L’apparition de fibrose pariétale dans la maladie de Crohn est responsable de sténoses et fistules, principales indications chirurgicales. Le but de notre travail était d’évaluer différentes séquences IRM pour différencier l’inflammation de la fibrose à partir d’un modèle original de colite radio-induite. Nous avons inclus un groupe « contrôle » de 10 rats, un groupe « inflammation » avec inflammation et fibrose sous-muqueuse de 24 rats et un groupe « mixte » avec inflammation et fibrose transmurale de 39 rats. Nous avons montré que ce modèle était reproductible et mis au point sur une IRM petit animal 7 T des séquences dont les résultats étaient homogènes, montrant la qualité à la fois des séquences et du modèle. Les signes IRM ont été comparés à l’analyse histologique des pièces (inflammation et fibrose). Les séquences utilisées (pondération T2 et T1, diffusion, transfert d’aimantation et perfusion sans injection) montraient des différences significatives entre les rats des groupes inflammation et mixte. Les séquences ayant la meilleure performance diagnostique pour différencier les deux groupes étaient l’intensité en pondération T2, la diffusion et le transfert d’aimantation. Les combinaisons de signes IRM ayant les meilleures AUC étaient celles comprenant la perfusion, à 0.95 pour la meilleure. Une analyse multivariée de la corrélation entre les signes IRM et les scores histologiques d’inflammation et de fibrose a montré de plus que la perfusion était le seul paramètre lié à la fibrose. Les perspectives sont maintenant de tester ces séquences pour évaluer des traitements anti-fibrosants en cours de développement et de les transposer à des patients pour mieux adapter la prise en charge thérapeutique. / Crohn's disease transmural bowel wall inflammation can lead to fibrosis causing luminal narrowing and stricture formation which are the main indications to surgery. The aim of our study was to evaluates MR sequences to distinguish inflammation from fibrosis using an original model of radiation-induced colitis. We included a “control” group of 10 rats, an “inflammation” group of 24 rats with inflammation and submucosal fibrosis and a “mixed” group of 39 rats with inflammation and transmural fibrosis. We showed that this model was very reproducible and developed sequences on a 7 T MR which results were homogeneous, showing both the quality of the sequences and of the model. MR data were compared with the histological analysis (inflammation and fibrosis) of the resection pieces. MR sequences (T2 and T1 weighted, diffusion weighted, magnetization transfer and FAIR perfusion) showed significant differences between irradiated and control rats and between inflammation and mixed groups. Sequences with the best AUC to differentiate the two groups were T2-weighted intensity, diffusion and magnetization transfer. The combinations of MR signs with the best AUC were those including perfusion, at 0.95 for the best. A multivariate analysis of the correlations between MR imaging and pathologic inflammation and fibrosis scores showed that perfusion was the only parameter related to fibrosis. Prospects are now to test these sequences to evaluate antifibrotic treatments currently under development and to transpose these sequences to patients to evaluate intestinal fibrosis and improve patients’ management.

La fibrose digestive est une complication secondaire tardive de la radiothérapie dans 5 à 10% des patients traités pour des tumeurs de la sphère abdomino-pelvienne. Elle est caractérisée par une accumulation de matrice extracellulaire synthétisée par les cellules mésenchymateuses. La transition endothélium-mésenchyme (EndoMT), est un processus au cours duquel les cellules endothéliales expriment des marqueurs mésenchymateux en réponse au stress. L'EndoMT a été identifiée comme une source de cellules mésenchymateuses participant à la fibrose chez des patients atteints de maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Cette étude s'est donc concentrée sur le rôle de l'EndoMT dans le développement de la fibrose intestinale radio-induite et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles.Nos résultats ont révélé pour la première fois l'existence de l'EndoMT au niveau de la paroi rectale chez l'homme après radiothérapie. L'utilisation de souris exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur endothélial Tie2, nous a permis de localiser les cellules mésenchymateuses possédant une origine endothéliale, confirmant l'existence de l'EndoMT radio-induite dans notre modèle préclinique de rectite radique. In vitro, nous avons confirmé le changement phénotypique des cellules endothéliales irradiées.Ce projet s'est ensuite concentré sur un acteur potentiel de l'EndoMT radio-induite, Hey2. La génération d'un modèle murin déficient pour Hey2 dans l'endothélium a révélé une diminution des dommages muqueux et de la fréquence l'EndoMT après irradiation. L'inhibition de Hey2 représente une nouvelle approche thérapeutique attrayante dans la réduction de la fibrose digestive radio-induite. / Fibrosis is identified as a chronic side effect occurring after radiotherapy for pelvic tumors in 5 to 10 % of patients. This pathological healing process is characterized by an accumulation of extracellular matrix synthesized by mesenchymal cells. Endothelial to mesenchymal transition (EndoMT), is a processes during which endothelial cells express mesenchymal markers in response to stress. EndoMT is identified as a source of mesenchymal cells taking part to fibrosis development in patients suffering from inflammatory bowel diseases. Then, this study focused on the potential participation of EndoMT in radiation-induced intestinal fibrosis and tried to identify new therapeutics targets. Interestingly, our results showed for the first time EndoMT in rectal tissues from patients who developed radiation proctitis following radiotherapy. We used an in vivo approach to follow the mesenchymal cells having an endothelial origin in a mouse model expressing the GFP under the control of an endothelial promoter, Tie2 (Tie2-GFP). Thereby, our results confirmed the existence of radiation-induced EndoMT in our preclinical model of radiation proctitis. In vitro characterization showed that irradiation induced a modulation of the endothelial phenotype through a mesenchymal profile, a hallmark of EndoMT. This project also focused on a potential molecular actor, Hey2. In this context, we generated a transgenic mouse model in which Hey2 gene expression is repressed specifically in the endothelial compartment and observed a decrease in radiation-induced mucosal damages and EndoMT frequency. Consequently, inhibiting Hey2 expression could represent a new interesting therapeutic strategy.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18514号 / 医博第3934号 / 新制||医||1006(附属図書館) / 31400 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 上本 伸二, 教授 三森 経世, 教授 長田 重一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

En el patró fibroestenosant de la malaltia de Crohn els fibroblasts intestinals augmenten en número contribuint al desenvolupament de la fibrosi. Un dels principals promotors de la proliferació d’aquestes cèl•lules és el bFGF. En el present estudi la fracció rica en tocotrienol ha demostrat tenir efectes antiproliferatius en fibroblasts intestinals humans independentment de la procedència dels fibroblasts. Els tocotrienols redueixen tant la proliferació basal com la induïda per bFGF en fibroblasts. L’apoptosi de les cèl•lules efectores en el desenvolupament de la fibrosi sembla ser el principal mecanisme de la seva resolució. Els tocotrienols instauraren un procés complert d’apoptosi en els fibroblasts. A diferència del que passa amb la majoria d’agents proapoptòtics, els tocotrienols provoquen l’activació tant de la via extrínseca com de la via intrínseca de l’apoptosi ja que activa les caspases 8 i 9. Sorprenentment, l’addició de ciclosporina A (CsA), un conegut inhibidor de la via intrínseca de l’apoptosi, bloqueja completament el procés d’apoptosi induït per FRT. Això demostra que tot i l’activació de la caspasa 8 i per tant, de la via extrínseca, en el tractament amb tocotrienols la predominant és la via intrínseca. L’autofàgia té un paper molt rellevant en l’aclariment de cossos apoptòtics. Els tocotrienols han demostrat eficàcia en la inducció d’autofàgia en fibroblasts, ja que provoca la maduració de la proteïna LC3 i l’aparició de vacuoles autofàgiques en el citoplasma d’aquestes cèl•lules. Un cop més la CsA reverteix aquest procés, i per tant inhibeix l’autofàgia, demostrant que aquest procés requereix la participació de la mitocòndria. Les patologies que cursen amb desenvolupament de fibrosi estan associades a alts nivells de TGF-β que resulta en el reclutament de fibroblasts al lloc de la lesió i a un increment en la producció de matriu extracel•lular. A nivell intracel•lular, la fosforilació d’Smad3 és el pas clau que regula les accions del TGF-β. Els tocotrienols han mostrat eficàcia en la disminució dels nivells intracel•lulars d’Smad3 fosforilada induïda per TGF-β. La fosforilació d’Smad3 té efectes oposats en la regulació de l’expressió gènica. Regula positivament l’expressió de TIMP-1, en canvi, regula negativament l’expressió de MMP-3. Tot i ser efectes oposats en quant a expressió gènica, aquests dos fenòmens afavoreixen l’acumulació de matriu extracel•lular. L’exposició a tocotrienols fa que es reverteixi aquest estat profibrogènic ja que indueix l’expressió de MMP-3 però no afecta als nivells de TIMP-1. La síntesi de MEC i especialment la síntesi de COL1, COL3 i COL5 està incrementada en la fibrosi intestinal, aquest fet està directament relacionat amb l’activitat de TGF-β en la zona afectada. Els tocotrienols interfereixen en la síntesi de col•lagen. A més, els tocotrienols disminueixen la fosforilació d’Smad3 induïda per TGF-β, un fet clau en la síntesi de matriu extracel•lular. Aquests resultats permeten hipotetitzar un potencial antifibrogènic dels tocotrienols. Per a confirmar aquest potencial “in vivo” ens calia disposar d’un model experimental de fibrosi intestinal. A diferència del que succeeix amb la colitis, en la que es disposa d’un gran nombre de models animals, hi ha pocs models experimentals específicament dissenyats per a reproduir la fibrosi intestinal. Aquest fet, ha limitat molt el desenvolupament de noves estratègies de tractament antifibrogènic en l’intestí. Mitjançant l’administració intracolònica repetida a dosis baixes de l’haptè TNBS vam poder establir fibrosi intestinal en la rata de manera rellevant i reproduïble. En aquest model de fibrosi intestinal, els animals que van rebre la dosi més alta de tocotrienols provada en aquest estudi van mostrar nivells disminuïts en paràmetres que mesuren la inflamació, això és, es va disminuir l’índex d’activitat de la malaltia i la pèrdua de pes causada pel TNBS així com també va reduir l’expressió de TNF-α. / Excessive fibroblast expansion and extracellular matrix deposition are key events for the development of bowel stenosis in Crohn’s disease patients. Tocotrienols are vitamin E compounds with proven in vitro antifibrogenic effects on rat pancreatic fibroblasts. We aimed at investigating the effects of tocotrienols on human intestinal fibroblast proliferation, apoptosis, autophagy, and synthesis of ECM. Intestinal fibroblasts isolated from patients with Crohn’s disease were treated with tocotrienol-rich fraction from palm oil. Tocotrienols significantly reduced proliferation, enhanced cell death by promoting apoptosis and autophagy. Fibroblast apoptosis, but not autophagy, was prevented by the pan-caspase inhibitor zVAD-fmk, whereas both types of cell death were prevented when the mitochondrial permeability transition pore was blocked by cyclosporin A, demonstrating a key role of the mitochondria in these processes. TRF diminished procollagen type I and laminin γ production these cells. Transforming growth factor-β plays a key role in matrix deposition during fibrosis. Treatment of intestinal fibroblasts with tocotrienol rich fraction prevents Smad3 phosporylation induced by transforming growth factor-β and reduces collagen type 1 and 3 production by these cells. Besides, in a rat model of intestinal fibrosis, treatment with tocotrienols reduces diarrhea, rectal bleeding and weight loss, as well as levels of colonic tumor necrosis factor-α and vimentin expression demonstrating that this compound has anti-inflammatory effects in vivo.