Made available in DSpace on 2015-10-21T12:19:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 gabriela_garcia_ioc_mest_2012.pdf: 5953983 bytes, checksum: 9330fc410b9489226898cb3a6791b904 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A utilização de inseticidas neurotóxicos contra insetos vetores ainda tem um papel crucial nos programas de controle de doenças. No Brasil é uma estratégia importante no controle do vetor da dengue, o Aedes aegypti. O principal larvicida utilizado para este fim em ca mpo tem sido o organofosforado (OP) temephos, desde 1967, com utilização intensificada a partir da epidemia de 1986. Em função do diagnóstico de resistência em diversas populações brasileiras a este OP, atualmente se encontra em andamento a substituição pelo inibidor de síntese de quitina (ISQ) diflubenzuron. Para o controle da fase adulta dos mosquitos, os inseticidas mais utilizados atualmente pertencem à classe dos piretróides (PI). Contamos no país com a Rede Nacional de Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti a Inseticidas (MoReNAa), com metodologias consolidadas para a avaliação da resistência e de seus mecanismos em populações do vetor de dengue. No presente estudo, essas metodologias foram empregadas para avaliar ao longo de um ano, em quatro localidades do Brasil, de quatro regiões distintas, a resistência aos inseticidas citados anteriormente. Identificamos alterações de susceptibilidade ao larvicida temephos em todas as populações participantes do estudo; entretanto, observamos, em todos os casos, tendência de queda da razão de resistência ao longo do estudo, que atribuímos à interrupção do uso deste composto em campo Em relação ao outro larvicida investigado, o diflubenzuron, foram constatadas razões de resistência baixas para todas as populações, em todos os momentos, provavelmente em função da sua recente incorporação no âmbito do controle químico no país. Ressaltamos no entanto a importância de avaliações deste ISQ mediante simulados de campo para uma melhor compreensão sobre o significado funcional das razões de resistência encontradas neste estudo, e seu impacto no controle efetuado em campo no país. Já para o adulticida investigado, a deltametrina (PI), observamos uma resistência disseminada no país, sendo extremamente elevada em três das quatro populações estudadas. Os resultados indicam uso público indiscriminado de inseticidas em uma das localidades e sugerem correlação entre a resistência a PI e a utilização doméstica deste inseticida, o que chama atenção para a necessidade de adoção de medidas de conscientização do uso deste tipo de ferramenta pela sociedade. Após a quantificação da resistência a estes três inseticidas, partimos para a investigação dos mecanismos responsáveis, analisando a resistência metabólica \2013 derivada de alterações nas atividades de enzimas que detoxificam estes compostos \2013 por meio de ensaios bioquímicos e a resistência por alteração no sítio alvo \2013 derivada de modificações estruturais nas moléculas alvo dos inseticidas - por meio de ensaios bioquímicos e moleculares Foram diagnosticadas principalmente alterações na atividade de duas enzimas na fase adulta das quatro populações, GST e PNPA. Estas enzimas já haviam sido relacionadas à resistência a PI anteriormente. Na fase de larvas, não foi possível estabelecer qualquer correlação diagnóstica com a resistência a temephos ou diflubenzuron: alterações na atividade das enzimas variaram entre as populações estudadas. De maneira geral, verificamos tendência de queda na atividade de PNPA em Duque de Caxias, de MFO em Parnamirim e das Esterases ALFA e BETA em Campo Grande . Em relação aos ensaios moleculares, diagnosticamos três diferentes mutações no canal de sódio das populações avaliadas (nas posições 1011, 1016, 1534). Destas, duas mutações (1016 e 1534) foram correlacionadas com a elevada resistência a PIs neste estudo. Este trabalho possibilitou uma melhor compreensão sobre a dinâmica da resistência a inseticidas no país. Esperamos, desta forma, contribuir para o manejo do controle químico de Ae. aegypti, auxiliando a recomendação de inseticidas, tanto para larvas quanto para adultos, de uma forma eficiente e racional / The utilization of neurotoxic insecticides against insect vectors has a crucial role in disease control programs. In Bra zil it is an important strategy against the dengue vector, Aedes aegypti . Since 1967 the main larvicide used in the field has been the organophosphate (OP) temephos, with a strong utilization after the dengue epidemy in 1986. Due to OP resistance of seve ral Brazilian vector populations, nowadays it’s substitution by the chitin synthesis inhibitor (CSI) diflubenzuron is in progress. Pyrethroids (PI) are the most widely used insecticides in the control of adult mosquitoes. In Brazil the National Network f or Aedes aegypti Insecticide Resistance Monitoring (MoReNAa) relies on consolidated methodologies for assessing resistance and the underlying its mechanisms in populations of the dengue vector. In the present study, we employed these methodologies to eval uate resistance to the above mentioned insecticides of four municipalities, belonging to four Brazilian regions , during one year. We identified changes in the susceptibility levels to the larvicide temephos in all populations considered in the study. How ever , there was a tendency of temephos resistance ratio decrease throughout the period of evaluation, probably due to the interruption of the use of this compound in the field. Diflubenzuron, the other larvicide investigated, elicited low resistance ratio s in all populations considered, and this was attributed to its recent incorporation as a chemical control tool in the country. However, we emphasize the importance of field simulated assays with this CSI in order to better understand the significance of the resistance values found and their impact on vector control. For the adulticide investigated, deltamethrin (PI), we observed widespread resistance all over the country . Resistance levels were particularly high in three out of the four investigated pop ulations. Our results point to an indiscriminate public use of PI in one municipality and suggest correlation between PI resistance and the intense domestic use of this class of insecticides. This calls attention to the need of adopting measures to raise society awareness to the limitations of this kind of tools. After resistance quantification to these three insecticides, we investigated the mechanisms potentially involved by analyzing both metabolic resistance - derived from changes in the activity of detoxifying enzymes - and resistance by altered target site - derived from structural modifications in the insecticide target molecules. Biochemical and molecular assays were employed. GST and PNPA were the main enzymes altered, and this was observed in adult specimens of all populations. These enzymes have been previously associated with PI resistance. In the larval stage, no diagnostic correlation between enzymes activity and temephos or diflubenzuron resistance could be established , enzymatic alterat ions varying among the evaluated populations . In general, we detected tendency of decrease in the PNPA activity at Duque de Caixas, MFO at Parnamirin and ALFA and BETA Esterases at Campo Grande. Regarding the molecular assays, it was possible to identify three different mutations in the sodium channel, the PI target site (at positions 1011, 1016 and 1534). Of these, two mutations (1016 and 1534) were correlated to high resistance levels to PIs. This study contributed to a better understanding of the dyn amics of insecticide resistance in Brazil. We expect to have been contributed to the management of Ae. aegypti chemical control, support ing the recommendation of efficient and rational usage of insecticides for both larvae and adults

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Os agrotóxicos são substâncias usadas para exterminar pragas ou doenças que causam danos às plantações. Os organofosforados são agrotóxicos responsáveis por 70 por cento das intoxicações ocupacionais e atuam inibindo a enzima acetilcolinesterase por meio da fosforilação do aminoácido serina do sítio ativo. Existem diversos métodos de diagnóstico para monitorar a exposição a estes compostos, tais como: identificação e análise quantitativa de compostos livres noplasma; identificação e análise quantitativa de metabólitos na urina; determinação da atividade de colinesterases no plasma ou no sangue total. Entretanto, estas metodologias possuem algumas limitações, como por exemplo, a falta de especificidade, tecnologias de análise caras e variações interindividuais (sexo, idade, etc.). Uma tentativa de contornar estas limitações na quantificação da atividade de colinesterases é o desenvolvimento de metodologias baseadas na detecção da enzima fosforilada através de técnicas imunoquímicas. Este estudo teve como objetivo desenvolver um método de imunoensaio para o diagnóstico rápido da exposição humana aos organofosforados pela detecção deacetilcolinesterase inibida no sangue humano por anticorpos aviários produzidos contra uma sequência de aminoácidos ao redor da serina fosforilada do centro catalítico da enzima. Para isto, foram adquiridos dois decapeptídeos sintéticos correspondentes ao sítio catalítico "não fosforilado" (SOH) e outro com o resíduode serina fosforilado (SOP). Estes peptídeos foram conjugados com albumina bovina de soro (BSA), injetados em galinhas poedeiras da raça Isa-Brown e anticorpos IgY foram obtidas das gemas dos ovos das galinhas imunizadas. A especificidade dos anticorpos IgY anti-SOH e anti-SOP foi testada por meio de métodos ELISA constatando-se que estes anticorpos reconhecem os peptídeos livres, os peptídeos conjugados com BSA e a própria BSA. Além disso, ocorreu uma significativa reação cruzada, ou seja, os anticorpos IgY anti-SOH e anti-SOP não conseguiram diferenciar os peptídeo SOH e SOP. Estes resultados não permitem a indicação destes anticorpos para o desenvolvimento de métodos para diagnóstico de intoxicação. / Pesticides are chemical substances used to control plagues and diseases in plantations. Organophosphates are the pesticides involved in 70% of the occupational intoxications and act inhibiting the enzyme acetylcholinesterase by phosphorylation of the serine residue of catalytic centre. There are several methods for monitoring the exposition to these compounds, as so: identification and assay the free compounds into plasma; identification and assay metabolites into urine; cholinesterases assay into plasma or blood. However, these methods have some limitations, as for example lack of specificity, expensive analytical technologies and inter-individual variety (sex, age, etc.). One way to outline these limitations on cholinesterase assay is the development of methods based on phospho-enzyme detection by imunochemical techniques. This study have had the objective to developing an imuno-assay method for rapid diagnosis of human exposition to organophosphorus compounds by imuno-detection of inhibited acetylcholinesterase using aviary antibodies produced against a peptide sequence of the catalytic centre around phospho-serine residue. Two synthetic decapeptides were bought: one with the sequence of "not-phosphorylated" catalytic centre (SOH) and another with a serine-phosphorylated residue. These peptides were conjugated with bovine serum albumin (BSA), injected into Isa-Brown hens and antibodies IgY were isolated from egg yolk of immunized hens. The specificity of IgY anti-SOH and anti-SOP was tested using ELISA methods showing that these antibodies recognize free peptides, conjugated peptides and BSA. In addition, there was a significant cross reaction, or in other words, the antibodies IgY anti- SOH and anti-SOP failed on differentiate the peptide SOH and SOP. These results do not allow the indication of these antibodies for developing methods for intoxication diagnosis.

Um método analítico constituído por extração em fase sólida molecularmente impressa (MISPE) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) foi desenvolvido para análise de metabólitos dialquil fosfatos (dietil tiosfato - DETP e dietil ditiosfato - DEDTP) em amostras de urina. Um polímero de impressão molecular (MIP) foi sintetizado utilizando-se 4-vinilpiridina como monômero funcional e etileno glicol dimetacrilato como reagente de ligação cruzada. A etapa de condicionamento foi realizada da seguinte forma: 3 mL de acetonitrila, 3 mL de tampão fosfato dibásico 0,1 mol L-1, pH 11,0 e 2 mL de água foram percolados por um cartucho de polipropileno contendo o MIP. A etapa de extração foi executada utilizando 1,0 mL de amostra de urina com pH previamente ajustado para 3,0. Finalmente, os analitos foram eluídos com 3 mL de acetonitrila e derivatizados com uma solução de  2,3,4,5,6-brometo de  pentafluorobenzil a 3% em acetonitrila, a temperatura ambiente durante 1h. A amostra foi analisada por GC-MS. Curvas de calibração analítica para DETP e DEDTP foram construídas utilizando-se uma mistura de urina de diferentes indivíduos voluntários e em seis níveis de concentração. O método foi linear na faixa de  10-500 µg L-1, com r = 0,99 e limite de detecção de 3,0 µg L-1, para ambos os analitos. A precisão intra-dias e inter-dias foram avaliadas com base na porcentagem de desvio padrão relativo (%RSD) e todos os resultados foram inferiores a 15% para ambos os analitos. O método foi preciso, exato, com boa recuperação e robustez. Posteriormente o método foi utilizado para determinar as concentrações de DETP e DEDTP em amostras de urina de ratos expostos a dissulfoton. Além da concentração de dialquil fosfatos, foram determinadas a atividade de colinesterase sanguínea e a incidência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos destes mesmos animais, a fim de se estabelecer uma relação entre a dose de exposição ao dissulfon e os parâmetros avaliados. Observou-se que a atividade de colinesterase plasmática não reflete muito bem a correlação entre a dose de exposição e efeito, ao contrário da colinesterase eritrocitária. A concentração de dialquil fosfatos refletiu uma boa correlação com a dose de exposição. Através da frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos, foi possível observar que, a semelhança de outros praguicidas organofosforados (OF), o dissulfoton é capaz de causar mutagenicidade. / An analytical method constituted by molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) was developed for analyses of benzene metabolites (diethyl thiophosphate - DETP and diethyl dithiophosphate - DEDTP) in human urine samples. A molecularly imprinted polymer (MIP) for DETP was synthesized using 4-vinylpiridine as functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as cross linker. The conditioning step of the MISPE was processed flowing though the MIP cartridge 3 mL of acetonitrile, 3 mL of dibasic phosphate buffer 0.1 mol L−1 pH 11 and 2 mL of water. The extraction step was executed using 1.0 mL of urine sample with pH previously adjusted to 3.0. Finally, the analytes were eluted with 3 mL of acetonitrile and derivatized with 2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl bromide 3% at room temperature during 1h. The sample was analyzed by GC-MS. Analytical calibration curves for DETP and DEDTP were constructed using a pool of urine sample and for six levels of concentration. The method was linear from 10 to 500 μg L−1, with r = 0.99 and limit of detection of 3.0 μg L−1, for both analytes. The within-day and between-day precisions were evaluated (as percentage of RSD) and all results were < 15% for both analytes. The method was accurate, with good recovery and robustness. Later this method was used to determine the concentrations of DETP and DEDTP in urine samples of rats exposed to disulfoton. Besides the concentration of dialkyl phosphates, it was determined blood cholinesterase activity and the incidence of micronucleated polychromatic erythrocytes in the same animals, in order to establish a relationship between the dose of exposure and the evaluated parameters. It was observed that the plasma cholinesterase activity did not reflect very well the correlation between exposure dose and effect, unlike the erythrocyte cholinesterases. The concentration of dialkyl phosphates gave a good correlation with exposure dose. By the frequency of micronucleated polychro-matic erythrocytes was possible to observe that, similarly to other organophosphates pesticides (OPs), disulfoton can causes mutagenicity. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-21T12:34:57Z No. of bitstreams: 1 priscila_f_v_medeiros_ioc_bp_0058_2011.pdf: 6129115 bytes, checksum: a9a22a0f84ef8206e0afcbc77535046a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-21T12:34:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 priscila_f_v_medeiros_ioc_bp_0058_2011.pdf: 6129115 bytes, checksum: a9a22a0f84ef8206e0afcbc77535046a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O uso de inseticidas neurotóxicos contra o mosquito Aedes aegypti ainda é um componente importante nos programas de controle de dengue. No Brasil, organofosforados (OP) e piretróides (PI) são usados para o controle de larvas e adultos de A. aegypti, respectivamente, desde 1967 e 2000. O uso frequente destes produtos selecionou populações resistentes do vetor, e motivou o Ministério da Saúde (MS) a coordenar, desde 1999, uma rede nacional de monitoramento da resistência de A. aegypti (MoReNAa), da qual nosso laboratório participa desde o início. A resistência é principalmente derivada de fatores metabólicos (enzimas que detoxificam o inseticida) ou de mutações nos sítios-alvo dos inseticidas, no Sistema Nervoso Central. Bioensaios com larvas revelaram a resistência de várias populações ao OP temephos, larvicida empregado há mais de 40 anos no país. A Rede MoReNAa conta também com bioensaios para adultos, com testes moleculares para avaliação de alteração no alvo de PI, o canal de sódio regulado por voltagem (AaNav) e com ensaios bioquímicos para quantificação, em mosquitos adultos, da atividade enzimática de Glutationa S-Transferases (GST), Esterases e Oxidases de Função Mista (MFO) (relacionadas à resistência metabólica), e de Acetilcolinesterase (Ace) (alvo de OP e carbamatos - CB). Além de serem usadas classes distintas de inseticidas contra larvas e adultos, as aplicações são feitas de maneira diferenciada: em 4-6 ciclos anuais sobre as larvas, e apenas em situações de emergência sobre os mosquitos adultos - procedimento que tem o potencial de elicitar mecanismos (e intensidades) de resistência diferentes. Além disso, bioensaios para quantificação da resistência a OP são feitos com larvas, enquanto os ensaios bioquímicos estavam disponíveis apenas para mosquitos adultos. Estes foram os principais motivos para adaptar, no âmbito desta dissertação, ensaios bioquímicos para o estágio larvar do vetor. Em relação ao ensaio da Ace, que conta com duas reações, uma na presença e a outra na ausência do CB propoxur verificamos, por meio de curvas do tipo dose- resposta, diferenças entre larvas e adultos. Além disto identificamos, em algumas populações do vetor resistentes a OP, alterações na atividade total desta enzima. Uma vez que algumas destas enzimas participam também de processos endógenos, que ocorrem naturalmente nos insetos, quantificamos sua atividade ao longo do desenvolvimento da cepa referência de suscetibilidade, Rockefeller, e de duas populações de campo. Nestes ensaios foram observadas quatro grandes “categorias” de perfis de atividade enzimática: 1) maiores atividades no estágio adulto (AChE); 2) maiores atividades no estágio larval (Esterases “α-EST” e “β-EST”); 3) atividades que aumentam no decorrer de cada estágio avaliado (MFO) e 4) atividades que tendem a aumentar no estágio larvar e a diminuir nos primeiros dias de vida adulta (DVA) (Esterase “ρNPA” e GST). Posteriormente, ensaios bioquímicos com larvas e adultos de populações de campo revelaram alterações de Ace e Esterases preferencialmente no estágio larvar, alterações de GST mais restritas ao estágio adulto, e alteração de MFO nos dois estágios do vetor. Estes ensaios possibilitam conhecer com detalhe os mecanismos de resistência em diferentes populações do vetor e podem contribuir com a definição de estratégias racionais para o controle de A. aegypti. / The use of neurotoxic insecticides against the mosquito Aedes aegypti is still an important component in dengue control programs. In Brazil, organophosphates (OP) and pyrethroids (PI) are used for the control of A. aegypti larvae and adults since, respectively, 1967 and 2000. The frequent use of these products has selected resistant vector populations, and prompted the Ministry of Health (MS) to start the coordination, in 1999, of an Aedes aegypti insecticide resistance monitoring network (MoReNAa); our laboratory participates in the network since its beginning. Resistance is mainly derived from metabolic factors (enzymes detoxifying the insecticides) or from mutations at the target sites of insecticides (in the Central Nervous System). Bioassays with larvae disclosed resistance of various populations to the OP temephos, larvicide employed for over 40 years in the country. MoReNAa network also performs bioassays with adults, molecular tests to assess substitution at the PI target site, the voltage regulated sodium channel (AaNAv), and biochemical assays that quantify, in adult mosquitoes, the activity of Glutathione S-Transferases (GST), Esterases and Mixed Function Oxidases (MFO) (related to metabolic resistance), and of Acetylcholinesterase (Ace) (target of OP and carbamates - CB). Besides using different insecticide classes against larvae and adults, the treatment are performed differently: in 4-6 times per year for larvae and only in emergency situations in the case of adult mosquitoes – a procedure that has the potential to elicit different mechanisms (and intensities) of resistance. Furthermore, bioassays for quantification of resistance to OP are made with larvae, while biochemical assays were available only for adult mosquitoes. These were the main reasons to adapt, in the context of this dissertation, biochemical assays for the larval stage of the vector. Considering the Ace test, consisting of two reactions, in the presence or in the absence of the CB propoxur, we identified - through the use of inhibition curves - differences between larvae and adults. We also detected, in some OP resistant vector populations, changes in the total activity of this enzyme. Since some of the enzymes of metabolic resistance are also involved in endogenous processes, that occur naturally in insects, we quantified their activity during the development of the reference strain of susceptibility, Rockefeller, and of two field populations. In these experiments we observed four major "categories " of enzyme activity profiles: 1) higher activity in the adult stage (AChE); 2) higher activity in the larval stage (“α-EST” and “β- EST” Esterases); 3) activities that increase during each stage evaluated (MFO) and 4) activities tending to increase in the end of the larval stage and to decrease in the first days of adult life (DVA) (Esterase “ρNPA” and GST). Subsequently, biochemical assays with larvae and adults of field populations revealed main changes in Ace and Esterases in the larval stage, GST changes preferably in the adult stage, and MFO alterations on both vector stages. These assays enable the detailed knowledge of resistance mechanisms of different vector populations and can contribute to define rational strategies for A. aegypti control.