L'invasion cellulaire est un processus basé sur la dynamique des invadosomes, qui sont desstructures acto-adhesives capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Lesinvadosomes sont composés d'un coeur riche en actine-F entouré par un assemblage desprotéines d'adhésion conduisant à la dégradation de la matrice extracellulaire par lerecrutement et la sécrétion des protéases. Les cellules MEF exprimantes la formeconstitutivement active de la kinase Src (SrcY527F) forment des invadosomes quis'organisent sous forme d'anneaux ou rosettes. Paxilline et hic-5 (une protéine homologue àla paxilline) ont des rôles spécifiques dans la morphologie cellulaire et la plasticité pendantl'invasion cellulaire. La structure de ces deux protéines se caractérise par la présence dedomaines LIM dans la partie C-terminale et de motifs LD dans la partie N-terminale. Cettesimilarité suggère que ces protéines peuvent avoir des fonctions redondantes. L'importance dela famille des protéines paxillines dans la formation des invadosomes a été examiné en tentantd'induire des invadosomes via l'expression de la forme constitutivement active de la kinaseSrc (SrcY527F) dans des cellules déplétées en paxilline et hic-5 (cellules pax-/- et déplétées enhic-5 par shRNA). La formation des invadosomes a été totalement bloquéequand l'expression de ces deux protéines a été diminuée de manière significativesimultanément indiquant leur redondance fonctionnelle. La ré-expression de nombreuxmutants de la paxilline dans ce contexte cellulaire a permis de montrer que les domaines LIMde paxilline n'étaient pas nécessaires pour la formation de l'anneau des invadosomes. Aucontraire, ces études de structure-fonctions ont permis de mettre en évidence le rôle essentieldes motifs LD3 et LD5 considérablement dans l'assemblage des rosettes. En outre, l'ordreprécis de chaque LD dans la molécule de paxilline est essentiel pour leur travail coopératifdans la régulation des invadosomes. Après avoir montré la redondance fonctionnelle entrepaxillin et hic-5, nous avons voulu déterminer leurs fonctions spécifiques. Pour cela,différents traitements siRNAs nous ont permis de diminuer spécifiquement l'expression depaxillin et/ou hic-5 dans des cellules formant des invadosomes. La déplétion rapide de lapaxilline a réduit la formation des rosettes alors que celle de hic-5 a affecté de manièreimportante la dégradation de la matrice extracellulaire. En effet, l'identification despartenaires spécifiques de paxilline et hic-5 à révélé que cette dernière interagissaitspécifiquement avec IQGAP1. Cette protéine est un facteur essentiel pour le recrutement del'exocyst, un complexe régulant la sécrétion locale de métalloprotéases dans lesinvadosomes. En conclusion, il apparaît que l'action complémentaire de la paxilline et hic-5 aun rôle essentiel dans la régulation des fonctions cellulaires assurées par les invadosomes. / Cellular invasion is based on invadosome dynamics where acto-adhesive machinery iscoupled with extracellular matrix proteolysis. Each invadosome unit is composed by a denseF-actin core surrounded by a ring of adhesion molecules that localizes intense ECMdegradation activity via the recruitment and secretion of lytic enzymes. Invadosomes in MEFstransformed with an activated form of the Src kinase (SrcY527F) auto-assemble into circularmeta-structures called rings or rosettes. Paxillin and the closely related family member hic-5(hydrogen peroxide inducible clone 5) have been recently identified as critical determinants ofcell morphology and plasticity during cell invasion with distinct signaling functions.However, the two proteins have a similar overall domain structure, including amino-terminalLD motifs and carboxyl-terminal LIM domains suggesting overlapping or redundantfunctions. We examined the importance of this class of proteins in invadosome formation, byexpressing SrcY527F in pax-/- cells depleted or not of hic-5. Only when the expression of bothproteins was significantly decreased, invadosome formation was blocked indicating theirfunctional redundancy. Importantly, LIM domain of paxillin was dispensable for ringformation whereas individual depletion of LD3 and LD5 motifs dramatically reducedinvadosome rosette assembly. Furthermore, the precise order of each LD in the paxillin'smolecule was necessary to allow their cooperativity during invadosome formation. Beyondtheir redundancy, their distinct roles in invadosomes were assessed via siRNA strategy aimingat the acute depletion of each molecule. Rapid depletion of paxillin reduced invadosome ringformation whereas hic-5 silencing dramatically affected extracellular matrix degradation. Hic-5 role in ECM degradation was enhanced by the fact that it was found to specifically interactwith IQGAP1, a CDC42- effector that is essential to recruit the exocyst complex ininvadosomes. In summary, the functional redundancy of paxillin and hic-5 suggests anextensive cross-talk between these two closely related proteins in the regulation ofinvadosome-based cellular functions.

Les invadosomes sont des structures d’invasion plastiques et dynamiques qui interagissent avec leur microenvironnement. Ils possèdent différentes fonctions telles que l’adhésion, la mécanotransduction ou encore la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC). Mon travail de thèse s’est concentré sur i) l’étude globale de la composition des invadosomes par spectrométrie de masse et ii) sur l’impact d’éléments du microenvironnement dans la formation de ces structures d’invasion.i) Les invadosomes sont des complexes multi-protéiques dont tous les partenaires ne sont pas encore totalement identifiés. Au laboratoire, une nouvelle approche combinant la microdissection laser suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, a été développée. Cette technique a été appliquée à l’étude des invadosomes rosettes. Nous avons ainsi mis en évidence une nouvelle fonction associée aux invadosomes, en les définissants comme des sites actifs de traduction protéique. Les invadosomes cependant, sont des structures plastiques dont la formation et la morphologie sont modulées par différents éléments de l’environnement. Nous souhaitons à présent déterminer les partenaires communs et spécifiques entre les différentes organisations des invadosomes afin d’identifier les molécules impliquées dans cette plasticité.ii) La formation des invadosomes peut être induite par différents éléments du microenvironnement comme des facteurs de croissance ou encore la composition et la rigidité de la MEC. Le TGF-β est un facteur de croissance impliqué dans la formation des invadosomes, dans la promotion de la rigidité de la MEC et dans la fibrose hépatique pouvant mener au développement du carcinome hépatocellulaire. Nous avons alors étudié l’impact du TGF-β dans la formation des invadosomes linéaires en contexte de collagène de type I. Nous montrons que le TGF-β module la machinerie moléculaire associée aux invadosomes linéaires en induisant l’expression de DDR1 et MT1-MMP, ainsi que des éléments impliqués dans leur formation tels que le collagène I. Ces modulations sont dépendantes de la voie de signalisation canonique du TGF-β passant par Smad4 et favorisent la formation et l’activité des invadosomes linéaires. De plus, le TGF-β induit une surexpression de la LOXL2 qui est une enzyme de réticulation du collagène, augmentant la rigidité de la matrice ce qui favorise la formation des invadosomes.Les résultats obtenus durant ma thèse auront permis de mieux définir les éléments impliqués dans la composition et la formation des invadosomes. / Invadosomes are plastic and dynamic invasive structures interacting with the microenvironement. Those structures are involved in several functions as adhesion, mecanotransduction and degradation of the extracellular matrix (ECM). My PhD work focuses on i) the study of the invadosomes composition by mass spectrometry and ii) on the impact of microenvironmental elements on the formation of those invasive structures.i) Invadosomes are multi-protein complexes in which all partners are not yet fully identified. In the laboratory, a new approach combining laser micordissection followed by mass spectrometry analysis was developed. This technique has been applied to the study of invadosome rosettes. We have demontrasted a new function associated with indosomes, defining them as active sites of protein translation. Invadosomes, however, are plastic structures whose formation and morphology are modulated by different elements of the environment. We now wish to determine the common and specific partners between the different invadosomes organizations in order to identify the molecules involved in their plasticity.The invadosomes formation can be induced by different elements of the microenvironment such as growth factors or the composition and rigidity of the ECM. TGF-β is a growth factor involved in the invadosomes formation, in the ECM rigidity and in liver fibrosis that can lead to the development of hepatocellular carcinoma. We have studied the impact of TGF-β in the formation of linear invadosomes in the context of type I collagen. We show that TGF-β modulates the molecular machinery associated with linear invadosomes by inducing the expression of DDR1 and MT1-MMP, as well as elements involved in their formation, such as collagen I. These modulations are dependent on the TGF-β canonical signaling pathway through Smad4 and promote the formation and activity of linear invadosomes. In addition, TGF-β induces an overexpression of LOXL2, which is a collagen cross-linking enzyme, increasing the matrix stiffness and promotes the formation of these structures.Taken together, these results enabled us to better define the elements involved in the composition and formation of invadosomes.

L'étude des mécanismes moléculaires de la carcinogenèse hépatique a montré l'implication de la RhoGTPase, Rnd3/RhoE. La protéine Rnd3 est sous-exprimée dans le carcinome hépatocellulaire et la diminution de son expression engendre, in vitro, une augmentation de l'invasion des hépatocytes tumoraux. Sur la base de ces travaux, ce projet de thèse s'est décomposé en deux axes. Le premier axe a été d'étudier le rôle de Rnd3 dans la carcinogenèse ainsi que dans la physiologie hépatique in vivo. Ce projet a débuté par la génération d'un modèle murin présentant un KO conditionnel ethépato-spécifique de Rnd3 {KORnd3). L'utilisation de plusieurs stratégies s'est révélée nécessairepour obtenir une extinction protéique de Rnd3 dans la majorité des hépatocytes chez les souris KO. Après hépatectomie des deux tiers, les premiers résultats montrent un retard de régénération hépatique chez les souris KORnd3. En ce qui concerne la carcinogenèse hépatique, nous avons mis en place un modèle de carcinogène chimique en utilisant le diéthylnitrosamine et un modèle de carcinogénèse spontanée chez les animaux KORnd3Hep. Le deuxième axe a porté sur l'étude des invadosomes, structures d'actine impliquées dans l'invasion cellulaire. Nous avons établi une signature minimum pour les invadosomes, impliquant la GTPase Cdc42 et la protéine d'échafaudage TksS. Nos résultats suggèrent également une implication de Rnd3 dans la fonction de dégradation des invadosomes. Ce travail de thèse a ainsi permis d'apporter de nouveaux outils et de nouvellespistes quant à l'implication de Rnd3 dans la physiopathologie hépatique et dans l'invasion cellulaire. / The study of the molecular mechanisms involved in hepatic carcinogenesis revealed the significant down-regulation of the RhoGTPase Rnd3/RhoE in hepatocellular carcinoma as compared to non- tumor liver. Rnd3 down-regulation provides an invasive advantage to tumor hepatocytes suggesting that RND3 might represent a metastasis suppressor gene in hepatocellular carcinoma. This PhD work was divided in two axes. We first studied the role of Rnd3 in the mouse liver using carcinogenesis and liver regeneration protocols. We thus generated conditional and liver specific Rnd3 KO mice (KORnd3Hep). The first results obtained after partial hepatectomy suggest a delay in liver regeneration for the KORnd3Hep mice. We also developed a carcinogenesis strategy in KORnd3Hep mice using diethylnitrosamine treatment. The second axis focused on invadosomes, which are actin-based structures involved in cell invasion. We have determined a minimal and universal molecular signaturefor functional invadosomes, which involves the RhoGTPase Cdc42 and the adaptor protein TksS. We also highlighted the role of Rnd3 in invadosome degradation. ln conclusion, this work provides new tools and new insights on Rnd3 function in hepatic physiopathology and cellular invasion.

<p>Basement membrane (BM) is the thin, dense, highly cross-linked form of extracellular matrix that underlies all epithelia and endothelia, as well as surrounds muscle, nerve and fat. These sheet-like networks function as physiological barriers to maintain tissue homeostasis. During normal developmental processes and immune surveillance, cells invade through BM to establish tissues and fight infection. Similarly, metastatic cancer cells are thought to co-opt normal programs for BM transmigration as they spread from primary tumors and colonize distant tissues. The difficulty of visualizing cell-BM interactions during invasion in vivo has left the cellular and molecular mechanisms used to breach BM undefined. Specialized F-actin-rich matrix-degrading membrane protrusions, termed invadosomes, have been described in cultured invasive cell lines for more 30 years. Invadosomes are hypothesized to mediate BM penetration during cancer metastasis. Despite promising advances in intravital imaging technologies, however, invadosomes have yet to be observed in cells transmigrating BM in vivo, leaving their physiological relevance unclear. Anchor cell invasion in C. elegans is a simple in vivo model of cell invasion that allows for combined visual and genetic analysis of BM transmigration. In this dissertation I develop high-resolution time-lapse imaging approaches to understand the dynamic interactions that occur at the AC-BM interface during invasion. Through the course of this work we identify an integrin-based mechanism that polarizes the AC towards the BM. We further discover protrusive F-actin-based invadosome structures that mediate BM breach during anchor cell (AC) invasion. We find that in most cases only one or two invadosomes penetrate the BM and then transform into an invasive protrusion that guides the AC through a single BM gap. Using genetics and quantitative single-cell image analysis we characterize several molecular regulators of invadosome formation in vivo. Our findings establish an essential role for invadosomes during BM transmigration in vivo, and support the idea that these structures are a core, conserved element of a normal invasive cellular strategy activated during cancer metastasis.</p> / Dissertation