Memoria para optar al titulo profesional de Bioquímico / La Enfermedad de Crohn (EC) y la Colitis Ulcerosa (CU) enfermedades inflamatorias intestinales (EII) multifactoriales que presentan una relación genética importante. Recientemente se han descrito polimorfismos en los genes de los receptores de reconocimiento de patógenos NOD2/CARD15 y Toll tipo 4 (TLR4), que estarían involucrados en la patogénesis de las EII. No existen antecedentes descritos acerca de la frecuencia de estos polimorfismos en población latinoamericana El objetivo principal de esta tesis es determinar la frecuencia de polimorfismos Asp299Gly de TLR4 y L1007fsinC, Arg702Trp, Gly908Arg de NOD2/CARD15 en un grupo de pacientes chilenos portadores de EII. Se estudiará DNA obtenido de sangre periférica de 44 pacientes con EII (22 EC, 22 CU) y 20 controles sanos. Los polimorfismos se determinaron mediante PCR-RFLP o PCR alelo específico. Se caracterizaron ademas características clínicas y demográficas. Dentro de los pacientes diagnosticados con EC, encontramos un patrón clínico inflamatorio en 14 de ellos, 5 pacientes presentaron un fenotipo penetrante y 5 desarrollaron estenosis, en cuanto a la localización de la enfermedad en EC, un individuo manifiesto compromiso esofágico, 5 presentaron daño perianal, 7 con compromiso de íleo y 16 pacientes mostraron compromiso colónico. Pacientes diagnosticados con CU, 2 de ellos presentaron proctitis, 2 proctosigmoiditis, 4 colitis izquierda y 14 desarrollaron pancolitis. El análisis genético de NOD2/CARD15 reveló la presencia del alelo Arg702Trp, L1007fsinsC y Gly908Arg, en dos pacientes con EC, uno con EC y uno con CU, respectivamente. El alelo mutado del polimorfismo Asp299Gly del gen de TLR4 fue identificado en dos pacientes uno con EC y uno con CU. PCR y PCR-RFLP es una técnica sensible y confiable, y es considerado un excelente método de detección de polimorfismos. Este es el primer estudio genético realizado en pacientes chilenos con EII, donde se demuestra que los alelos asociados con estas patologías se presentan con una frecuencia equivalente a grupos europeos según lo publicado en estudios anteriores. Sin embargo, factores ambientales u otros polimorfismos genéticos podrían estar involucrados en la patogénesis de EII en nuestra población / Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) are multifactorial diseases with a genetic background. Genes related to the innate immune response have been observed to be involved. Polymorphisms of Toll-like receptor 4 (TLR4) and CARD15/NOD2 are thought to be involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). There is no information about the frequency of these polymorphisms in South American and Chilean populations. The main subject of this thesis is investigate the distribution of NOD2/CARD15 (Arg702Trp, Gly908Arg and Leu1007fsinsC) and TLR4 (Asp299Gly) polymorphisms in Chilean patients with IBD. DNA was obtained from 22 CD, 22 UC patients and 20 healthy individuals. Genotyping was performed by allele-specific PCR and by PCR-RFLP analysis. Clinical and demographic features were characterized. Among the CD patients, the clinical pattern was deemed inflammatory in 14, while five had penetrating and five stricturing, variants. One patient had esophageal involvement, five perianal, seven ileal and in 16 the colon was involved. Among the UC patients, two had proctitis, two proctosigmoiditis, four left-sided colitis and 14 pancolitis. NOD2/CARD15 analysis revealed the presence of the Arg702Trp allele in two CD patients (both Heterozygotes), L1007fsinsC in one CD patient (heterozygote) while Gly908Arg was found in one UC patient. The Asp299Gly TLR4 allele was identified in one UC and one CD patient. PCR and RFLP-PCR is a sensitive and reliable technique, and it is consider an excellent method to detecting genetics polymorphisms. This genetic study shows that the alleles frequently associated with IBD (L1007fsinsC, Gly908Arg and Arg702Trp in NOD2/CARD15 and Asp299Gly TLR4) have a low incidence in Chilean, IBD patients, which is similar to European populations. It is possible that, in addition to environmental factors, other genetic polymorphisms may be involved in the pathogenesis of the disease in Chilean, IBD patients

La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria intestinal muy rara en nuestro medio y con una distribución muy variable en diferentes partes del mundo, la incidencia media es de 6,7 (rango de 1,6 a 14,6) casos por 100 000 habitantes anualmente y la prevalencia de 140 (rango de 10 a 199) casos por 100 000 habitantes en occidente. Presentamos el caso de un varon de 52 años natural y procedente del Callao con una imagen por colonoscopia compatible con una Ulcera Cecal y sin otras alteraciones en el tracto gastrointestinal, el cual presento un diagnostico anatomopatológico compatible con una Enfermedad de Crohn que es confirmada por serología. / Crohn s Disease, is a rare inflammatory bowel disease in Perú. Incidence rates vary from 1,6 – 14,6 / 100 000 and prevalence rate is 140 / 100000 in the western hemisphere. We report a case of 52 y.o male patient from Callao Peru, with a colonoscopy image of a solitary cecal ulcer and without other gastrointestinal findings and a histology suggestive of Crohn s Disease with a ASCA positive and p –ANCA negative.

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en Microbiología / La mayor concentración y diversidad de microorganismos asociados a la microbiota humana reside en el intestino, estableciendo una relación comensal o mutualista con el hospedero, la cual puede verse interrumpida cuando la estructura y composición microbiana es alterada (disbiosis). La disbiosis puede estar asociada a cambios en la dieta, el uso de antibióticos y en una serie de enfermedades, entre ellas las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como Colitis Ulcerosa (CU) y Enfermedad de Crohn (EC). Si bien la mayor parte de los estudios sobre microbiota intestinal se han realizado a partir muestras de heces debido a su fácil obtención, la microbiota adherente del colon es la más representativa de la comunidad microbiológica que co-evoluciona con el hospedero en el transcurso de la enfermedad, pues ésta puede interactuar de forma más directa con el sistema inmunitario. Considerando los antecedentes expuestos el objetivo de esta tesis es la caracterización de la microbiota adherente de individuos con EII mediante análisis de secuenciación masiva y generación de librerías de rDNA16S, a partir de muestras de biopsias de individuos chilenos y españoles (n=66) diagnosticados con EC, CU y controles (CTL). Nuestros resultados mostraron diferencias significativas entre la abundancia relativa de las phyla Proteobactería y Firmicutes entre individuos con EII y CTL, sin embargo no observamos diferencias significativas entre la microbiota de individuos con CU y EC. Por otro lado, a diferencia de los estudios realizados con muestras de heces, donde los individuos con EII fueron clasificados en grupos únicos y definidos (EC, CU o CTL), en nuestro estudio los individuos con EII se clasificaron en 5 grupos distintos según su composición microbiana. Los grupo denominados EII-1, EII-3, EII-2 y EII-5 albergaron únicamente individuos con EC y CU, presentando un enriquecimiento de las phyla Bacteroidetes (34.5%), Proteobacteria (75.4%), y de las Unidades Filogenéticas Operacionales (OPUs) afiliadas a las bacterias Ruminococcus gnavus (9.75%); Cupriavidus necator/Ralstonia pickettii (6.60%); Brevundimonas diminuta/Brevundimonas vancanneytii (5.87%) y Klebsiella oxytoca (32.16%). El grupo EII-4 contuvo individuos con EII y CTL mostrando un enriquecimiento del phylum Firmicutes (59.85%) y OPUs afiliados a Faecalibacterium prausnitzii (14.67%), (bacteria características de individuos sanos). Sumado a los anterior aquellos individuos pertenecientes a los grupos EII-3, EII-2 y EII-5 presentaron abundancias que abarcaron entre el 12.74 al 55.60% en OPUs afiliados a bacterias anaeróbicas facultativas y abundancias del 4.25% al 9.68% en OPUs afiliados a bacterias aeróbias estrictas. Por el contrario, los grupos EII-4 y EII-1 abarcaron abundancias del 41.21% al 45.3% en OPUs afiliados a bacterias anaerobias obligadas y abundancias cercanas al 1.5% en OPUs afiliados a bacterias aerobias estrictas. Además, los análisis de correlación mostraron asociaciones negativas entre los OPUs anaerobios facultativos o aerobios, (indicadores de individuos con EII pertenecientes a los grupos EII-1, EII-2, EII-3, EII-5) con aquellos OPUs anaerobios (indicadoras de EII-4). Este tipo de correlación da cuenta de relaciones de competencia (exclusión) entre estas bacterias, dadas posiblemente por las condiciones ambientales del intestino, es decir un incremento en los niveles de oxígeno durante el proceso de inflamación. Estos resultados concuerdan con lo sugerido en la “hipótesis del oxígeno”, donde se plantea que en condiciones de inflamación crónica las paredes intestinales de individuos con EII conducen a una mayor liberación de hemoglobina (que lleva oxígeno), y especies reactivas de oxígeno a la luz del intestinal. Sumado a lo anterior, los colonocitos bajo señales pro-inflamatorias realizarían un cambio en su metabolismo hacia una glicólisis anaeróbica, la cual no consume oxígeno permitiendo que este difunda hacia el epitelio intestinal conduciendo así un ambiente favorable para bacterias anaerobias facultativas y aerobias. En este contexto, uno de los componentes de la respuesta inmune innata que parece controlar la población que conforma la microbiota intestinal son los péptidos antimicrobianos (PAMs). Entre los PAMs estudiados en el epitelio colónico se encuentran las Catelicidina (CAMP) y β-defensinas (hBD), los cuales poseen actividad antimicrobiana sobre grupos bacterianos específicos. Modelos murinos que sobreexpresan PAMs muestran una disbiosis con respecto a sus pares silvestres, dando cuenta de la importancia de los PAMs como reguladores de la composición microbiana intestinal. Adicionalmente, investigaciones recientes han demostrado que pacientes con EII poseen una expresión alterada de PAMs con respecto a individuos CTL. En esta línea de pensamiento, esta tesis propuso como hipótesis “El aumento de la población de Proteobacteria observado en la mucosa intestinal en pacientes con EC con respecto a pacientes CU, se asocia con la disminución en la expresión de péptidos antimicrobianos CAMP y hBD 2-4”. Sin embargo, debido al bajo número de muestras que permitieran obtener un RNA íntegro y de calidad para analizar los niveles de expresión de los PAMs CAMP y hBD-2, no fue posible demostrar que nuestros resultados fueron significativos en la correlación con respecto a los phylum bacterianos. En esta condición esta hipótesis no puede ser aceptada ni rechazada. / The highest concentration and diversity of microorganisms belonging to the human microbiota reside in the intestine, establishing a commensal or mutualistic relationship with the host. This relationship can be modified when the microbial structure and composition is altered (dysbiosis). Dysbiosis may be associated to changes in diet, use of antibiotics and to a number of diseases, including inflammatory bowel diseases (IBD) such as Ulcerative Colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). Although, due to the easiness to collect them, most of the studies on intestinal microbiota are carried out analyzing stool samples, the adherent microbiota of the colon is representative of the microbial community which co-evolves with the host, interacting directly with the immune system, during the course of the disease. Considering the above, the aim of this thesis was to characterize the adherent microbiota of individuals suffering IBD by means of massive sequencing analysis. Samples (biopsies) were obtained from Chilean and Spanish individuals (n = 66) diagnosed with CD, UC, and control (CTL). Our results showed significant differences between the relative abundance of phyla Proteobacteria and Firmicutes among individuals with IBD and CTL but no differences were observed when comparing the microbiota of individuals with UC and CD. Unlike the studies based on stool samples, in which individuals with IBD are classified as unique and defined groups (CD, CU or CTL) in our study individuals with IBD were classified into five different groups according to their microbial composition. Groups IBD-1, IBD-3, IBD-2 and IBD-5 contained only individuals with CD and UC, presenting an enrichment of phyla Bacteroidetes (34.5%) and Proteobacteria (75.4%) and Operational Phylogenetic Units (OPUs) affiliated with bacteria Ruminococcus gnavus (9.75%) ;Cupriavidus necator / Ralstonia pickettii (6.60%); Brevundimonas diminuta / B revundimonas vancanneytii (5.87%) and Klebsiella oxytoca (32.16%). Group IBD-4 contained individuals with IBD and CTL showing an enrichment of phylum Firmicutes (59.85%) and OPUs affiliated with Faecalibacterium prausnitzii (14.67%), (bacterium characteristic of healthy individuals). In addition to the above, individuals belonging to groups IBD-3, IBD-2 and IBD-5 showed abundances between 12.74 to 55.60% of OPUs affiliated to anaerobic or facultative bacteria, and abundances of 4.25% to 9.68% of OPUs affiliated to obligate aerobes. On the contrary, groups IBD-4 and IBD-1 showed abundances of 41.21% to 45.3% of OPUs affiliated with obligated anaerobic bacteria and abundances close to 1.5% of OPUs affiliated to obligated aerobic bacteria. In addition, correlation analyzes showed negative associations between facultative anaerobic and aerobic OPUs (indicators of individuals with IBD belonging to groups IBD-1, IBD-2, IBD-3, IBD-5) with those obligated anaerobic OPUs (indicators of IBD-4). This kind of correlation exemplifies competition relationships (exclusion) between these bacteria, possibly due to the environmental conditions of the intestine, i.e. an increase in oxygen levels during the process of inflammation. These results are consistent with the "oxygen hypothesis" which proposes that in/under conditions of chronic inflammation, causing the release of oxygen carrying hemoglobin in the intestinal mucosa and reactive oxygen species in the intestinal lumen. In addition, colonocytes under pro-inflammatory signals shift their metabolism towards an oxygen consuming anaerobic glycolysis, increasing epithelial oxygenation which leads to a favorable environment for facultative and aerobic bacteria. One of the components of the innate immune response that seems to control the microbial population are the antimicrobial peptides (AMPs). Among the AMPs studied in the colonic epithelium, Cathelicidin (CAMP) and β-defensins (hBD), which have antimicrobial activity on specific bacterial groups, can be mentioned. Murine models overexpressing AMPs showed a dysbiosis when compared to their wild type mates, revealing the importance of AMPs as regulators of the intestinal microbial composition. Additionally, recent research showed that patients with IBD have an altered expression of AMPs when compared to CTL individuals. In this context, this thesis proposed the following hypothesis: "The increase in the population of Proteobacteria observed in the intestinal mucosa in patients with CD when compared to patients with UC is associated with the decrease in the expression of antimicrobial peptides CAMP and hBD 2-4". However, due to the low number of samples that allowed to obtain a high-quality RNA to analyze the levels of expression of the CAMP and hBD-2 MAPs, it was not possible to demonstrate that our results were significant in the correlation of MAPs with bacterial phyla. In this condition this hypothesis cannot be accepted or rejected. / Fundación Maria Ghilardi, beca para estudios de postgrado durante el año 2013, Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología (CONICYT-21140975), beca para estudios de Doctorado (años 2014-2017) y FONDECYT 1161161. / 15 de julio 2019

La malaltia de Crohn és una malaltia inflamatòria intestinal de base immunitària. L’etiologia de la malaltia és desconeguda, encara que en general s’admet la següent definició: la malaltia és conseqüència d’una desregulació de la resposta immunitària en front als antígens comuns de la flora bacteriana intestinal en individus genèticament susceptibles. Un component important de la desregulació immunitària es la hiperactivació dels limfòcits T que es dóna en aquesta i altres malalties de tipus autoimmunitari, i en les que tradicionalment s’ha atribuït una major presència i producció de citocines per part de la població limfocitària Th1 en el teixit inflamat. Recentment, amb la descripció de la citocina IL-23 i la població Th17 se ha posat en dubte el paper principal de la població Th1 en les malalties inflamatòries de base immunitària. De fet, en algunes d’aquestes malalties s’ha descrit un augment de las cèl•lules Th17 així com de les citocines produïdes per aquesta població. L’objectiu d’aquesta tesi ha sigut caracteritzar el paper relatiu de les poblacions Th1 i Th17 en la mucosa intestinal inflamada i en la circulació perifèrica de pacients amb malaltia de Crohn activa o en remissió així com avaluar el paper i l’evolució d’aquestes poblacions limfocitàries en els estadis inicials (primers brots de la malaltia) i avançats de la malaltia. En aquest estudi observem que els períodes d’activitat inflamatòria en la malaltia de Crohn s’associen a una resposta sistèmica exacerbada de la població Th17, essent la producció de IL-17 en sobrenedant del cultiu de sang total, el percentatge de limfòcits CD4+IL-17+ i la producció de IL-17 per part d’aquestes cèl•lules més elevada que en els pacients amb malaltia inactiva i que en els controls sans. Paral•lelament hem descrit que la població Th1 circulant no presenta durant un brot d’activitat un augment tan generalitzat com la població Th17, sinó que només observem un augment en el percentatge de limfòcits CD4+IFN-γ+ circulants i en els dobles productors de IL-17 y IFN-γ. Els pacients que denominem debut (pateixen el primer brot de la malaltia) no presenten a nivell sistèmic un augment de la resposta Th17 ni Th1. A diferència del que observem en circulació perifèrica, en la mucosa intestinal inflamada trobem un augment dels trànscrits de les citocines característiques de la població Th17, tant en els pacients debut com en els que es troben en un estat més avançat de la malaltia. A més, en la mucosa inflamada d’ambdós grups de pacients trobem una major infiltració de cèl•lules IL-17+. A partir d’aquests resultats hipotetitzem un model per a la fisiopatologia de la malaltia de Crohn en el que la generació de limfòcits Th17 memòria podrien estar implicats en la cronicitat i recurrència de la malaltia. Així en les primeres fases de la malaltia només detectem un augment d’aquesta població en la mucosa intestinal, com seria d’esperar d’una resposta immunitària local. A conseqüència d’aquesta es generarà una població limfocitària de memòria immunitària que només detectem en circulació en aquells malalts que es troben ja en estadis més crònics de la malaltia. Amb aquesta hipòtesi podem explicar mitjançant mecanismes immunitaris diferents el fet que, en general, la malaltia de Crohn no es manifesta fins la segona o tercera dècada de vida d’un individu, mentre que un cop s’ha manifestat, la recurrència d’activitat inflamatòria és molt més freqüent (degut a la participació dels limfòcits memòria). / One component of the immune deregulation observed in Crohn’s disease is the massive infiltration of T lymphocytes in the inflamed tissue. Classically these hyperreactive lymphocytes have been attributed to the Th1 subpopulation. Recently the description of IL-23 cytokine and Th17 population has questioned the main role given to Th1 population. In this regard, an increase in the frequency of Th17 cells and in the production of their signature cytokines has been already described in some inflammatory diseases. In this study we have observed that active inflammation in Crohn’s disease associates to an increased systemic response of Th17 cells described as overproduction of IL-17 in supernatants of whole blood cultures, increased percentage of CD4+IL-17+ lymphocytes and increased production of IL-17 from these cells related to remission periods of disease or healthy controls. Early patients (patients who suffer their first flare of the disease) do not present a systemic increase of Th1 or Th17 cells despite suffering of active inflammation. Otherwise, in inflamed intestinal mucosa there is an increase in the expression of Th17 cytokines both in early as well as late chronic patients. Moreover we found a significant higher number of Th17 cells infiltrating the mucosa of both groups of patients. Taking these results into account we hypothesize a model for the physiopathology of Crohn’s disease in which the generation of memory Th17 lymphocytes could be involved in the chronicity and recurrence of the disease. Therefore, in early phases of disease we only detect an increase of this population in the intestinal mucosa, as we could expect from a local immune response. As a consequence of this activation there would be a generation of memory lymphocytes that we can detect in peripheral circulation only in that patients that have already suffered repeated flares of the disease. This hypothesis allows us to explain the different immune mechanisms that could be acting during the evolution of Crohn’s disease, as it is the first appearance of disease, generally occurring during the second or third decade of the individual life, and the subsequent appearance of recurrences that are much more frequent and life-long lasting.

En el patró fibroestenosant de la malaltia de Crohn els fibroblasts intestinals augmenten en número contribuint al desenvolupament de la fibrosi. Un dels principals promotors de la proliferació d’aquestes cèl•lules és el bFGF. En el present estudi la fracció rica en tocotrienol ha demostrat tenir efectes antiproliferatius en fibroblasts intestinals humans independentment de la procedència dels fibroblasts. Els tocotrienols redueixen tant la proliferació basal com la induïda per bFGF en fibroblasts. L’apoptosi de les cèl•lules efectores en el desenvolupament de la fibrosi sembla ser el principal mecanisme de la seva resolució. Els tocotrienols instauraren un procés complert d’apoptosi en els fibroblasts. A diferència del que passa amb la majoria d’agents proapoptòtics, els tocotrienols provoquen l’activació tant de la via extrínseca com de la via intrínseca de l’apoptosi ja que activa les caspases 8 i 9. Sorprenentment, l’addició de ciclosporina A (CsA), un conegut inhibidor de la via intrínseca de l’apoptosi, bloqueja completament el procés d’apoptosi induït per FRT. Això demostra que tot i l’activació de la caspasa 8 i per tant, de la via extrínseca, en el tractament amb tocotrienols la predominant és la via intrínseca. L’autofàgia té un paper molt rellevant en l’aclariment de cossos apoptòtics. Els tocotrienols han demostrat eficàcia en la inducció d’autofàgia en fibroblasts, ja que provoca la maduració de la proteïna LC3 i l’aparició de vacuoles autofàgiques en el citoplasma d’aquestes cèl•lules. Un cop més la CsA reverteix aquest procés, i per tant inhibeix l’autofàgia, demostrant que aquest procés requereix la participació de la mitocòndria. Les patologies que cursen amb desenvolupament de fibrosi estan associades a alts nivells de TGF-β que resulta en el reclutament de fibroblasts al lloc de la lesió i a un increment en la producció de matriu extracel•lular. A nivell intracel•lular, la fosforilació d’Smad3 és el pas clau que regula les accions del TGF-β. Els tocotrienols han mostrat eficàcia en la disminució dels nivells intracel•lulars d’Smad3 fosforilada induïda per TGF-β. La fosforilació d’Smad3 té efectes oposats en la regulació de l’expressió gènica. Regula positivament l’expressió de TIMP-1, en canvi, regula negativament l’expressió de MMP-3. Tot i ser efectes oposats en quant a expressió gènica, aquests dos fenòmens afavoreixen l’acumulació de matriu extracel•lular. L’exposició a tocotrienols fa que es reverteixi aquest estat profibrogènic ja que indueix l’expressió de MMP-3 però no afecta als nivells de TIMP-1. La síntesi de MEC i especialment la síntesi de COL1, COL3 i COL5 està incrementada en la fibrosi intestinal, aquest fet està directament relacionat amb l’activitat de TGF-β en la zona afectada. Els tocotrienols interfereixen en la síntesi de col•lagen. A més, els tocotrienols disminueixen la fosforilació d’Smad3 induïda per TGF-β, un fet clau en la síntesi de matriu extracel•lular. Aquests resultats permeten hipotetitzar un potencial antifibrogènic dels tocotrienols. Per a confirmar aquest potencial “in vivo” ens calia disposar d’un model experimental de fibrosi intestinal. A diferència del que succeeix amb la colitis, en la que es disposa d’un gran nombre de models animals, hi ha pocs models experimentals específicament dissenyats per a reproduir la fibrosi intestinal. Aquest fet, ha limitat molt el desenvolupament de noves estratègies de tractament antifibrogènic en l’intestí. Mitjançant l’administració intracolònica repetida a dosis baixes de l’haptè TNBS vam poder establir fibrosi intestinal en la rata de manera rellevant i reproduïble. En aquest model de fibrosi intestinal, els animals que van rebre la dosi més alta de tocotrienols provada en aquest estudi van mostrar nivells disminuïts en paràmetres que mesuren la inflamació, això és, es va disminuir l’índex d’activitat de la malaltia i la pèrdua de pes causada pel TNBS així com també va reduir l’expressió de TNF-α. / Excessive fibroblast expansion and extracellular matrix deposition are key events for the development of bowel stenosis in Crohn’s disease patients. Tocotrienols are vitamin E compounds with proven in vitro antifibrogenic effects on rat pancreatic fibroblasts. We aimed at investigating the effects of tocotrienols on human intestinal fibroblast proliferation, apoptosis, autophagy, and synthesis of ECM. Intestinal fibroblasts isolated from patients with Crohn’s disease were treated with tocotrienol-rich fraction from palm oil. Tocotrienols significantly reduced proliferation, enhanced cell death by promoting apoptosis and autophagy. Fibroblast apoptosis, but not autophagy, was prevented by the pan-caspase inhibitor zVAD-fmk, whereas both types of cell death were prevented when the mitochondrial permeability transition pore was blocked by cyclosporin A, demonstrating a key role of the mitochondria in these processes. TRF diminished procollagen type I and laminin γ production these cells. Transforming growth factor-β plays a key role in matrix deposition during fibrosis. Treatment of intestinal fibroblasts with tocotrienol rich fraction prevents Smad3 phosporylation induced by transforming growth factor-β and reduces collagen type 1 and 3 production by these cells. Besides, in a rat model of intestinal fibrosis, treatment with tocotrienols reduces diarrhea, rectal bleeding and weight loss, as well as levels of colonic tumor necrosis factor-α and vimentin expression demonstrating that this compound has anti-inflammatory effects in vivo.

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos,enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodosinmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es unatécnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado yevaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productoscárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados.En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario. / The presence of pathogens in foods is among the most serious public health concerns, and the diseases produced by them are a major cause of morbidity. Consequently, the application of microbiological control within the quality assessment programs in the food industry is a premise to minimize the risk of infection for the consumer. Classical microbiological methods involve, in general, the use of a non-selective pre-enrichment, selective enrichment, isolation on selective media, and subsequent confirmation using morphological, biochemical and/or serological tests. Thus, they are laborious, time consuming and not always reliable (e.g. in viable but non-culturable VBNC forms). A number of alternative, rapid and sensitive methods for the detection, identification and quantification of foodborne pathogens have been developed to overcome these drawbacks. PCR has become the most popular microbiological diagnostic method, and recently, the introduction of a development of this technique, RTi-PCR, has produced a second revolution in the molecular diagnostic methodology in microbiology. RTi-PCR is highly sensitive and specific. Moreover, it allows accurate quantification of the bacterial target DNA. Main advantages of RTi-PCR for its application in diagnostic laboratories include quickness, simplicity, the closed-tube format that avoids risks of carryover contaminations and the possibility of high throughput and automation.In this work, specific, sensitive and reliable analytical methods based on molecular techniques (PCR and NASBA) were developed for the detection, identification and quantification of foodborne pathogens (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and Salmonella spp.). Real-time PCR based methods were designed and optimised for each one of these target bacteria: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, and also a real-time PCR basedmethod previously described for Salmonella spp. was optimised and multicenter evaluated. In addition, an NASBA-based method was designed and optimised for the specific detection of M. avium subsp. paratuberculosis. The potential application of the NASBA technique for specific detection of viable M. avium subsp. paratuberculosis cells was also evaluated.All the amplification-based methods were 100 % specific and the sensitivity achieved proved to be fully suitable for further application in real food samples. Furthermore, specific pre-amplification procedures were developed and evaluated on meatproducts, seafood products, milk and water samples. Thus, fully specific and highly sensitive real-time PCR-based methods were developed for quantitative detection of L. monocytogenes on meat and meat products and on salmon and cold smoked salmon products; and for quantitative detection of M. avium subsp. paratuberculosis on water and milk samples. The M. avium subsp. paratuberculosis-specific real-time PCR-based method was also applied to evaluate the presence of this bacterium in the bowelof Crohn's disease patients using colonic biopsy specimens form affected and unaffected volunteers. In addition, fully specific and highly sensitive real-time NASBA-based methods were developed for detection of M. avium subsp. paratuberculosis on water and milk samples.In conclusion, this study reports selective and sensitive amplification-based assays for the quantitative detection of foodborne pathogens (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and) and for a quick and unambiguously identification of Salmonella spp. The assays had an excellent relative accuracy compared to microbiological reference methods and can be used for quantification of genomic DNA and also cell suspensions. Besides, in combination with sample pre-amplification treatments,they work with high efficiency for the quantitative analysis of the target bacteria. Thus, they could be a useful strategy for a quick and sensitive detection of foodborne pathogens in food products and which should be a useful addition to the range of diagnostic tools available for the study of these pathogens.

[ES] Las células mesenquimales estromales (MSC) poseen una serie de cualidades inmunológicas, pro-angiogénicas y regenerativas que las convierten en un excelente candidato para el tratamiento de diversas patologías. A pesar de las pruebas contundentes obtenidas en modelos preclínicos que demuestran la actividad terapéutica de las MSC, los ensayos clínicos no han podido mostrar hasta ahora un beneficio consistente, probablemente debido a deficiencias metodológicas y a la falta de estandarización, así como a la variabilidad genética intrínseca a los estudios en humanos. Debido a ello, ha sido necesario profundizar en los mecanismos responsables del beneficio terapéutico y rediseñar las estrategias clínicas. En los últimos años, se ha observado que la reparación tisular mediada por las MSC se produce de forma paracrina, y se ha constatado que las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por las MSC (EVMSC) son capaces de recapitular las propiedades inmunosupresoras de las células parentales. Además, las estrategias terapéuticas basadas en vesículas tienen grandes ventajas en términos de bioseguridad y producción en condiciones de grado clínico, reduciendo significativamente el coste de dichas terapias. Sin embargo, la dosis efectiva en grandes mamíferos, incluidos los humanos, es bastante elevada y la producción industrial de EVs se ve dificultada en parte, por la senescencia proliferativa que afecta a las MSC durante la expansión celular masiva. En este trabajo hemos intentado solventar los principales escollos de la terapia con EVs incrementando su potencial inmunosupresor y reduciendo por tanto la dosis efectiva. Este incremento se ha conseguido gracias a la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1-alpha y al desarrollo de un medio de acondicionamiento en cultivo basado en citoquinas. Además, la inmortalización de las células secretoras mediante la transducción del gen de la telomerasa humana ha permitido tanto la estandarización del producto como su producción a gran escala. La eficacia de estas EVs ha sido testada en diferentes poblaciones celulares in vitro: linfocitos T, monocitos, células Natural Killer, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos; y en dos modelos de ratón: hipersensibilidad retardada y colitis aguda inducida por TNBS. En conclusión, hemos desarrollado una fuente de EVs de larga duración que secreta grandes cantidades de vesículas con mayor capacidad inmunosupresora y antiinflamatoria, facilitando un producto terapéutico más estándar y fácil de producir para el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas. / [CA] Les cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) posseeixen una sèrie de qualitats immunològiques, pro-angiogèniques i regeneratives que les converteixen en un excel·lent candidat per al tractament de diverses patologies. Tot i les proves contundents obtingudes en models preclínics que demostren l'activitat terapèutica de les MSC, els assaigs clínics no han pogut mostrar fins ara un benefici consistent, probablement degut a deficiències metodològiques i a la manca d'estandardització, així com a la variabilitat genètica intrínseca als estudis en humans. A causa d'això, ha calgut aprofundir en els mecanismes responsables del benefici terapèutic i redissenyar les estratègies clíniques. En els últims anys, s'ha observat que la reparació tissular intervinguda per les MSC es produeix de forma paracrina, i s'ha constatat que les vesícules extracel·lulars (EVs) secretades per les MSC (EVMSC) són capaços de recapitular les propietats immunosupressores de les cèl·lules parentals. A més, les estratègies terapèutiques basades en vesícules tenen grans avantatges en termes de bioseguretat i producció en condicions de grau clínic, reduint significativament el cost d'aquestes teràpies. No obstant això, la dosi efectiva en grans mamífers, inclosos els humans, és bastant elevada i la producció industrial de les EVs es veu dificultada en part, per la senescència proliferativa que afecta les MSC durant l'expansió cel·lular massiva. En aquest treball hem intentat solucionar els principals esculls de la teràpia amb EVs incrementant el seu potencial immunosupressor i reduint per tant la dosi efectiva. Aquest increment s'ha aconseguit gràcies a la sobreexpressió del factor induïble per hipòxia 1-alpha i a el desenvolupament d'un mitjà de condicionament en cultiu basat en citoquines. A més, la immortalització de les cèl·lules secretores mitjançant la transducció del gen de la telomerasa humana ha permès tant l'estandardització del producte com la seva producció a gran escala. L'eficàcia d'aquestes EVs ha estat testada en diferents poblacions cel·lulars in vitro: limfòcits T, monòcits, cèl·lules Natural Killer, macròfags, cèl·lules endotelials i fibroblasts; i en dos models de ratolí: hipersensibilitat retardada i colitis aguda induïda per TNBS. En conclusió, hem desenvolupat una font de EVs de llarga durada que secreta grans quantitats de vesícules amb major capacitat immunosupressora i antiinflamatòria, facilitant un producte terapèutic més estàndard i fàcil de produir per al tractament de malalties inflamatòries inmunomediades. / [EN] Mesenchymal stromal cells (MSC) possess several immunological, pro-angiogenic and regenerative qualities that make them an excellent candidate for the treatment of various pathologies. Despite compelling evidence from preclinical models demonstrating the therapeutic activity of MSCs, clinical trials have so far failed to show consistent benefit, probably due to methodological shortcomings and lack of standardisation, as well as the genetic variability intrinsic to human studies. As a result, it has been necessary to further investigate the mechanisms responsible for therapeutic benefit and to redesign clinical strategies. In recent years, it has been observed that MSC-mediated tissue repair occurs in a paracrine pathway, and it has been confirmed that extracellular vesicles (EVs) secreted by MSC (EVMSC) are able to recapitulate the immunosuppressive properties of the parental cells. Moreover, vesicle-based therapeutic strategies have great advantages in terms of biosafety and production under clinical-grade conditions, significantly reducing the cost of such therapies. However, the effective dose in large mammals, including humans, is quite high and the industrial production of EVs is hampered in part by the proliferative senescence that affects MSC during massive cell expansion. In this work, we have attempted to overcome the main challenges of EVs therapy by increasing their immunosuppressive potential and thus reducing the effective dose. This increase has been achieved by overexpression of hypoxia-inducible factor 1-alpha and the development of a cytokine-based culture conditioning medium. In addition, immortalization of secretory cells by transduction with the human telomerase gene has allowed both product standardisation and large-scale production. The efficacy of these EVs has been tested in different cell populations in vitro: T lymphocytes, monocytes, Natural Killer cells, macrophages, endothelial cells and fibroblasts; and in two mouse models: delayed-type hypersensitivity and TNBS-induced acute colitis. In conclusion, we have developed a long-lasting source of EVs that secretes large amounts of vesicles with enhanced immunosuppressive and anti-inflammatory capacity, providing a more standard and easier-to-produce therapeutic product for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases. / Gómez Ferrer, M. (2022). Terapias innovadoras basadas en vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales modificadas genéticamente [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182560 / TESIS