo los efectos sobre fertilidad (número de cerdas paridas/cerdas inseminadas x 100) sobre la prolificidad en relación a los tamaños de camada nacidos total (TCNT) y tamaños de camada nacidos vivos (TCNV); y el efecto de las dosis en función del número ordinal de parto (NOP). El estudio se llevó a cabo en un criadero de tipo industrial de la zona central de Chile que cuenta con 500 hembras reproductoras. Los resultados arrojaron que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre las dosis analizadas sobre la tasa de fertilidad (p>0,05), tasa de fertilidad según protocolo de inseminación (p>0,05) y fertilidad en función del NOP (p>0,05). Similar situación se observó para la prolificidad respecto al promedio de TCNT y TCNV (p>0,05), TCNT y TCNV según protocolo de inseminación (p>0,05), y finalmente, TCNT y TCNV según NOP (p>0,05)

Se emplearon 32 muestras de semen procedentes de cuatro ovinos a fin de ser criopreservadas adicionándoles dos antioxidantes:Tempo (2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) y Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil), cada uno en concentración de 0.5, 1.0 y 2.5 mM. La finalidad del trabajo fue evaluar el efecto postdescongelamiento que pudiera tener sobre la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, y la capacitación espermática prematura. Para cada concentración de cada antioxidante y para el grupo control, se utilizó un dilutor en base a Tris, realizándose 8 repeticiones, cada una con 4 muestras de semen. Los resultados obtenidos demuestran que la adición de Tempo a una concentración de 0.5 mM mejora significativamente la calidad del semen criopreservado en comparación con el grupo control, incrementado los porcentajes de motilidad progresiva (79 vs. 67 %), viabilidad e integridad acrosomal (70 vs. 58 %) y reduciendo la capacitación espermática prematura (9 vs. 15 %). Sin embargo, la adición de Tempol disminuyó la calidad seminal post descongelamiento en comparación con el control. Consecuentemente, el efecto de las especies reactivas de oxígeno sobre la calidad seminal puede ser reducido por la adición de Tempo 0.5 mM durante el enfriamiento. En conclusión la adición de Tempo 0.5 mM en un dilutor en base a Tris, al finalizar la fase de enfriamiento, podría constituir una estrategia para mejorar la calidad de semen ovino criopreservado y por lo tanto aumentar los porcentajes de fertilidad en la inseminación artificial en ovejas. / Trirty-two semen samples coming from 4 rams were frozed using 2 antioxidants, Tempo (2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl) and Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl), each one in concentrations of 0.5, 1.0, and 2.5 mM, with the objective of evaluate their effects on post-thaw motility, viability, acrosomal integrity, and earlier sperm capacitation. It were realized 8 replication for each antioxidant concentrantion and control group, using 4 semen samples in each replication. Semen samples were diluted on a Tris extender. Results show that Tempo 0.5 mM improve frozen semen quality (P is less than 0.05) in comparison with control group, by increasing percentages of progresive motility (79 vs. 67 %), viability and acrosomal integrity (70 vs. 58 %), and decreasing earlier sperm capacitation (9 vs. 15 %). However, when Tempol was used, it was observed a decrease in frozed semen quality in comparison with control group. Consequently, the adverse effect of reactive oxygen species on semen quality could be reduced by the addition of Tempo 0.5 mM during the cooling process. In conclusion, the use of Tempo 0.5 mM on a Tris extender, at the end of the cooling process could be an alternative for improving the quality of frozed ram semen, and in this way, improve the fertility in artificial insemination in ewes.

Se emplearon 32 muestras de semen procedentes de cuatro ovinos a fin de ser criopreservadas adicionándoles dos antioxidantes:Tempo (2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) y Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil), cada uno en concentración de 0.5, 1.0 y 2.5 mM. La finalidad del trabajo fue evaluar el efecto postdescongelamiento que pudiera tener sobre la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, y la capacitación espermática prematura. Para cada concentración de cada antioxidante y para el grupo control, se utilizó un dilutor en base a Tris, realizándose 8 repeticiones, cada una con 4 muestras de semen. Los resultados obtenidos demuestran que la adición de Tempo a una concentración de 0.5 mM mejora significativamente la calidad del semen criopreservado en comparación con el grupo control, incrementado los porcentajes de motilidad progresiva (79 vs. 67 %), viabilidad e integridad acrosomal (70 vs. 58 %) y reduciendo la capacitación espermática prematura (9 vs. 15 %). Sin embargo, la adición de Tempol disminuyó la calidad seminal post descongelamiento en comparación con el control. Consecuentemente, el efecto de las especies reactivas de oxígeno sobre la calidad seminal puede ser reducido por la adición de Tempo 0.5 mM durante el enfriamiento. En conclusión la adición de Tempo 0.5 mM en un dilutor en base a Tris, al finalizar la fase de enfriamiento, podría constituir una estrategia para mejorar la calidad de semen ovino criopreservado y por lo tanto aumentar los porcentajes de fertilidad en la inseminación artificial en ovejas. / --- Trirty-two semen samples coming from 4 rams were frozed using 2 antioxidants, Tempo (2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl) and Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl), each one in concentrations of 0.5, 1.0, and 2.5 mM, with the objective of evaluate their effects on post-thaw motility, viability, acrosomal integrity, and earlier sperm capacitation. It were realized 8 replication for each antioxidant concentrantion and control group, using 4 semen samples in each replication. Semen samples were diluted on a Tris extender. Results show that Tempo 0.5 mM improve frozen semen quality (P is less than 0.05) in comparison with control group, by increasing percentages of progresive motility (79 vs. 67 %), viability and acrosomal integrity (70 vs. 58 %), and decreasing earlier sperm capacitation (9 vs. 15 %). However, when Tempol was used, it was observed a decrease in frozed semen quality in comparison with control group. Consequently, the adverse effect of reactive oxygen species on semen quality could be reduced by the addition of Tempo 0.5 mM during the cooling process. In conclusion, the use of Tempo 0.5 mM on a Tris extender, at the end of the cooling process could be an alternative for improving the quality of frozed ram semen, and in this way, improve the fertility in artificial insemination in ewes. / Tesis

El presente estudio fue realizado para determinar la tasa de concepción de alpacas inseminadas con semen fresco e inducidas a ovulación con plasma seminal o un análogo de GnRH (Acetato de buserelina). El estudio se realizó entre los meses de enero a abril del 2009. En un primer experimento, se seleccionaron 64 alpacas hembras con cría al pie, en base al criterio de la presencia de un folículo dominante ≥ de 7 mm detectado por ecografía transrectal. Los animales seleccionados fueron alimentados con pastura natural y recibieron las mismas condiciones de manejo; siendo distribuidas al azar a uno de los 2 tratamientos: G1 (n=32) administración intramuscular de 2 ml de plasma seminal y G2 (n=32) administración intramuscular de 1 ml de un análogo de GnRH (0.0042 mg de acetato de buserelina). Después de 27 horas de la aplicación de los tratamientos, se realizó la inseminación artificial a dosis de 1 ml de semen fresco diluido con una concentración espermática promedio de 130 x 106 / ml y una motilidad espermática ≥ 65%. Las alpacas fueron evaluadas mediante ecografía transrectal el día 2 post tratamiento para determinar la tasa de ovulación y el día 25 para determinar gestación. En el segundo experimento, fueron seleccionadas 10 alpacas con folículos ≥ 7 mm, a las cuales se les administró vía IM 2 ml de plasma seminal (n=5) o 1 ml de un análogo de GnRH (n=5). Al octavo día post aplicación se realizaron ecografías para medir el diámetro del cuerpo lúteo. Los resultados del experimento 1 indican una tasa de ovulación de 100 % para el grupo de plasma seminal y 90.6 % para el grupo de GnRH y tasa de gestación al día 25 del 75 y 53.1 % para los grupos G1 y G2, respectivamente (p<0.05). En el experimento 2, el tamaño del cuerpo lúteo de alpacas inducidas a ovulación con plasma seminal fue de 15.2 ± 1.1 mm y con GnRH fue de 12.6 ± 2.1 mm. Los resultados del estudio sugieren que la administración de plasma seminal en alpacas induce un 100 % de ovulación en alpacas y mejoran la tasa de concepción de los animales inseminados, por un mejor efecto luteotrópico en la formación del cuerpo lúteo. -- Palabras claves: Alpacas, plasma seminal, ovulación inducida, inseminación artificial, gestación. / -- This study was carried out to evaluate the pregnancy rate in alpacas inseminated with fresh semen and that were induced to ovulation with seminal plasma or a GnRH analogue (Acetate of buserelin). The study was developed from January to April in 2009. In experiment, sixty four alpacas with breeding were selected based on the criterion of the presence of follicle ≥ 7 mm by ultrasound. Animals were fed with natural pasture and they received the same handling conditions, they were distributed at random one of the two treatments: G1 (n=32) 2 ml of seminal plasma by intramuscular injection or G2 (n=32) 1 ml of GnRH (0.0042 Acetate of buserelin). After 27 hours of application of treatments, artificial insemination was performed at a dose of 1 ml of fresh dilutedsemen with a mean sperm concentration of 130 x 106 / ml and sperm motility ≥ 65%. Alpacas were evaluated by ultrasound at Day 2 post treatment to determinate rate ovulation and at Day 25 were evaluated to diagnose pregnancy. In experiment 2, were selected 10 alpacas with follicles ≥ 7 mm, which were administered intramuscularly 2 ml of seminal plasma (n=5) or 1 ml of a GnRH analogue (n=5). At 8 day post application, ultrasounds were performed to measure the diameter of the corpus luteum. Results of experiment 1 point out a rate ovulation of 100% for the seminal plasma group and 90.6% for the GnRH and pregnancy rate at day 25 were 75.0% and 53.1% for groups G1 y G2, respectively (p<0.05). In experiment 2, the size of the corpus luteum in alpacas induced to ovulation with seminal plasma 15.2 ± 1.1 mm and GnRH was 12.6 ± 2.1 mm. Results of present study suggest that administration of seminal plasma induce 100 % ovulation in alpacas and improve a pregnancy rate in inseminated animals for a better luteotropic effect in the formation of corpus luteum. -- Key words: Alpacas, seminal plasma, ovulation induced, artificial insemination, pregnancy.

El presente estudio se realizó para evaluar el efecto de cuatro suplementos de macromoléculas sobre la tasa de maduración nuclear, así como también determinar la tasa división de ovocitos y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas (7 días), respectivamente. Los ovarios fueron obtenidos de animales sacrificados, transportándose al laboratorio en un termo conteniendo solución salina al 0.09%, suplementada con antibiótico-antimicótico a 37 °C. Los CCO´s se obtuvieron de la aspiración de folículos de entre 2-6mm; luego de ser observados en un estéreomicroscopio, 692 ovocitos con dos o más capas de células fueron calificados como aptos para ser madurados en medio TCM-99 enriquecido con suplemento de macromolécula: PVP o PVA o BSA o SFB según sea el tratamiento; cultivados a 39°C bajo una atmósfera de 5% de CO2. Cumplido el tiempo de maduración (24 horas), los ovocitos fueron removidos del medio y lavados con PBS suplementado con SFB y 1 mg/ml de hialuronidasa, para ser fijados en una solución de etanol: ácido acético (3:1). Para la evaluación de la maduración nuclear, se colocaron los ovocitos en una lámina portaobjeto y teñidos con 1% de orceína; las mismas fueron observadas bajo un microscopio para ser evaluadas y clasificadas como Vesícula Germinal (VG), Metafase I (MI), Anafase-Telofase, Metafase II (MII) y degenerados. Para la fecundación se usaron 1680 ovocitos, madurados bajo las mismas condiciones y fecundados con espermatozoides obtenidos de pajillas. Para la obtención de los espermatozoides motiles se centrifugo a 300 gravedades durante 10 minutos bajo una gradiente de Percoll (45/90); el sobrenadante fue retirado y el pellet obtenido retirado para ser reconstituido con TL-STOCK. Los ovocitos maduros y espermatozoides fueron co-cultivados durante 18 horas a 39°C con 5% de CO2 en medio de cultivo KSOM-AA; luego de 48 horas las células cocultivadas fueron trasladadas al medio de cultivo SOF. En el experimento 1, en los ovocitos que alcanzaron la maduración nuclear (Metafase II) se encontró diferencia significativa solo entre los suplementos de macromolécula PVA y SFB con 19.3 + 1.8 y 16.3 + 0.8, respectivamente; mientras que en los grupos PVP, PVA, BSA y PVP, BSA, SFB, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. En el experimento 2, la tasa de división y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. Estos resultados indican que los suplementos de macromoléculas proporcionan condiciones y requerimientos importantes para la progresión desde estadios de metafase I a metafase II. Palabras claves: Maduración In vitro, ovocitos bovinos, fecundación In vitro. / --- The present study was made to evaluate the effect of four macromolecule supplements on the rate of nuclear maturation, as well as to determine the rate division of oocytes and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours (7 days), respectively. The ovaries were obtained from sacrificed animals, being transported to the laboratory in a thermos flask containing saline solution to the 0,09%, with antibioticantimycotic at 37 °C. The CCO´s was obtained from the aspiration of follicles of between 2-6mm; after being observed in stereomicroscope, 692 oocytes with two or more layers of cells were described like apt being in the middle matured TCM-99 enriched with macro-molecule supplement: PVP or PVA or BSA or SFB according to are the treatment; cultivated at 39°C under an atmosphere of 5% of CO2. Turned the time of maturation (24 hours), the oocytes were removed of means and washings with PBS supplemented with SFB and 1 mg/ml of hyaluronidase, to be fixed to an ethanol solution: acetic acid (3: 1). For the evaluation of the nuclear maturation, the oocytes on the slide and dyeings with 1% of orceína were placed; the same ones were observed under a microscope to be evaluated and to be classified like germinal vesicle (VG), metaphase I (MI), anaphase-telophase, metaphase II (MII) and degenerated. For the fertilization 1680 oocytes, matured under the same conditions and fertilized were used with obtained spermatozoa of tubules contained it.. For the obtaining of the motile spermatozoa by centrifuge myself to 300 gravities during 10 minutes under a gradient of Percoll (45/90); the supernatant was retired and pellet obtained retired to be reconstituted with TL-STOCK. The mature oocytes and spermatozoa Co-were cultivated during 18 hours to 39°C with 5% of CO2 in the middle of culture KSOM-AA; after 48 hours the Co-cultivated cells were transferred to means of culture SOF. In experiment 1, in the oocytes that reached the nuclear maturation (Metaphase II) was single significant difference between the macromolecule supplements PVA and SFB with 19.3 + 1.8 and 16.3 + 0.8, respectively; whereas in groups PVP, PVA, BSA and PVP, BSA, SFB, respectively was not significant statistical difference. In experiment 2, the rate of division and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours, respectively was not significant statistical difference. These results indicate that the macromolecule supplements they provide conditions and important requirements for the progression from stages of metaphase I to metaphase II. Key words: In vitro Maturation, oocytes bovine, In vitro fertilization.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Dentro de las biotecnologías reproductivas, la criopreservación de espermatozoides presenta grandes ventajas, sin embargo, involucra cambios en el espermatozoide, tanto estructurales como funcionales, que alterarían eventos fisiológicos asociados a la fecundación, como la capacitación y reacción acrosómica. Esto puede significar cambios en la activación y liberación del sistema proacrosina/acrosina, involucrada en los primeros eventos de interacción ovocito-espermatozoide, por tanto, el objetivo de este trabajo, fue evaluar el sistema proacrosina/acrosina mediante western blot en espermatozoides congelados de perro, en comparación con aquellos frescos, durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se recolectaron 6 eyaculados, de tres perros sanos, a través de estimulación digital. Se utilizó la fracción espermática de cada eyaculado tanto para los controles (frescos) y los congelados. Las muestras procesadas como frescas fueron resuspendidas luego de una centrifugación en medio Fert-Talp y los espermatozoides que se sometieron a congelación se resuspendieron en diluyente en base a fructosa, TRIS, 20% de yema de huevo, ácido cítrico y 5% de glicerol y fueron posteriormente congelados a -196ºC en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 60º C durante 8 segundos en agua. Las muestras se centrifugaron y el pellet de espermatozoides se diluyó en medio Fert-Talp dejándose en incubación en el mismo medio para capacitación durante 0, 30, 60 y 90 minutos. Posteriormente las muestras fueron sometidas a extracción de proteínas espermáticas a las cuales se les adicionó buffer de carga 4X para ser separadas mediante electroforesis y luego detectadas a través de western blot utilizando el anticuerpo C5F10 (anticuerpo de ratón antiacrosina humana). Una vez obtenidas las bandas de proacrosina y acrosina ( y β) se evaluó la densidad óptica de cada una de ellas con el programa PhotoShop 8.0. Los resultados obtenidos fueron analizados a través del análisis de varianza y prueba de Tukey. Los resultados mostraron la presencia del zimógeno proacrosina y las subunidades de la enzima activa ( y β acrosina) en los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos y congelados. En cada uno de los tiempos de capacitación se encontró mayor densidad óptica de proacrosina (P<0,05) en las muestras frescas lo cual indica una mayor cantidad del zimógeno. En la enzima activa -acrosina de las muestras congeladas, hubo diferencias (P<0,05), siendo mayor la densidad óptica a los 30 minutos de capacitación en comparación con los otros tiempos de capacitación. Se encontró mayor reactividad de -acrosina en las muestras congeladas a los 0 y 30 minutos en comparación con las muestras frescas. En β-acrosina se encontró en las muestras congeladas una mayor densidad óptica a los 0 minutos la que disminuyó hasta los 90 minutos de capacitación. Al analizar β -acrosina en cada uno de los tiempos de capacitación entre congelados y frescos se encontraron diferencias significativas (P< 0.05) a los 0, 30, 60 y 90 minutos de capacitación siendo mayor en las muestras congeladas. En conclusión los espermatozoides congelados presentan mayor activación del zimógeno al comparar con los frescos, la cual va disminuyendo en la medida que el tiempo de capacitación es mayor / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La inseminación artificial con espermatozoides refrigerados es empleada en varias especies animales incluidos los perros, sin embargo, aunque en menor grado que la congelación, la refrigeración tiene efectos detrimentales sobre el espermatozoide pudiendo afectar procesos como la capacitación espermática y reacción acrosómica, donde se libera el sistema enzimático proacrosina/acrosina. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante Western Blot en espermatozoides de perro sometidos a refrigeración, la reactividad del sistema proacrosina/acrosina durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se utilizaron 7 eyaculados de 3 perros adultos. En cada muestra se evaluó la concentración espermática y la motilidad progresiva. Los espermatozoides de cada eyaculado fueron procesados como muestras frescas y refrigeradas. Los espermatozoides frescos fueron resuspendidos en medio Fert Talp en cantidad suficiente para lograr una concentración de 5 x 106 espermatozoides/mL y los que se refrigeraron, se resuspendieron en diluyente en base a TRIS en proporción 2:1 (TRIS-semen), yema de huevo, ácido cítrico, fructosa y antibióticos, en cantidad suficiente para lograr una concentración de 200 x 106 espermatozoides/mL, manteniéndolos a 4 ºC por 24 horas. Tanto los espermatozoides frescos (control) como los refrigerados/entibiados, se incubaron en medio de cultivo Fert Talp por periodos de 0 a 3 h para inducir la capacitación espermática. Posterior a cada tiempo de incubación los espermatozoides fueron sometidos a extracción proteica, las que fueron separadas utilizando electroforesis. Luego, a través de Western Blot, las proteínas en estudio se incubaron con el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10, en donde se observaron bandas correspondientes a proacrosina y las formas activas -acrosina y β-acrosina en cada tiempo de capacitación espermática en los espermatozoides caninos frescos y en los refrigerados. La densidad óptica de las bandas se analizó mediante análisis de varianza y posterior prueba de Tukey. Los resultados en espermatozoides frescos mostraron que tanto proacrosina como la forma activa -acrosina no cambiaron en forma significativa durante los diferentes tiempos de incubación, sin embargo, β-acrosina presentó una mayor actividad a partir de la 2 h de incubación (p < 0,05). En espermatozoides refrigerados, la reactividad con el anticuerpo, de proacrosina como tampoco las de sus formas activas  y β, mostró diferencias significativas durante los diferentes periodos. Sin embargo, al comparar la reactividad presentada por proacrosina,  y β-acrosina entre espermatozoides frescos y aquellos sometidos a refrigeración, proacrosina no presentó diferencias significativas entre ambos tratamientos. Se obtuvieron valores mayores (p  0,05) de densidad óptica de -acrosina en espermatozoides refrigerados, a partir de las 3 horas de incubación. En relación a β-acrosina, se pudo observar una mayor reactividad de esta molécula con el anticuerpo al inicio del período de capacitación, en espermatozoides refrigerados en comparación a los frescos. A partir de la segunda hora de capacitación in vitro, no se observaron diferencias significativas en la detección de - acrosina entre estos tipos de espermatozoides. En conclusión, los espermatozoides caninos refrigerados, presentaron una activación más temprana de proacrosina hacia su forma activa β-acrosina, en comparación con los espermatozoides caninos frescos, durante la incubación para capacitación a que fueron sometidos / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1060602-1080618

El documento digital no refiere asesor / Evalúa el efecto del tiempo de incubación sobre la maduración nuclear y determinar la tasa de división de ovocitos madurados y fecundados a las 72 horas post fecundación. Complejos Cumulos–Ovocitos (CCOs) fueron obtenidos de ovarios procedentes de animales sacrificados y transportados al laboratorio en un termo conteniendo solución salina 0.9% suplementada con antibiótico antimicótico a 35°C. CCOs fueron aspirados de folículos = 6mm. Previo a la evaluación en un estéreomicroscopio, 502 ovocitos fueron distribuidos en los 4 tiempos de Maduración: 30, 34, 38 y 42 horas, 533 ovocitos fueron cultivados y fecundados después de ser madurados a las 30, 34, 38 y 42 horas. CCOs con dos o más capas de células fueron madurados en medio TCM-199 suplementado con 10% SFB, 0.5µg/mL de FSH, 10µg/mL de hCG, 0.2mM de Piruvato de sodio, 50µg/mL de gentamicina y 1µg/mL de estradiol, colocado en aceite mineral y cultivados a 39ºC bajo una atmosfera de 5 % de CO2 y alta humedad. Después del tiempo de maduración, los ovocitos fueron removidos del medio y lavados con PBS suplementado con 10% de SFB y 1mg/ml de hialuronidasa y fijados en una solución de etanol: acido acético (3:1). Ovocitos fueron colocados en una lámina y teñidos con 1% de orceína. Las láminas fueron examinadas bajo un microscopio de contraste de fases a 400X para evaluar el estado de maduración nuclear y clasificarlos como Metafase I (MI), Vesícula Germinal (VG), Anafase – telofase, Metafase II (MII) y degenerados. Para la fecundación, ovocitos fueron madurados bajo las mismas condiciones y fecundados con espermatozoides obtenidos de testículos procedentes de centros de sacrificio. Espermatozoides motiles fueron obtenidos por centrifugación a 700g bajo una gradiente de Percoll discontinua (22.5:45%) por 25 minutos. El sobrenadante fue removido y el pellet reconstituido con TLStock. Espermatozoides y ovocitos madurados fueron co-cultivados por 18 – 20 horas a 39ºC con 5% de CO2 en medio de cultivo KSOM suplementado con 10% de SF, 2mM de piruvato de sodio y 50µg/mL gentamicina y evaluados a las 72 horas. En el experimento 1, la proporción de ovocitos que alcanzaron el estadío de M-II fueron 26.3; 53.6; 62.6 y 74.4 % para las 30, 34, 38 y 42 horas de cultivo respectivamente, con diferencia estadística entre los G-I y II respecto al GIII y C-IV (p<0.05). En el experimento 2, las tasas de división fueron 9.5; 7.7; 15.4 y 19.2 para 30, 34, 38 y 42 horas de maduración después de 72 horas de cultivo. Estos resultados indican que es necesario de 38 a más horas de maduración In vitro de ovocitos de alpaca. Los resultados indican que se requiere de 38 a más horas para la maduración y fecundación In vitro de ovocitos de alpaca. / Tesis