Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire unicellulaire qui se développe à l’intérieur d’une cellule hôte. Chez les parasites Apicomplexa, peu de chose sont connues sur la N-glycosylation. Nous avons mis en évidence la présence de N-glycannes parasitaires totaux et démontré que ces N-glycannes sont de type riche en mannose. En utilisant une lectine, nous avons purifié de nombreuses N-glycoprotéines parasitaires intervenant majoritairement dans les mécanismes de motilité, d’invasion et de trafic intracellulaire. Nous avons démontré qu’un traitement par une drogue inhibant la synthèse des N-glycannes perturbe plusieurs processus biologiques. Nous avons étudié les fonctions biologiques des N-glycannes de TgGAP50 qui appartient au glidéosome, un moteur impliqué dans la motilité du parasite. Nous avons déterminé que TgGAP50 porte des N-glycannes hétérogènes riches en mannoses. Nous avons montré que la N-glycosylation de TgGAP50 est impliquée dans le trafic de la protéine et dans l’interaction avec les partenaires du glidéosome. Nos travaux démontrent que T. gondii est capable de synthétiser des N-glycoprotéines et que les N-glycannes sont potentiellement impliqués dans le trafic des protéines et dans les interactions moléculaires importantes pour la motilité et l’invasion des cellules hôtes par le parasite. / The apicomplexan parasite Toxoplasma gondii penetrates virtually any kind of mammalian cell using proteins released from late secretory organelles and a unique form of gliding motility. How T. gondii glycosylated proteins mediate host-parasite interactions remains elusive. Here, we report comprehensive proteomics and glycomics analyses showing that several key components required for interactions between T. gondii and host cells are N-glycosylated. Detailed structural characterization confirmed that N-glycans from T. gondii total protein extracts consist of oligomannosidic and paucimannosidic sugars, which are rarely present on mature eukaryotic glycoproteins. In situ fluorescence using concanavalin A and Pisum sativum agglutinin predominantly stained the entire parasite body. Visualization of Toxoplasma glycoproteins purified by affinity chromatography identified components involved in gliding motility, moving junction, and other additional functions. Importantly, tunicamycin-treated parasites were considerably reduced in motility, host cell invasion, and growth. In addition, we show that all three potential N-glycosylated sites of GAP50 are occupied by unusual N-glycan structures with terminal glucoses. Using site-directed mutagenesis, we demonstrate that N-glycosylation is a prerequisite for GAP50 transport into the inner membrane complex. Assembly of key partners into gliding complex by unglycosylated GAP50 and parasite motility are severely impaired. Collectively, these results provide the first molecular description of T. gondii N-glycosylation functions that are vital for parasite motility and host cell entry.

Toxoplasma gondii, l'agent de la toxoplasmose, représente un modèle appartenant aux parasites Apicomplexa, phylum dans lequel on retrouve Plasmodium falciparum, l'agent causal du paludisme, et de nombreux agents opportunistes dangereux. Les parasites de ce phylum possèdent la même organisation avec des organites situés à l'apex, spécialisés dans l'interaction hôte-pathogène et qui sont cruciaux pour permettre l'infection de l'hôte: les rhoptries et micronèmes. Les protéines contenues dans ces organites sécrétoires sont acheminées via le système de type endolysosomal. Toutefois, les récepteurs qui jouent un rôle clé dans le tri des protéines et la biogenèse des organites apicaux restaient à identifier. La sortiline est un récepteur transmembranaire de type I, plus connu chez l'Homme dans le tri, le transport des protéines et ses rôles dans la maladie de Parkinson, d'Alzheimer ou du diabète ont largement été décrits. Nous avons déterminé que l'homologue de la sortiline chez Toxoplasma TgSORTLR pour «Toxoplasma gondii Sortiline Like Receptor» est localisé au niveau de l'appareil de Golgi et du réseau post-Golgien. TgSORTLR se lie spécifiquement aux protéines de rhoptries et de micronèmes à l’aide du domaine N-terminus, probablement au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons montré que le domaine C-terminus est déterminant pour la localisation de TgSORTLR et que l'expression d'une version tronquée de la protéine dépourvue du domaine C-terminus induit la complète délocalisation des protéines de rhoptries et de micronèmes. Nous avons également identifié les protéines cytosoliques qui interagissent avec le domaine C-terminus de TgSORTLR et démontré que ces protéines cytoplasmiques sont pour la plupart connues pour leurs rôles importants dans le transport antérograde ou rétrograde des vésicules du trafic intracellulaire. L’absence de TgSORTLR obtenue grâce à une stratégie de «knock-out » conditionnel entraîne non seulement une totale délocalisation des protéines de rhoptries et de micronèmes mais aussi à une disparition des organites apicaux, ce qui conduit à la forte atténuation de la virulence du parasite chez la souris et surtout à l'absence complète de symptômes toxoplasmiques. Des expériences de complémentations réalisées dans la souche dépourvue de TgSORTLR ont montré que l’extrémité N-terminus (acides aminés 39 à 202) de TgSORTLR est également nécessaire pour sa localisation correcte et pour ses fonctions de récepteur intracellulaire chez T. gondii. Enfin, nous avons caractérisé, par des techniques de « knock in » ou remplacement du gène endogène par une copie étiqueté avec l’épitope HA, puis montré que des protéines homologues de μ1-adaptine, Sec23, Vps9, Vps26 et Vps35 de T. gondii co-localisent et se fixent spécifiquement à TgSORTLR. Ces résultats récents confirment que l'extrémité C- terminus et cytoplasmique du récepteur TgSORTLR se comporte d'une manière similaire aux sortilines des cellules de mammifère. L’étude de ces partenaires de TgSORTLR nous permet de mieux comprendre le trafic de TgSORTLR, de reconstituer en partie le système endolysosomal et son rôle dans le transport et la biogenèse des organites vitaux de T. gondii. / Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis belongs to the phylum named Apicomplexa that also contains Plasmodium falciparum, the causative agent of malaria and others parasites such as Cryptosporidium or Eimeria. Apicomplexan parasites are uniquely characterized by specific organelles, rhoptries and micronemes, which are located at the apical end of the parasite. These organelles are involved in the control of host-pathogen interactions. The proteins in these secretory organelles are trafficked through the endolysosomal system. However, the receptors that play key roles in protein sorting and biogenesis of these apical organelles remain to be identified. Sortilin is a type I transmembrane receptor known in humans for protein sorting and trafficking. Here, we report that the homologue of sortilin in T. gondii designated TgSORTLR for “Toxoplasma gondii SORTilin Like Receptor” is localized to Golgi and post-Golgi compartments and transports proteins into rhoptries and micronemes via their specific interactions with its luminal domain. We demonstrate that the C-terminus of TgSORTLR is also important for its subcellular localization through binding to cytosolic components of vesicular trafficking proteins known to be involved in anterograde and retrograde transports. The depletion of TgSORTLR using conditional knock-out strategy causes a complete rmis-localization of proteins of both rhoptries and micronemes, leading to the loss of these apical organelles. These mutants display a strong attenuation of the parasite virulence in mice with the absence of acute toxoplasmosis symptoms. Complementation of the strain lacking TgSORTLR showed that N-terminal region between 39-202 amino acids indicated that the N-terminus, similarly to the C-terminus is essential for its correct localization. We conclude that the full-length TgSORTLR protein is required for its biological functions as intracellular sorting receptor in T. gondii.

Les industries de traitement du phosphate dans le but de produire des engrais phosphatés, très présentes dans la zone côtière sud du Grand Sfax en Tunisie, sont à l’origine d’émissions atmosphériques et de rejets de déchets ; en l’occurrence du phosphogypse chargés de contaminants métalliques. La contamination des sols qui en résulte est une contamination persistante. Dans le but de mieux comprendre les effets de la contamination par les métaux engendrés par cette activité industrielle, une attention particulière a été portée sur une espèce d’importance économique, le palmier dattier Phoenix dactylifera. Le présent travail avait pour objectifs d'étudier la germination des graines et la variété Deglet Nour dans différents contextes de contamination métallique aux moyens de techniques de biotechnologie végétale impliquant la recherche in silico et la culture in vitro de vitroplant et à l’aide de deux approches. Une approche individuelle intégrative qui s’est servie de nombreuses mesures de biomarqueurs morphologiques et biochimiques chez l’espèce étudiée exposée à divers stress métalliques. Une deuxième approche, plus moléculaire et mécanistique avait pour but d’identifier des gènes qui répondent à une exposition au Cd, ou au Cu, ou au Cr capables de prédire les voies métaboliques impliquées. Cette seconde approche, basée sur l’exploitation d’une banque de cDNA de la variété Deglet Nour a permis l’identification de gènes de chélateurs et transporteurs de métaux. Le suivi des niveaux d’expression de ces gènes chez des plantes placées dans des conditions d’expositions métalliques variées a permis de mieux comprendre les mécanismes de détoxication des métaux mis en œuvre. / The phosphate processing industries for the production of phosphate fertilizers, which are present in the southern coastal zone of the Grand Sfax in Tunisia, caused atmospheric emissions and waste discharges i.e., phosphogypsum loaded with metal contaminants. The resulting contamination of soils is a persistent contamination. In order to better understand the effects of metal contamination caused by this industrial activity and ultimately to propose measures for the rehabilitation and/or ecological restoration of the sites but also because of its economic importance, particular attention has been paid on the palm date (Phoenix dactylifera). The aim of this work was to study seed germination and growth of the Deglet Nour variety in various metal contamination contexts by means of plant biotechnology techniques involving in silico research and in vitro culture of vitroplant. Two approaches have been performed. An individual integrative approach that used numerous measurements of morphological and biochemical biomarkers in date palm exposed to various metal stresses. A second approach, more molecular and mechanistic, was performed to identify genes that respond when plants are exposed to Cd, Cu, or Cr which help for the prediction of the metabolic pathways that are affected by contaminants or involved in detoxification processes. This second approach, based on the exploitation of a cDNA library of the Deglet Nour variety, allowed the identification of genes coding for metal chelators and transporters. Monitoring of the levels of expression of these genes made it possible to better understand the detoxification mechanisms of metals in the palm date.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le glioblastome multiforme (GBM) est l'une des tumeurs des plus létales qui soient. En dépit du traitement optimal actuellement disponible, la survie médiane des patients atteints d'un GBM n'atteint que 14,6 mois et n'a pu être améliorée de façon significative au cours des dernières décennies. La barrière hématoencéphalique endigue l'entrée de la majorité des xénobiotiques au système nerveux central et handicape sérieusement l'efficacité de la chimiothérapie. Une panoplie de stratagèmes fut développée afin de contourner cet obstacle majeur et l'emploi de liposomes comme véhicules recèle un grand potentiel. Nous avons donc entrepris l'élaboration d'une formulation liposomale dédiée à cette fin. Une formulation de base, inspirée de la littérature, a d'abord été modifiée de façon à produire plusieurs formulations dérivées. Le criblage de ces dernières a permis d'identifier une formulation candidate ainsi que des propriétés favorables à la lipofection des lignées cellulaires gliales F98 et U-118 MG. L'internalisation cellulaire des liposomes et la libération cytosolique de leur chargement hydrophile ont été évaluées quantitativement en cytométrie de flux. La formulation cationique, sensible au pH et dépourvue de polyéthylène glycol (PEG) s'est avérée la plus performante. Chez les deux lignées cellulaires, les liposomes de cette formulation vedette ont accédé au milieu intracellulaire entre 4 et 6 h, et y ont libéré leur cargaison sur plus de 24 h. Le balayage de cellules F98 et U-118 MG lipofectées en microscopie confocale a confirmé la libération intracellulaire du contenu des liposomes à 6 h, et a dévoilé un patron d'internalisation typique à l'endocytose. Enfin, cette formulation liposomale vedette s'est avérée très peu cytotoxique et aucun effet cytostatique n'a été remarqué chez ces deux lignées. La performance inférieure de la formulation de base et des autres dérivés indique qu'une réduction de la fluidité membranaire, l'inclusion de polymères PEG ainsi que l'absence combinée d'une charge cationique et de la sensibilité au pH ont des conséquences délétères sur la capacité de lipofection des liposomes. Ces résultats soulignent avec emphase l'importance d'adapter la composition lipidique des liposomes au type cellulaire ciblé et corroborent le potentiel des liposomes cationiques et sensibles au pH pour l'acheminement intracellulaire de xénobiotiques. Des études in vivo permettront d'établir le potentiel de la formulation liposomale vedette dans la thérapie des GBM.

In the past fifteen years, ubiquitin has emerged as a central regulator of membrane protein trafficking. In this context, covalent attachment of this small protein to lysine residues of cargo proteins, a reversible modification termed ubiquitylation, provides a signal for their targeting to the vacuolar/lysosomal lumen where they are degraded, both in yeast and higher eukaryotes. Ubiquitylation is also used as a means of controlling the function of specific proteins in several trafficking machineries. The role of lipids - and in particular of membrane domains named lipid rafts - in controlling the intracellular trafficking of membrane proteins has also been the subject of intense investigation in recent years. One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose intracellular trafficking has been extensively studied is the general amino acid permease Gap1. Yet some aspects of the function of ubiquitin in the nitrogen-dependent control of this protein remain controversial. Moreover, the potential role of lipid rafts in regulating the functional properties and traffic of the Gap1 permease had not been investigated before this thesis work. The first part of our work readdresses the role of Gap1 ubiquitylation, and more precisely of the modification of the permease with polyubiquitin chains linked through the lysine 63 of ubiquitin, in controlling the fate of this protein in the secretory pathway. Our observations indicate that nitrogen-induced ubiquitylation of newly synthesised Gap1 occurs in the trans-Golgi complex. However, contrary to the generally accepted view, this modification is not necessary for the permease to exit this compartment en route to the endosome but only for its subsequent targeting to the vacuolar lumen via the multivesicular body (MVB) pathway. Our results also provide evidence that K63-linked polyubiquitylation is important mostly at the late endosomal level, for proper sorting of Gap1 into the MVB pathway, whether the permease comes from the cell surface by endocytosis or directly from the secretory pathway. In the second part of this work, we present a set of data providing novel insights into the controversial question of the exact nature of lipid rafts in yeast. We first showed that the Gap1 permease is associated with detergent-resistant membranes (DRMs) - the proposed biochemical equivalent of lipid rafts - when it is located at the cell surface. Our data further suggest that this may be true for most if not all yeast plasma membrane proteins. Moreover, we found that Gap1 production must be coupled to de novo synthesis of sphingolipids (SLs), major constituents of rafts, in order for the newly synthesised permease to be correctly folded, active, associated with DRMs, and stable at the cell surface. We propose a model where Gap1 would associate with newly synthesised SLs during its biogenesis and/or secretion, this association shaping the permease into its native conformation and ensuring its incorporation and stabilisation in specific lipid domains at the plasma membrane. Failure of Gap1 to acquire this lipidic microenvironment in turns leads to its ubiquitin-dependent degradation by a quality-control mechanism. This model might be valid for many other plasma membrane proteins and might account for their lateral distribution between distinct membrane domains.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.