La peau est un organe particulier de l'organisme dont la fonction principale est un rôle de protection vis-à-vis du milieu extérieur. Cette fonction est assurée grâce à la structure du tissu cutané en trois couches (épiderme, derme, hypoderme). Le derme est responsable de la résistance et de la souplesse de la peau. Le composant moléculaire majeur du derme est le collagène de type I, qui est fortement altéré au cours du vieillissement chronologique. Dans ce contexte, notre étude a pour objectif d'évaluer les modifications moléculaires du collagène dermique associées au vieillissement cutané par spectroscopies vibrationnelles (diffusion Raman et absorption infrarouge). Par déconvolution de la bande Amide I du signal Raman, nous avons mis en évidence, en fonction de l'âge de la peau, des modifications au niveau des interactions entre le collagène et les molécules d'eau ; ce qui reflète un espacement croissant des faisceaux de fibres de collagène au cours du vieillissement. En micro-imagerie infrarouge polarisée, le ratio des bandes Amide I/ Amide II permet d'évaluer l'orientation des fibres de collagène qui deviennent parallèles à la surface de la peau lors du vieillissement. Des expérimentations préliminaires ont également montré la possibilité de localiser sans marquage la jonction dermo-épidermique de la peau grâce aux caractéristiques spectrales du collagène de type IV. Une analyse ciblée de cette structure nécessite de développer de nouveaux instruments basés sur la spectroscopie en champ proche (Tip Enhanced Raman Scattering, NanoIR) ; ce qui devrait permettre de suivre les altérations du collagène de type IV au cours du vieillissement cutané. / Skin is a particular organ of the body whose the main function is a protective role towards the external environment. This function is provided by the structure of skin tissues in three layers (epidermis, dermis, hypodermis). The dermis is responsible for the strength and elasticity of the skin. The major molecular component of the dermis is the type I collagen, which is strongly altered during chronological aging. In this context, our study aims at evaluating the molecular modifications of the dermal collagen associated with skin aging by vibrational spectroscopy (Raman diffusion and infrared absorption). Using curve-fitting of Raman Amide I band, modifications in the interactions between collagen and water molecules were highlighted depending of the donor age. Such result reflects an increasing spacing of the collagen fiber bundles during aging. In addition, the collagen fibers orientation can be evaluated from the amide I/ amide II ratio calculated in polarized infrared micro-imaging. It appeared that the collagen fibers become orientated parallel to the skin surface with aging. Preliminary experiments showed also the ability to localize in a label-free manner the dermo-epidermal junction of the skin using the spectral characteristics of type IV collagen. A precise analysis of this structure requires the development of new instruments based on near-field spectroscopy (Tip Enhanced Raman Scattering, NanoIR); which could permit to follow the collagen IV alterations during skin aging.

Contexte : l'aldostérone (Aldo) est impliquée dans la rigidité artérielle et l'insuffisance cardiaque (IC), mais les mécanismes sous-jacents restent méconnus. La galectine-3 (Gal-3), une lectine se liant aux bêta-galactoside, joue un rôle important dans la fibrose et l'IC. Dans cette étude, nous avons recherché si la Gal-3 était impliquée dans la fibrose vasculaire induite par l'Aldo. Méthodes et résultats : Des cellules musculaires lisses vasculaires de rat (CMLVs) ont été stimulées avec de l'Aldo en combinaison avec des antagonistes du récepteur minéralocorticoïde (MR) ou des inhibiteurs de la Gal-3. L'Aldo régule l'expression de la Gal-3 via le MR dans les CMLVs. De plus, la surexpression de la Gal-3 augmente spécifiquement la synthèse de collagène de type I. Les inhibiteurs de la Gal-3 ou sa sous-expression (siRNA) bloquent la synthèse de collagène de type I induite par l'Aldo. Des rats ont été traités avec de l'Aldo + sel combiné avec du spironolactone ou de la pectine de citron modifiée (MCP) pendant 3 semaines. Les rats hypertensifs traités à l'Aldo ont présenté une hypertrophie vasculaire, une fibrose et une augmentation de l'expression aortique de Gal-3. Les traitements avec le spironolactone ou le MCP préviennent tous ces effets. Des souris sauvages (WT) et mutées pour la Gal-3 (KO) ont été traitées avec de l'Aldo pendant 6 heures. Le bolus d'Aldo augmente l'expression de la Gal-3 et du collagène de type I dans l'aorte des souris WT alors qu'aucun changement ne se produit dans les souris KO pour la Gal-3. Conclusions : Nos donnés indiquent que la Gal-3 est indispensable à la réponse fibrotique de l'Aldo dans les CMLVs in vitro et in vivo, suggérant un rôle clef pour la Gal-3 dans la fibrose vasculaire / Background. Aldosterone (Aldo) is involved in arterial stiffness and heart failure (HF), but the mechanisms have remained unclear. Galectin-3 (Gal-3), a beta-galactoside-binding lectin, plays an important role in fibrosis and HF. We here investigated whether Gal-3 is involved in Aldo-induced vascular fibrosis. Methods and Results. Rat vascular smooth muscle cells (VSMCs) were stimulated with Aldo combined with mineralocorticoid receptor (MR) antagonists and Gal-3 inhibitors. Aldo upregulated Gal-3 expression via MR in VSMCs. Moreover, Gal-3 over-expression specifically enhanced collagen type I synthesis. Gal-3 inhibitors or Gal-3 silencing (siRNA) blocked Aldo-induced collagen type I synthesis. Rats were treated with Aldo-salt combined with spironolactone or modified citrus pectin (MCP) for 3 weeks. Hypertensive Aldo-treated rats presented vascular hypertrophy, fibrosis and increased aortic Gal-3 expression. Spironolactone or MCP treatment reversed all the above effects. Wild type (WT) and Gal-3 knock-out (KO) mice were treated with Aldo for 6 hours. Aldo bolus increased aortic Gal-3 and collagen type I expression in WT mice whereas no changes occurred in Gal-3 KO mice. Conclusions. Our data indicate that Gal-3 is required for the fibrotic response to Aldo in VSMCs in vitro and in vivo, suggesting a key role for Gal-3 in vascular fibrosis

Le microenvironnement tumoral via les macromolécules matricielles est connu pour jouer un rôle clé dans la réponse des cellules cancéreuses à la chimiothérapie en favorisant leur survie et leur prolifération. L'impact du collagène de type I, protéine matricielle majeure du microenvironnement, a été évalué au niveau des capacités migratoires des cellules tumorales et de leur réponse aux agents anticancéreux, doxorubicine et metformine. Cette approche a étémenée chez des cellules humaines HT1080 hautement invasives au moyen de systèmes de culture par coating 2D ou en matrice 3D. Les effets de modifications post-traductionnelles du collagène comme la carbamylation et de la glycation ont été également étudiées. Les résultats montrent que le collagène 3D inhibe l'activité anti-migratoire de la doxorubicine. Cette protection met en jeuune préservation des niveaux d'activation de FAK et RhoA impliquées dans la formation des fibres de stress d'actine et des plaques d'adhésion focales. Le collagène glyqué 2D et dans une moindre mesure le carbamylé inhibent l'adhésion, la migration des cellules tumorales et désorganisent leur cytosquelette d'actine via des modifications de distribution de la vinculine, de FAK et des intégrines 1. Cet impact de la glycation a été aussi mis en évidence en matrice 3D après modification du processus de glycation. Enfin, la glycation exerce un effet protecteur vis-àvis des capacités anti-prolifératives et anti-migratoires de la doxorubicine et de la metformine. En conclusion, nous mettons en évidence une nouvelle forme de résistance CAM-DR dirigée contre l'activité anti-invasive de médicaments ; cet effet pouvant être généré par une protéine matricielle native ou modifiée lors de situations physiopathologiques associées au cancer. / The tumor microenvironment via the extracellular matrix plays an important role in cancer cell response to chemotherapy by promoting their survival and proliferation. In this work, we studied the impact of collagen type I, a major matrix protein of tumor microenvironment, on the migration capacities of tumor cells and on their response to anticancer drugs such as doxorubicin and metformin. This approach was performed with the highly invasive human cell line HT1080,by means of 2D coating or 3D matrix cell culture systems. The effects of collagen posttranslational modifications such as carbamylation and glycation were also assessed. The results show that the 3D collagen inhibits the anti-migratory effect of doxorubicin. This protection is carried out through the preservation of the activation states of FAK and RhoA, which are involved in the formation of actin stress fibers and focal adhesions. On 2D coating, the glycated collagen and at a lesser extent the carbamylated one decrease the adhesion, the migration oftumor cells and, disorganize the actin cytoskeleton via a modified distribution of vinculine, FAK and beta1 integrins. This impact is also demonstrated by using 3D matrices, after adaptation of the glycation process. In addition, we reported that the glycated collagen protects against the antiproliferative and the anti-migratory effects of doxorubicin and metformin. In conclusion, we highlighted a new form of CAM-DR resistance that targets the drugs anti-invasive activity. This impact could be induced by the native form of matrix proteins or the modified one found inpathological situations which are associated to cancer.

Les cellules cancéreuses sont confrontées à un microenvironnement capable de réguler le processus de progression tumorale. Le collagène de type I, un des facteurs d’adhésion de ce microenvironnement, joue un rôle important dans la régulation de la prolifération cellulaire en particulier. Au cours du vieillissement, cette protéine subit des modifications qui vont avoir un effet délétère sur son état fibrillaire, propriété indispensable pour activer les récepteurs DDR1 et DDR2. Le but de ce travail est d’étudier les effets du vieillissement du collagène de type I sur la prolifération et l’apoptose des cellules tumorales. Dans la première partie, nous montrons que le collagène adulte inhibe la prolifération des cellules de fibrosarcome humain HT-1080, comparé au collagène âgé. Ce processus est observé uniquement en matrice 3D. Le collagène adulte induit une activation plus importante de DDR2 et SHP-2. Cette dernière inhibe par la suite l’axe JAK2 / ERK1/2, et induit une augmentation de l’expression de p21CIP1. Dans la deuxième partie, nous montrons que le collagène de type I adulte induit l’apoptose dans les cellules de carcinome mammaire luminal non invasif, contrairement au collagène âgé. Nous mettons en évidence une activation plus importante de DDR1 par le collagène adulte, et cela uniquement en matrice 3D de collagène. Ceci conduit à une augmentation de l’expression de la protéine pro-apoptotique BIK, qui conduit à son tour à l’apoptose des cellules. Ces données suggèrent que le vieillissement du collagène de type I contribue à la perte de ses propriétés de suppresseur de tumeur, en diminuant l’activation des voies de signalisation relayées par DDR1 et DDR2. / Cancer cells are confronted to a microenvironment that regulates tumor progression. Type I collagen is one of the adhesion factors which control cell proliferation. During aging, this protein undergoes modifications which have a detrimental effect on its fibrillar organization. This property is crucial for the activation of DDR1 and DDR2. Here we address the effect of collagen aging on cell growth and apoptosis. In the first study, we provide evidence for an inhibitory effect of adult collagen, but not the old one, on proliferation of human fibrosarcoma HT-1080 cells. This process is observed only in 3D matrix culture model. At the opposite of the old collagen, adult collagen highly activates DDR2 and its downstream target, the phosphatase SHP-2. Then SHP-2 represses the JAK2/ERK1/2 signaling axis, leading to an increase in p21CIP1 expression, thus conferring to adult collagen a growth suppressor property, which is lost with aging. In the second study, we analyzed the effects of collagen aging on its apoptotic effect in luminal and non-invasive breast carcinoma. Adult collagen is able to induce apoptosis in MCF-7 and ZR-75-1, when compared to old collagen. This process is observed only in 3D matrix culture model. A significant increase in DDR1 activation is observed in the presence of adult collagen. This leads in turn to an increase in the pro-apoptotic protein BIK expression and consequently in collagen-induced apoptosis. Altogether, our data support the concept that aging contributes to the loss of type I collagen-induced cell growth suppression and apoptosis by downregulating DDR1 and DDR2 signaling pathways, but only in 3D cell confinement model.

Les invadosomes sont des structures d’invasion plastiques et dynamiques qui interagissent avec leur microenvironnement. Ils possèdent différentes fonctions telles que l’adhésion, la mécanotransduction ou encore la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC). Mon travail de thèse s’est concentré sur i) l’étude globale de la composition des invadosomes par spectrométrie de masse et ii) sur l’impact d’éléments du microenvironnement dans la formation de ces structures d’invasion.i) Les invadosomes sont des complexes multi-protéiques dont tous les partenaires ne sont pas encore totalement identifiés. Au laboratoire, une nouvelle approche combinant la microdissection laser suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, a été développée. Cette technique a été appliquée à l’étude des invadosomes rosettes. Nous avons ainsi mis en évidence une nouvelle fonction associée aux invadosomes, en les définissants comme des sites actifs de traduction protéique. Les invadosomes cependant, sont des structures plastiques dont la formation et la morphologie sont modulées par différents éléments de l’environnement. Nous souhaitons à présent déterminer les partenaires communs et spécifiques entre les différentes organisations des invadosomes afin d’identifier les molécules impliquées dans cette plasticité.ii) La formation des invadosomes peut être induite par différents éléments du microenvironnement comme des facteurs de croissance ou encore la composition et la rigidité de la MEC. Le TGF-β est un facteur de croissance impliqué dans la formation des invadosomes, dans la promotion de la rigidité de la MEC et dans la fibrose hépatique pouvant mener au développement du carcinome hépatocellulaire. Nous avons alors étudié l’impact du TGF-β dans la formation des invadosomes linéaires en contexte de collagène de type I. Nous montrons que le TGF-β module la machinerie moléculaire associée aux invadosomes linéaires en induisant l’expression de DDR1 et MT1-MMP, ainsi que des éléments impliqués dans leur formation tels que le collagène I. Ces modulations sont dépendantes de la voie de signalisation canonique du TGF-β passant par Smad4 et favorisent la formation et l’activité des invadosomes linéaires. De plus, le TGF-β induit une surexpression de la LOXL2 qui est une enzyme de réticulation du collagène, augmentant la rigidité de la matrice ce qui favorise la formation des invadosomes.Les résultats obtenus durant ma thèse auront permis de mieux définir les éléments impliqués dans la composition et la formation des invadosomes. / Invadosomes are plastic and dynamic invasive structures interacting with the microenvironement. Those structures are involved in several functions as adhesion, mecanotransduction and degradation of the extracellular matrix (ECM). My PhD work focuses on i) the study of the invadosomes composition by mass spectrometry and ii) on the impact of microenvironmental elements on the formation of those invasive structures.i) Invadosomes are multi-protein complexes in which all partners are not yet fully identified. In the laboratory, a new approach combining laser micordissection followed by mass spectrometry analysis was developed. This technique has been applied to the study of invadosome rosettes. We have demontrasted a new function associated with indosomes, defining them as active sites of protein translation. Invadosomes, however, are plastic structures whose formation and morphology are modulated by different elements of the environment. We now wish to determine the common and specific partners between the different invadosomes organizations in order to identify the molecules involved in their plasticity.The invadosomes formation can be induced by different elements of the microenvironment such as growth factors or the composition and rigidity of the ECM. TGF-β is a growth factor involved in the invadosomes formation, in the ECM rigidity and in liver fibrosis that can lead to the development of hepatocellular carcinoma. We have studied the impact of TGF-β in the formation of linear invadosomes in the context of type I collagen. We show that TGF-β modulates the molecular machinery associated with linear invadosomes by inducing the expression of DDR1 and MT1-MMP, as well as elements involved in their formation, such as collagen I. These modulations are dependent on the TGF-β canonical signaling pathway through Smad4 and promote the formation and activity of linear invadosomes. In addition, TGF-β induces an overexpression of LOXL2, which is a collagen cross-linking enzyme, increasing the matrix stiffness and promotes the formation of these structures.Taken together, these results enabled us to better define the elements involved in the composition and formation of invadosomes.

Le collagène de type I représente la protéine structurale la plus abondante au sein de l'organisme. Au cours du vieillissement, cette protéine à longue demi-vie biologique subit des modifications structurales et fonctionnelles qui affectent les propriétés biomécaniques des tissus. L'un des mécanismes majeurs est la réaction de glycation non enzymatique qui conduit à la formation des produits de glycation avancée (AGEs). Les AGEs entraînent une augmentation de la rigidité du collagène I qui se traduit par une désorganisation des réseaux fibrillaires et une perte d'élasticité tissulaire au cours du vieillissement. Dans cette étude, nous avons développé diverses approches biophotoniques afin d'étudier l'impact du vieillissement sur le collagène de type I, de façon rapide, directe et non destructive. Par microspectroscopies vibrationnelles infrarouge (IR) et Raman, des marqueurs spectroscopiques liés à l'accumulation des AGEs ont été mis en évidence au niveau des lyophilisats de collagènes de type I glyqués in vitro. Ces marqueurs sont retrouvés au niveau des lyophilisats de collagènes de type I d'âges différents et permettent une bonne discrimination des échantillons en fonction de l'âge. La bande spécifique des glucides apparaît ainsi comme un bon marqueur spectroscopique de la glycation, corrélant avec le taux d'AGEs fluorescents. Les pics spécifiques des résidus de proline permettent également de mettre en évidence les changements conformationnels dans la protéine dus à l'augmentation des liaisons croisées. L'imagerie IR appliquée aux tissus murins d'âges différents permet de retrouver ces différences spectrales in situ en fonction de l'âge. L'impact du vieillissement sur le comportement structural des fibrilles de collagène I a été étudié par microscopie multiphoton de second harmonique résolue en polarisation (PSHG). A l'échelle de la fibrille isolée, le vieillissement entraîne une perte de la complexité d'assemblage des fibrilles et une diminution de leur diamètre. L'effet de l'âge sur les propriétés biomécaniques du collagène de type I a été évalué sur des modèles de matrices 3D de collagène de type I, en présence de fibroblastes, par une technique de déformation des matrices et par tomographie à cohérence optique (OCT). Les résultats montrent une diminution du module d'élasticité et de la contraction du collagène avec le vieillissement, en accord avec les données de l'étude cinétique de la fibrillogenèse. Cette étude démontre la complémentarité des techniques biophotoniques employées et leur potentiel dans la caractérisation moléculaire et morphologique des effets de l'âge sur le collagène de type I, de manière directe, non invasive et multi-échelles. / Type I collagen represents the most abundant structural protein in the human body. During aging, this long half-life protein undergoes structural and functional changes which affect the biomechanical properties of tissues. One of the main mechanisms is the non enzymatic glycation leading to the formation of the so-called advanced glycation endprodutcs (AGEs). AGEs give rise to an increase of collagen I rigidity which is responsible for the fibrillar network disorganization and the loss of tissue elasticity with age. In this work, we applied various biophotonic approaches for studying the impact of aging on type I collagen, in a rapid, direct and non destructive way. Using vibrational infrared (IR) and Raman microspectroscopies, we highlighted spectroscopic markers linked to AGEs accumulation in freeze-dried samples of in vitro-glycated type I collagens. These markers were also detected in different-age freeze-dried type I collagens and allowed a clear discrimination of samples as a function of age. The band assigned to carbohydrates appears like a specific spectroscopic marker of glycation, in correlation with the fluorescent-AGEs quantification. The specific peaks for proline residues allow highlighting conformational changes in protein backbone due to a higher cross-linking. IR imaging applied to tissues from different-age rats can detect these spectral differences in situ as a function of age. Impact of aging on the structural behaviour of type I collagen fibrils was studied by polarization resolved second harmonic generation (PSHG) multiphoton microscopy. At the scale of single fibril, aging gives rise to a loss of fibril assembly complexity and a decrease of fibril diameter. Age effect on biomechanical properties of type I collagen was evaluated on 3D type I collagen matrice models in the presence of fibroblasts, using an indentation technique and optical coherence tomography (OCT). Results show a decrease of both elastic modulus and collagen contraction with aging, in agreement with kinetics of the fibrillogenesis process. This study demonstrates the complementarity of the different biophotonic techniques used in our multimodal approach and their potential for characterizing age effects on type I collagen, in a direct, non invasive and multi-scale way.

La galactosémie congénitale est une maladie métabolique affectant la voie du galactose. En effet, l'enzyme responsable de la transformation du galactose-1-phosphate en glucose-1-phosphate, la galactose-1-phosphate uridyltransférase, est déficiente et rend donc l'utilisation du galactose par l'organisme quasiment impossible. Ceci entraîne une accumulation de galactose ainsi que ses produits dérivés, le galactose-1-phosphate et le galactitol. Ainsi, notre hypothèse de travail est que les métabolites impliqués dans cette pathologie provoquent des modifications post-traductionnelles des protéines induisant ainsi leur vieillissement prématuré. Nous avons donc étudié l'impact de la « galactation » sur la structure du collagène de type I et montré que ces modifications structurales sont beaucoup plus importantes avec le galactose qu'avec le glucose à la même concentration, aussi bien sur la structure primaire que fibrillaire. Au contact du collagène « galacté », les fonctions des cellules inflammatoires sont modifiées. La technique de spectroscopie infrarouge a été utilisée pour caractériser les métabolites impliqués dans la galactosémie ainsi que les collagènes modifiés. Dans un but de dépistage, une étude en spectroscopie infrarouge de plasmas galactosémiques nous a permis de mettre en évidence le potentiel de cette technique, du fait de sa bonne sensibilité et de son faible coût de revient. En conclusion, les modifications post-traductionnelles des protéines semblent très fortement impliquées dans la physiopathologie de la galactosémie congénitale. / The congenital galactosemia is a metabolic disease involved in the galactose pathway. Indeed, the enzyme responsible of the galactose-1-phosphate transformation in glucose-1-phosphate, the galactose-1-phosphate uridyltransferase, is deficient and then leads to a use of galactose almost impossible. This leads to an accumulation of galactose and its derived products, the galactose-1-phosphate and the galactitol. Thus, our work hypothesis is that metabolites involved in this disease cause post-translational modifications of proteins inducing their premature aging. We then studied the impact of the « galactation » on the type I collagen and showed that the structural modifications are more important with galactose than with glucose at the same concentration, on both the primary and the fibrillar structure. On contact with « galacted » collagen, the inflammatory cells functions are also modified. The infrared spectroscopy technique has been used to characterize the metabolites involved in the galactosemia, just as the modified collagens. With the aim of screening, an infrared spectroscopy study of galactosemic plasmas allowed us to highlight the potential of this technique, with its good sensibility and its low cost price. To conclude, the post-translational modifications of proteins seem strongly involved in the physiopathology of the congenital galactosemia.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer au pronostic sombre, car il est souvent diagnostiqué trop tardivement pour entreprendre un traitement curatif. Il se développe dans 80-90% des cas sur fond de cirrhose. On connait mal comment la fibrose, étape préliminaire à la cirrhose, et son principal constituant, le collagène de type 1 (COL1), peuvent jouer un rôle dans le processus du CHC. Nous avons tout d’abord étudié le développement de la fibrose dans un modèle utilisant la souris nue. Nous avons déterminé qu’après 16 semaines d’administration de thioacétamide dans l’eau de boisson, il est possible d’obtenir une fibrose suffisante pour induire une hépatoprotection en présence de différents hépatotoxiques (AST dans le sérum de souris fibrotiques vs non-fibrotiques : Anti-Fas JO2 (4665 ± 2596 vs. 13953 ± 2260 U/L; P<0.05), acétaminophène (292 ± 66 vs. 4087 ± 2205 U/L; P<0.01) et CCL4 (888 ± 268 vs. 15673 ± 2782 U/L; P<0.001)). Ces résultats confirment que la présence de COL1 et de fibrose favorise la survie des hépatocytes normaux tel qu’observé précédemment au laboratoire. Par la suite, nous avons sélectionné in vivo, par injection intrasplénique de la lignée de CHC Hepa1-6, une lignée à forte tumorigénicité nommée dt-Hepa1-6 (28±12 lésions vs. 0±0 lésions à 21 jours). Cette lignée était composée d’une sous-population cellulaire arborant la protéine de surface EpCAM (34.0±0.1%). Par tri cellulaire, nous avons démontré que ces cellules étaient partiellement responsables de la tumorigénicité accrue (EpCAM + (86.7±2.3%) :1093±74 lésions vs. EpCAM- (15.3±1.0%) :473±100 lésions; P<0.01). Nous avons alors démontré que la présence de fibrose favorise le développement de la lignée dt-Hepa1-6 in vivo (604±242 vs 22±9 lésions; P<0.05). De plus, la présence de fibrose réduit l’efficacité du traitement au cisplatin in vivo (44.5±4.9 vs. 78.7±6.9%; P<0.01) confirmant les résultats obtenus in vitro (Apoptose : COL1 13.75±0.44% vs. plastique 31.45±1.37%; P<0.001). En conclusion, la présence de fibrose et de son principal constituant, le COL1, favorise la survie et la progression du CHC. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is a dreadful pathology, often diagnosed too late to be cured. In 80-90% of cases, it arises in the context of liver cirrhosis. Little is known on the implication of liver fibrosis, one of the key elements of cirrhosis, and its major constituent, type I collagen (COL1), on the development of HCC. We first studied the development of fibrosis in a nude mouse model. We determined that, after 16 weeks of thioacetamide administration in drinking water, we obtained a sufficient degree of fibrosis to reach a hepatoprotective state when animals were exposed to different hepatotoxic agents (Serum AST of fibrotic vs non-fibrotic mice : Anti-Fas JO2 (4665 ± 2596 vs. 13953 ± 2260 U/L; P<0.05), acetaminophen (292 ± 66 vs. 4087 ± 2205 U/L; P<0.01) et CCL4 (888 ± 268 vs. 15673 ± 2782 U/L; P<0.001)). This confirmed that COL1 and the presence of fibrosis protects normal hepatocytes as observed previously in our laboratory. Next, we selected in vivo, by intrasplenic injection of the murine HCC cell line Hepa1-6, a highly tumorigenic cell line that we named dt-Hepa1-6 (28±12 lesions vs. 0±0 lesions at 21 days). This cell line was constituted of cell subsets expressing EpCAM protein at their surface (34.0±0.1%). Through cell sorting, we demonstrated that these cells were partially responsible for the enhanced tumorigenicity observed (EpCAM + (86.7±2.3%) :1093±74 lesions vs. EpCAM- (15.3±1.0%) :473±100 lesions; P<0.01). We then showed that the presence of liver fibrosis increases the development of dt-Hepa1-6 cell line in vivo (604±242 vs 22±9 lesions; P<0.05). Moreover, fibrosis reduced the anti-neoplastic efficacy of cisplatinum in vivo (44.5±4.9 vs. 78.7±6.9%; P<0.01) confirming in vitro results (Apototic index : COL1 13.75±0.44% vs. plastic 31.45±1.37%; P<0.001). In conclusion, fibrosis and its major constituent, COL1, favor the survival and progression of HCC.

L’estimation du délai post mortem est une étape fondamentale en anthropologie médico-légale. À ce jour, peu de méthodes précises et fiables existent. Les objectifs de notre travail étaient d’étudier le tissu osseux et son évolution dans les années et siècles suivant le décès en développant la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) des solides du carbone13C et du proton1H. Nous avons analysé une centaine d’os humains et animaux pour lesquels nous connaissions l’âge au décès, le sexe, la date de décès et les conditions de conservation. Nous avons caractérisé les os au niveau moléculaire en identifiant le collagène, les lipides et l’hydroxyapatite constitutifs du tissu osseux. Nous avons développé une méthode RMN permettant de distinguer des altérations de certains échantillons attestant de la présence d’adipocire au sein du tissu osseux, ou des dégradations sur des échantillons très anciens. L’étude de l’âge au décès et du sexe des sujets n’a pas mis en évidence une grande influence de ces facteurs sur les données RMN même si, pour des délais post mortem de 0 ou 1 an, les sujets féminins présentent quantitativement plus de lipides que les sujets masculins. L’analyse des conditions de conservation des individus montre un développement plus important d’adipocire pour les os laissés à l’air libre comparés aux os enterrés. Enfin, nous rapportons une décroissance quantitative du collagène et des lipides présents au sein du tissu osseux lorsque l’intervalle post mortem augmente. Cette décroissance est beaucoup plus rapide pour les lipides (quelques années) que pour le collagène (plusieurs millénaires) alors que l’hydroxyapatite présente une relative stabilité dans les premiers siècles suivant le décès. / The post mortem interval estimation is a fundamental step in forensic anthropology and up to now there are little accurate and reliable methods to do so. The objectives of our study were to investigate the bone composition and its evolution over years and centuries following the death by developing carbon 13C and proton 1H solid-state nuclear magnetic resonance (NMR). We analyzed about one hundred human and animal bones for which the age at death, sex, date of death and the storage conditions were known. Bones were characterized at the molecular level by identification of collagen, lipids and hydroxyapatite embedded in the bone matrix. We have designed a NMR-based method that allows determining alterations on some samples, evidencing the presence of adipocere (bone wax) within the bone, or finding bone tissue deterioration on some very old samples. Subject age at death and sex did not reveal significant changes on NMR data, except for post mortem interval ranging between 0 to 1 year, where female subjects had quantitatively more lipids in their bones than males. Storage conditions may promote a greater development of adipocere especially for bones left in the open air compared to those buried. Finally, we report a quantitative decrease of collagen and lipids present in the bone tissue when the post mortem interval increases. This decrease is much faster for lipids than for collagen where as the hydroxyapatite has a relative stability in the first centuries after the death. Decreases occur with very different time constants, ranging from years to millennia.

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