Critical illness like sepsis, shock, and intestinal bowel disease are one of the leading causes of morbidity and mortality in the US and around the world. At present, studies to define new therapeutic interventions that can protect tissues and cells against injury and attenuate inflammation are fields of intense investigation. While research over the past decade has clearly identified GLN as a vital stress substrate facilitating cellular survival following injury, the initiation steps in GLN’s cytoprotective molecular mechanism still remain elusive. Previously published work suggested that stabilization of ECM proteins and activation of ECM receptor osmosignaling may play a central role in the orchestration of many cellular pathways following stress. Thus, I hypothesized that preservation of ECM protein and EGFR levels as well as ECM receptor signaling play key roles in the molecular mechanisms underlying GLN’s protection against thermal injury in the intestine. I was able to confirm via Western blotting and by using silencing RNA against FN, Ntn-1, EGFR, and their negative controls, that GLN-mediated preservation of FN, Ntn-1, and EGFR levels is critical in GLN’s protection against hyperthermia in IEC-6 cells. By using a selective FN-Integrin interaction inhibitor GRGDSP, its negative control peptide GRGESP, and Src-kinase inhibitor PP2, I showed that FN-Integrin signaling and Src-kinase activation are essential in GLN-mediated protection in the intestine. This applied to EGFR signaling as demonstrated using the EGFR tyrosine kinase inhibitor AG1478. In addition to GRGDSP and AG1478, ERK1/2 inhibitors PD98059 and UO126 as well as the p38MAPK inhibitor SB203580 revealed that GLN is protective by activating ERK1/2 and dephosphorylating p38MAPK via FN-Integrin and EGFR signaling. However, GLN-mediated PI3-K/Akt/Hsp70 activation seems to occur independently of FN-Integrin and EGFR signaling as indicated by Western blots as well as experiments using the PI3-K inhibitor LY294002, GRGDSP, and AG1478. The results showed that GLN activates cell survival signaling pathways via integrins as well as EGFRs after hyperthermia. Moreover, I found that GLN-mediated preservation of FN expression after HS is regulated via PI3-K signaling. Whether GLN-mediated PI3-K signaling happens simultaneously to FN-Integrin and EGFR signaling or whether PI3-K signaling coordinates FN-Integrin and EGFR signaling needs to be investigated in future studies. Further, experiments with PD98059 and GRGDSP revealed that ERK1/2 assists in mediating transactivation of HSF-1 following HS. This leads to increases in Hsp70 expression via FN-Integrin signaling, which is known to attenuate apoptosis after thermal injury. Fluorescence microscopy results indicated that HS and GLN regulate cell are size changes and the morphology of F-actin via FN-Integrin signaling. Experiments using GRGDSP and GRGESP showed that GLN enhances cellular survival via FN-Integrin signaling in a manner that does not require increased intracellular GLN concentrations (as quantified using LC-MS/MS). In summary, my thesis work gives new and potentially clinically relevant mechanistic insights into GLN-mediated molecular cell survival pathways. These results warrant clinical translation to assess if clinical outcome of critically ill patients suffering from gastrointestinal diseases can be improved by GLN treatment and/or by targeting the molecular pathways found in my studies. / Kritische Erkrankungen wie Sepsis, Schock und entzündliche Darmerkrankungen sind eine der häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten und dem Rest der Welt. Von großer Bedeutung sind deshalb Studien, die darauf abzielen, neue therapeutische Ansätze zu finden, die Gewebe und Zellen vor Verletzungen schützen und Entzündungen verhindern. Im letzten Jahrzehnt hat sich herausgestellt, dass Glutamin Schutz gegen die pathophysiologischen und pathobiochemischen Entgleisungen während solcher Erkrankungen vermitteln kann. Trotzdem ist es bisher nur sehr unvollständig gelungen, die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, die für diese zellulären Schutzfunktionen von Glutamin verantwortlich sind, aufzuklären. In diesem Zusammenhang gab es erste Hinweise darauf, dass die Stabilisierung von extrazellulären Matrixproteinen und die Aktivierung der Signalwege extrazellulärer Matrixproteinrezeptoren eine wichtige Rolle spielen könnten. Hierauf basierend habe ich die Hypothesen aufgestellt, dass die Expression von extrazellulären Matrixproteingehalten und von epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR), sowie die Aktivierung von Integrin- und EGFR-Signalwegen Schlüsselrollen in den protektiven Mechanismen von Glutamin spielen. Meine Arbeiten zeigten anhand von Western Blots und durch den Einsatz von Silencing RNA (gegen Fibronektin, Netrin-1, EGFR und deren Negativkontrollen), dass Glutamin extrazelluläre Matrixproteingehalte, wie Fibronektin und Netrin-1, und EGFR-Levels vor Hitzestress in Darmepithelzellen bewahrt, wodurch Apoptose verhindert wird. Außerdem konnte ich mit Hilfe des selektiven Inhibitors GRGDSP, seiner Negativkontrolle GRGESP und des Src-Kinase-Inhibitors PP2 nachweisen, dass auch die Aktivierung von Fibronektin-Integrin-Signalwegen und von Src-Kinasen an den Schutzmechanismen von Glutamin im Darm beteiligt sind. Wie mit Hilfe des spezifischen EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitors AG1478 nachgewiesen werden konnte, trifft dies auch für die EGFR-Signalwege zu. Zusätzlich zu GRGDSP und AG1478 wurden auch die ERK1/2-Kinase-Inhibitoren PD98059 und UO126 und der p38MAPK-Inhibitor verwendet, um zu zeigen, dass Glutamin Darmepithelzellen durch die Aktivität von Fibronektin-Integrin- und EGFR-Signalwegen vor Hitzestress schützt, indem es EKR1/2 phosphoryliert und p38MAPK dephosphoryliert. PI-3K/Akt/Hsp70-Signalwege werden ebenfalls von Glutamin aktiviert, jedoch unabhängig von Fibronektin-Integrin- und EGFR-Signalwegen. Dies konnte anhand von Western Blot Experimenten und mit Hilfe von LY294002 (PI-3K-Inhibitor), GRGDSP und AG1478 bewiesen werden. Glutamin scheint die gleichen Signalwege sowohl mit Hilfe von Integrinen als auch von EGFR zu beeinflussen, um so den Zelltod in Darmepithelzellen nach Hitzestress zu verhindern. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Glutamin die Erhaltung von Fibronektinkonzentrationen nach Hitzestress durch den PI-3K-Signalweg reguliert. Ob Glutamin den PI-3K-Signalweg parallel zu den Integrin- und EGFR-Signalwegen aktiviert oder ob der von Glutamin ausgelöste PI-3K-Signalweg die Integrin- und EGFR-Signalwege steuert, muss noch weiter untersucht werden. Experimente mit PD98059 und GRGDSP zeigten, dass ERK1/2 in der Gegenwart von Glutamin den Transkriptionsfaktor HSF-1 durch den Fibronektin-Integrin-Signalweg nach Hitzestress transaktiviert. Dadurch nimmt die Expression von Hsp70, welches den Zelltod nach Hitzeschock verhindert, zu. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, dass Hitzestress und Glutamin die Zellgröße und die Aktinmorphologie von Darmepithelzellen durch Fibronektin-Integrin-Signalwege steuern können. Außerdem ergaben Versuche mit GRGDSP und GRGESP, dass Glutamin unabhänging von seinen intrazellulären Konzentrationen das Überleben von Darmepithelzellen durch die Aktivierung von Fibronektin-Integrin-Signalwegen erhöhen kann. Hierbei wurden die Glutaminkonzentrationen mit LC-MS/MS gemessen. Die Versuche im Rahmen meiner Dissertation konnten neue und potentiell klinisch relevante Signalwege der molekularen Schutzmechanismen von Glutamin aufdecken. Diese Ergebnisse können die Grundlage für translationale Studien darstellen, die weiter untersuchen, ob die Überlebensrate von Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen durch die Behandlung mit Glutamin oder durch gezielte Beeinflussung der hier untersuchten molekularen Mechanismen verbessert werden kann.

Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Blutgefäßen, ist ein essentieller Prozess bei der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Reproduktion. Dieser Prozess wird von Wachstumsfaktoren wie z. B. dem vascular endothelial growth factor (VEGF) und Zelladhäsionsmolekülen wie den Integrinen beeinflusst. Die Integrine avb3, avb5 und a5b1, sind in der Tumorangiogenese involviert, wobei die während des Tumorwachstums neu gebildeten Blutgefäße den Zugang einzelner Tumorzellen zum Blutgefäßsystem erleichtern. Zwar liegen Integrine auch auf Zellen in gesundem Gewebe vor, allerdings sind die Integrine avb3 und a5b1 besonders auf der Oberfläche aktivierter Endothelzellen und auf Tumorzellen verstärkt präsentiert. Dennoch gibt es noch immer kontroverse Ergebnisse bezüglich ihrer Rolle als pro- oder antiangiogene Moleküle. Zur Untersuchung der Funktionsweise der Integrine avb3, avb5 und a5b1 in der Tumorangiogenese wurden in dieser Arbeit intrazelluläre Antikörper, sogenannte Intra(dia)bodies, verwendet, um die Integrine innerhalb der Zelle zurückzuhalten und damit einen phänotypischen Knockout zu erzielen. Damit die Intra(dia)bodies in die Zellen gelangen konnten, wurden adenovirale Vektoren als Transfervehikel eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe von Intra(dia)bodies, sowohl bei humanen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC), als auch bei humanen Melanomzellen (M21), ein phänotypischer Knockout von avb3 erzielt werden, sowie ein gleichzeitiger Knockout/Knockdown von avb3/a5b1. Es konnte bei beiden Zelllinien gezeigt werden, dass dies eine verminderte Oberflächenpräsentation von avb5 und der b1-Untereinheit zur Folge hat. Die Endothelzellen waren durch den Verlust der genannten Integrine weder in der Lage, die Matrixmoleküle Fibronektin und Vitronektin zu binden, noch war es ihnen möglich, weiter zu proliferieren. Zudem konnten sich diese Endothelzellen in vitro nicht mehr dreidimensional anordnen und kapillarähnliche Strukturen bilden. Die Proliferation der Melanomzellen in vitro hingegen war trotz verminderter Adhäsion an die Matrixmoleküle Fibronektin und Vitronektin nicht beeinträchtigt. Zusätzlich zeigten die Melanomzellen in dem durchgeführten CAM-Assay, dass sie den Verlust der Integrine weitestgehend tolerieren können. Das Tumorwachstum war durch die fehlenden Integrine unbeeinflusst, wohingegen der phänotypische Knockout von avb3 zu einer beeinträchtigten Angiogenese führte. Um das Wirkungsspektrum zur Untersuchung der Integrine in der Angiogenese zu erweitern, konnten in dieser Arbeit erstmals bindende Fab-Fragmente gegen das Integrin avb5 selektiert werden. Diese können, nach Umwandlung in scFvs und genauerer Charakterisierung, als Intrabodies oder Intradiabodies verwendet werden.

Universiẗat, Diss., 2006--Giessen.

Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2008.

Univ., Diss., 2006--Giessen

Les intégrines, protéines transmembranaires hétérodimériques de type αβ, sont impliquées dans un grand nombre de phénomènes physiologiques et pathologiques. L’intégrine α5β1 est considérée à l’heure actuelle comme une cible thérapeutique pertinente en oncologie, en particulier pour le traitement des glioblastomes. Ces tumeurs cérébrales très agressives résistent aux traitements actuels, en partie par leur capacité à envahir le tissu cérébral sain. Nos résultats mettent en évidence, in vitro, le rôle de l’intégrine α5β1 dans la migration de cellules de glioblastome. Ils ont permis également de caractériser les effets inhibiteurs de la migration d’antagonistes sélectifs de l’intégrine α5β1 non reproduits par des antagonistes de l’intégrine αvβ3. Pour caractériser des antagonistes originaux de l’intégrine α5β1, nous avons combiné des techniques in silico et un test fonctionnel de migration in vitro. Cette démarche a permis la sélection de 3 molécules intéressantes, antagonistes allostériques de l’intégrine α5β1, se démarquant des antagonistes de référence par leur capacité à inhiber la migration cellulaire sans affecter la liaison du ligand endogène de l’intégrine, la fibronectine. / Integrins are αβ heterodimeric transmembrane proteins implicated in various physiological and pathological processes. Currently, α5β1 integrin is considered as a relevant therapeutic target in oncology, particularly for the treatment of glioblastomas. These highly aggressive brain tumours are resistant to current therapies, notably by their ability to invade healthy brain tissues. Our results highlight the role of the α5β1 integrin in the in vitro migration of glioblastoma cells. We characterized the inhibitory effects of selective α5β1 integrin antagonists in cell migration, which are not reproduced by αVβ3 integrin antagonists. To identify original and selective α5β1 integrin antagonists, we combined in silico screening and in vitro functional cell migration assays. This allowed the selection of 3 interesting molecules, behaving as allosteric α5β1 integrin antagonists. Contrarily to known α5β1 antagonists, our three hits inhibit cell migration without interfering with the binding of fibronectin, the endogenous ligand of this integrin.

Les intégrines sont des protéines membranaires hétérodimériques impliquées dans l'adhésion et la migration cellulaire. Elles sont notamment surexprimées lors de la néoangiogenèse tumorale. Une dizaine d'entre elles reconnaît un motif peptidique RGD (Arg-Gly-Asp) structuré. Des analogues de cette séquence peuvent être utilisés pour la détection précoce de tumeurs et de métastases. Nous avons entrepris de développer de nouveaux traceurs, marqués au 99mTc, spécifiques de l'intégrine alphaVbeta3, et d'identifier les traceurs efficaces par un criblage in vivo qui permet de prendre en compte au plus tôt les aspects de biodistribution et de pharmacocinétique. Ne disposant d'aucun modèle prédictif fiable de la structure des complexes d'oxotechnétium au début de ce projet, nous avons préféré une approche combinatoire pour développer une série de ligands potentiels de l'intégrine alphaVbeta3. <br />Les traceurs ont été obtenus selon deux stratégies : 1) cyclisation d'analogues linéaires de RGD par un motif NS2/S coordinant un cœur oxotechnétium ; 2) assemblage combinatoire de motifs indépendants par coordination du cœur oxotechnétium par le motif NS2+S. La stabilité des traceurs technétiés et de leurs analogues rhéniés a été testée en présence de glutathion et dans le plasma. Une première évaluation in vitro sur intégrine purifiée a montré que l'un des peptides RGD, cyclisé par le rhénium, se lie spécifiquement à alphaVbeta3. Un modèle tumoral (tumeur U87-MG, implantée sur des souris nude) a été validé au laboratoire et une méthode d'analyse du criblage in vivo a été mise au point à l'aide de composés modèles marqués au 99mTc. Il s'avère que les données de biodistribution et le pourcentage d'activité retrouvé dans la tumeur sont encourageants pour les complexes cycliques, bien que l'identification des traceurs efficaces soit rendue difficile par leur instabilité dans les conditions d'analyse.

Universiẗat, Diss., 2004--Bielefeld.

Einleitung: Die zielgerichtete Therapie von Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region (HNSCC) durch simultanes Targeting von EGFR (epidermal growth factor-receptor) mit Cetuximab (E) und αVβ3 und αVβ5-Integrinen mit Cilengitide (Cil) könnte wegen dessen geringen Nebenwirkungen attraktiv sein. Wir analysierten die Koloniebildung epithelialer Zellen (CFec) und die Produktion pro-angiogener and pro-inflammatorischer Zytokine im Kurzzeit-Chemoresponsetest (FLAVINO). Methoden: Kollagenase-IV-verdaute Proben von 43 histopathologisch gesicherter HNSCC wurden in Laminin-beschichtete 96-well-Platten eingesät, die in Triplikaten E, Cil oder CilE in Endkonzentrationen von 66,7 µg/ml, 10 µM, und 66,7 µg/ml+10 µM enthielten. Kulturüberstände (KÜS) wurden nach 3 Tagen entnommen und adhärente Zellen Ethanol-fixiert. 39 HNSCC hatten CFec≥4/well. Interleukin 6 (IL-6), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1) und VEGF (vascular endothelial growth factor A) in KÜS wurden mit ELISA quantifiziert. Ergebnisse: CFec auf Laminin wurde durch Cil, E und CilE signifikant unterdrückt. Die Produktion von MCP-1, IL-6 und VEGF wurde ebenfalls vermindert. CilE bewirkte die stärkste Suppression von CFec, MCP-1 und VEGF. Die Wirksamkeit von CilE überstieg dabei diejenige von E oder Cil allein. Der überwiegend additiv gesteigerte aber bei manchen HNSCC ausbleibende Effekt zeigt starke Heterogenität in der Response verschiedener HNSCC auf. Die IL-6-Freisetzung wurde durch E und verstärkt durch CilE, aber nicht durch Cil allein signifikant supprimiert. Schlussfolgerung: Kombiniertes Targeting von EGFR und Integrinen mit CilE erhöht die suppressiven Effekte auf CFec und pro-angiogene und pro-inflammatorische Zytokine, welche potentielle Bedeutung als Biomarker für Response erlangen.:1 Einleitung 3 1.1 Integrine – multifunktionale Transmembranproteine 4 1.1.1 Erkennungsmerkmal RGD-Sequenz 5 1.1.2 Integrine αVβ3 und αVβ5 sowie deren Rolle in Tumorangiogenese und Metastasierung 5 1.2 Cilengitide – ein Integrin-Inhibitor 6 1.3 Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 8 1.3.1 Die Rolle des EGFR bei Tumoren 9 1.3.2 Cetuximab - ein EGFR-Inhibitor 10 1.4 Tumore der Kopf-Hals-Region und deren Biomarker 11 1.4.1 Therapie von Kopf-Hals-Tumoren 12 1.4.2 Klinische Erprobungen von Cilengitide 12 1.4.3 Targeted Therapie mit Cetuximab bei Kopf-Hals-Tumoren 13 1.4.4 Biomarker bei HNSCC 15 1.4.5 Interleukin 6 16 1.4.6 Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor A – VEGF-A 17 1.4.7 Monozyten-Chemoattraktor Protein 1 – MCP-1 19 1.5 Chemoresponsetestung ex vivo 21 1.5.1 Der koloniebildende Kurzzeit-Chemoresponsetest FLAVINO 22 1.5.2 Flavin-induzierte photodynamische Degeneration 22 1.5.3 Ablauf des FLAVINO-Chemoresponsetests 23 1.6 Aufgabenstellung und neue Erkenntnisse 24 2 Publikationen 26 2.1 Abstract zum Vortrag zur 84. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde und Kopf- und Hals-Chirurgie 27 2.2 Publikation bei Anticancer Research 28 2.3 Abstract zum Beitrag zur 88. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde und Kopf- und Hals-Chirurgie 36 3 Zusammenfassung 37 4 Literaturverzeichnis 41 5 Anlagen 49 5.1 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit 49 5.2 Darstellung des Eigenanteils 50 5.3 Lebenslauf 52 5.4 Danksagung 53

Immunhistochemische Vergleichsanalyse von Primärzellaggregaten und Ursprungsgeweben unterschiedlicher Dignität zur Charakterisierung der in-vitro Anpassung Zielsetzung: Dreidimensionale Zellkulturen stellen eine Weiterentwicklung der einschichtigen Zellkultur dar, die den in-vitro Bedingungen im Organismus näherkommt. Darüber hinaus ermöglichen organoide Kulturen, die neben der vorherrschenden Tumorzelle auch Bindegewebszellen und Immunzellen enthalten, eine Analyse der Interaktion dieser Zellen bei wichtigen Aspekten der Krebserkrankung wie Metastasierung, Angiogenese oder der Tumorimmunologie. Materialien und Methoden: Operationsresektate von Schilddrüsengeweben, -adenomen und -karzinomen, Ovarialkarzinomen und Sarkomen wurden in Einzelzellsuspensionen überführt. Nach Inkubation im Schüttler wurden innerhalb von 24-48 Stunden Primärzellaggregate gezüchtet, von denen Kryostatschnitte angefertigt wurden. Mit der APAAP-Methode wurden Epithelzell-, Leukozyten-, Makrophagen- und Endothelzellmarker sowie E-Cadherin, die a2-, a4-, a5- und av Integrinkette, IGF-I und EGF Rezeptoren, cerbB2 sowie Cathepsin D immunhistochemisch untersucht. Die Färbungen der Aggregate und der Herkunftsgewebe wurden statistisch mit dem Mann-Whitney Test verglichen. Ergebnisse: Primäraggregate konnten zu 90-100% aus Operationsresektaten kultiviert werden. Epithelzellen, Leukozyten, Makrophagen und Endothelzellen waren im Primäraggregaten und den Herkunftsgeweben ungefähr gleichmäßig vorhanden. Dies gilt auch für E-Cadherin, a4-Integrin, IGF-I und EGF Rezeptoren, cerbB2 und Cathepsin D. Die a2-, a5- und av Integrinkette trat nur in den Primäraggregaten von Schilddrüsengeweben und -adenomen nicht aber in deren Herkunftsgeweben auf, was auf eine de-novo Exprimierung schließen läßt. Schlußfolgerung: Mit der verwendeten Methode ist es relativ einfach möglich, organoide Primäraggregate zu züchten, die ein geeignetes Forschungsobjekt für verschiedene Aspekte der Tumorpathologie darstellen. Die gefundenen Unterschiede der Integrinexpression zeigen eine Anpassung and die in-vitro Kultivierung und sind möglicherweise eine Reaktion zur Vermeidung der matrix-abhängigen Apoptose. / Immunohistochemical Analysis of primary cell aggregates and their origin tissue of different pathology to evaluate adaptation to in-vitro environment Objective: Three-dimensional cell cultures reflect more closely the in-vitro environment then monolayer cultures. Furthermore, organoid cultures, which contain beside the dominant tumor cell also mesenchymal cells and leucocytes are used to study the interaction of these cells in several aspects of the tumor pathology, such as metastasis, angiogenesis and tumor immunology. Materials and Methods: Specimens obtained from thyroid tissue, thyroid adenomas and carcinomas, ovarian cancer and sarcomas were dissolved to single cell suspensions. After incubation under stirring, primary cell aggregates were cultured within 24-48 hours. Cryostat sections were made and stained with markers of epithelial cells, leucocytes, macrophages, endothelial cells as well as E-cadherin, a2-, a4-, a5- und av Integrin chain, IGF-I und EGF receptor, cerbB2 and Cathepsin D using the APAAP method. The immunhistochemical results of the aggregates and their origin tissue were statistically compared using the Mann-Whitney test. Results: Primary cell aggregates could be obtained from up to 90-100% of all probes. Epithelial cells, leucocytes, macrophages and endothelial cells were found equally in aggregates and their origin tissue. Also E-Cadherin, a4-Integrin, IGF-I und EGF receptors, cerbB2 und Cathepsin D were found equally. The a2-, a5- und av integrin chain was expressed in aggregates of thyroid tissue and adenomas, but not in their origin tissue suggesting a de-novo expression. Conclusion: Primary cell aggregates were easily obtained with the used method and could be used as a model in the study of tumor pathology. The different expressions of integrins show an adaptation to the in-vitro environment and could be a reaction to avoid matrix-related apoptosis.