La réaction de carbamylation, comme les réactions de glycation, d’oxydation ou de carbonylation, fait partie des modifications post-traductionnelles non enzymatiques des protéines. Elle correspond à la fixation d’acide isocyanique sur les groupements aminés des protéines et conduit à la formation de produits de carbamylation, dont fait partie l’homocitrulline. Des études in vitro ont mis en évidence le caractère délétère de la carbamylation des protéines sur leur structure et leur fonction. Des études in vivo ont montré l’accumulation tissulaire des produits de carbamylation au cours de l’insuffisance rénale chronique et du vieillissement. Cependant, peu de travaux ont porté sur la carbamylation des protéines intracellulaires.Ce travail a porté sur l’étude de la carbamylation des protéines intracellulaires, leur impact sur la cellule ainsi que leur devenir. De plus, un mécanisme de réparation des protéines carbamylées a été recherché.Nous avons montré, par une approche quantitative et qualitative, que les protéines intracellulaires pouvaient être carbamylées dans des conditions physiologiques et que leur carbamylation était augmentée en présence de cyanate ou d’urée. Nous avons également montré que les cellules étaient capables d’éliminer les protéines carbamylées, en impliquant le protéasome. Un phénomène de décarbamylation a été mis en évidence, ce qui ouvre des possibilités pour la mise en place de stratégies visant à limiter ou à inverser la carbamylation. / The carbamylation reaction, like glycation, oxidation or carbonylation reactions, is a non-enzymatic post-translational modification of proteins. It corresponds to the binding of isocyanic acid to protein amino groups and leads to the formation of carbamylation-derived products (CDPs), such as homocitrulline. In vitro studies have demonstrated the deleterious effect of carbamylation of proteins on their structure and function. In vivo studies have shown tissue accumulation of CDPs during chronic kidney disease and aging. However, studies on the carbamylation of intracellular proteins are lacking.This work was devoted to the study of the carbamylation of intracellular proteins, their impact on cell and their fate. In addition, a mechanism for repairing carbamylated proteins has been investigated.Our results showed, by quantitative and qualitative approaches, that intracellular proteins were carbamylated in physiological conditions and that their carbamylation rate was increased in the presence of cyanate or urea. We also have shown that cells were able to remove carbamylated proteins by a mechanism involving the proteasome. A phenomenon of decarbamylation has been highlighted, which opens up possibilities for the implementation of strategies to limit or reverse carbamylation.

La glycation et la carbamylation sont deux modifications post traductionnelles non-enzymatiques qui participent au vieillissement moléculaire des protéines. Ces réactions qui peuvent être amplifiées dans certains contextes pathologiques, comme le diabète et l'insuffisance rénale chronique (IRC) consistent en la fixation de métabolites simples sur les groupements aminés des protéines. Ces réactions peuvent donc entrer en compétition pour la modification des protéines. Pour étudier ce phénomène, des situations de compétition ont été reproduites in vitro (incubation d’albumine en présence de glucose et/ou urée ou cyanate) et in vivo (modèles de souris diabétiques avec IRC et diabétiques alimentées en cyanate) puis différents marqueurs de glycation et de carbamylation ont été quantifiés. Les résultats ont montré l’existence d’un phénomène de compétition réciproque in vitro dans la plupart des conditions testées alors qu’in vivo, seule la carbamylation présentait un effet compétiteur. Par exemple, les taux d’HbA1c étaient significativement (p<0,05) diminués de 42% dans le groupe de souris diabétiques avec IRC par rapport aux souris diabétiques. Cet effet compétiteur en faveur de la carbamylation a également été retrouvé au niveau tissulaire sur des échantillons d’aorte et de peau. Ces résultats démontrent l’existence de ce phénomène de compétition qui doit être dorénavant pris en compte lors de l’étude du rôle de ces modifications en physiopathologie, de même que lors de l’utilisation des produits de glycation dont l’HbA1c comme marqueurs de l’équilibre glycémique chez des patients diabétiques et insuffisants rénaux. / Glycation and carbamylation are two non-enzymatic post-translational modifications that are enhanced in common ageing pathologies: glycation in diabetes and carbamylation in chronic kidney disease (CKD), both diseases prone to molecular aging acceleration. They are characterized respectively by the addition of sugars (for glycation), or isocyanic acid produced by urea decomposition (for carbamylation), on the same binding sites of amino groups on proteins, and thus can compete and interfere. We reproduced competition situations both in vitro and in vivo and measured the glycation products (furosine, fructosamines, carboxymethyllysine, HbA1c) and the carbamylation products (homocitrulline, carbamylated hemoglobin). In vitro, albumin was incubated with glucose, urea or cyanate in different conditions. In vivo CKD was induced (or not) in diabetic (db/db) or non-diabetic mice by subtotal-nephrectomy for 5 weeks, or cyanate was administrated for 6 weeks to diabetic or not mice to amplify carbamylation. After 3 weeks of albumin incubation a reciprocal inhibition of 30% was evidenced. In vivo HbA1c was decreased by 42% and 34% (p<0,05) in CKD-diabetic mice and cyanate-diabetic mice respectively compared to diabetic mice. This competitive effect that favors carbamylation in vivo has been showed on tissue markers (aorta, skin). This competitive effect highlighted by our results must be considered in future studies concerning the consequences of non-enzymatic post-translational modifications and in the clinical use of glycemic markers in diabetic patients with CKD.

Les modifications post-traductionnelles non enzymatiques des protéines, comme la glycation, l'oxydation ou la carbamylation, participent au vieillissement des tissus. Certaines maladies chroniques constituent des contextes pathologiques favorisant ces modifications chimiques. La carbamylation est une réaction encore peu étudiée à ce jour, qui correspond à la fixation de l'acide isocyanique, principalement dérivé de l'urée, sur les groupements aminés des protéines. Cette réaction mène à la formation de produits de carbamylation (CDP), parmi lesquels l'homocitrulline. Des études in vitro ont montré que la carbamylation participait à l'altération des propriétés structurales et fonctionnelles des protéines tissulaires et plasmatiques. Néanmoins, le devenir tissulaire des CDP reste encore non élucidé. Notre travail a consisté à évaluer la carbamylation des protéines tissulaires dans un contexte in vivo au cours de l'insuffisance rénale chronique (IRC) et du vieillissement. Ces études ont montré que la carbamylation était une réaction physiologique observée au cours du vieillissement et amplifiée au cours de l'IRC, menant à l'accumulation des CDP dans les tissus. Cette modification a particulièrement lieu au niveau du collagène de type I mais aussi au niveau de l'élastine, deux protéines matricielles à longue demi-vie. Ces résultats peuvent être mis en lien avec les troubles infectieux et inflammatoires observés au cours du vieillissement et de l'IRC. Par ailleurs, l'organisme semble capable de limiter ce processus de carbamylation, ce qui permet d'envisager des investigations supplémentaires dans l'optique de développer des stratégies préventives ou thérapeutiques. / Non-enzymatic post-translational modifications of proteins, such as glycation, oxidation, and carbamylation, are associated with tissue aging. Chronic diseases are pathological contexts known for amplifying these chemical modifications. A still poorly investigated reaction is carbamylation, or the binding of isocyanic acid, a byproduct principally derived from urea, to protein amino groups. This process leads to the formation of carbamylation-derived products (CDPs) such as homocitrulline. In vitro experiments have shown that carbamylation contributes to the alteration of structural and functional properties of various tissue and plasma proteins. The metabolic fate of carbamylated proteins in vivo, however, is still unclear.Herein, we have evaluated tissue carbamylation rate during chronic renal failure (CRF) and aging in vivo. Our results show that carbamylation occurs physiologically during aging and is amplified during CRF, leading to an accumulation of CDPs in tissues. This reaction affects more intensely type I collagen but also affects elastin, both extracellular compounds with long half-lives. These results could be linked with infectious and inflammatory disorders observed in aging and CRF. Moreover, the organism seems to be able to limit the carbamylation process, suggesting that further studies could develop preventive or therapeutic strategies.

Le microenvironnement tumoral via les macromolécules matricielles est connu pour jouer un rôle clé dans la réponse des cellules cancéreuses à la chimiothérapie en favorisant leur survie et leur prolifération. L'impact du collagène de type I, protéine matricielle majeure du microenvironnement, a été évalué au niveau des capacités migratoires des cellules tumorales et de leur réponse aux agents anticancéreux, doxorubicine et metformine. Cette approche a étémenée chez des cellules humaines HT1080 hautement invasives au moyen de systèmes de culture par coating 2D ou en matrice 3D. Les effets de modifications post-traductionnelles du collagène comme la carbamylation et de la glycation ont été également étudiées. Les résultats montrent que le collagène 3D inhibe l'activité anti-migratoire de la doxorubicine. Cette protection met en jeuune préservation des niveaux d'activation de FAK et RhoA impliquées dans la formation des fibres de stress d'actine et des plaques d'adhésion focales. Le collagène glyqué 2D et dans une moindre mesure le carbamylé inhibent l'adhésion, la migration des cellules tumorales et désorganisent leur cytosquelette d'actine via des modifications de distribution de la vinculine, de FAK et des intégrines 1. Cet impact de la glycation a été aussi mis en évidence en matrice 3D après modification du processus de glycation. Enfin, la glycation exerce un effet protecteur vis-àvis des capacités anti-prolifératives et anti-migratoires de la doxorubicine et de la metformine. En conclusion, nous mettons en évidence une nouvelle forme de résistance CAM-DR dirigée contre l'activité anti-invasive de médicaments ; cet effet pouvant être généré par une protéine matricielle native ou modifiée lors de situations physiopathologiques associées au cancer. / The tumor microenvironment via the extracellular matrix plays an important role in cancer cell response to chemotherapy by promoting their survival and proliferation. In this work, we studied the impact of collagen type I, a major matrix protein of tumor microenvironment, on the migration capacities of tumor cells and on their response to anticancer drugs such as doxorubicin and metformin. This approach was performed with the highly invasive human cell line HT1080,by means of 2D coating or 3D matrix cell culture systems. The effects of collagen posttranslational modifications such as carbamylation and glycation were also assessed. The results show that the 3D collagen inhibits the anti-migratory effect of doxorubicin. This protection is carried out through the preservation of the activation states of FAK and RhoA, which are involved in the formation of actin stress fibers and focal adhesions. On 2D coating, the glycated collagen and at a lesser extent the carbamylated one decrease the adhesion, the migration oftumor cells and, disorganize the actin cytoskeleton via a modified distribution of vinculine, FAK and beta1 integrins. This impact is also demonstrated by using 3D matrices, after adaptation of the glycation process. In addition, we reported that the glycated collagen protects against the antiproliferative and the anti-migratory effects of doxorubicin and metformin. In conclusion, we highlighted a new form of CAM-DR resistance that targets the drugs anti-invasive activity. This impact could be induced by the native form of matrix proteins or the modified one found inpathological situations which are associated to cancer.

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Abstract Carbamylation of proteins in vivo occurs by cyanate, non-enzymatically when urea is dissociated, and by myeloperoxidase-catalyzed oxidation from thiocyanate. Carbamylation of low-density lipoprotein is suggested to enhance atherogenesis in patients with with chronic kidney disease and uremia. This thesis study assessed the questions of whether healthy humans or uremic patients under enhanced carbamylation have antibodies recognizing carbamyl-epitopes in plasma, and what is their role in vivo. Also, humoral immune response to carbamyl-LDL immunization and its impact on atherogenesis in LDLR-/- mice was investigated. In this thesis study, plasma antibodies to carbamylated proteins were detected in humans, and IgG antibodies to carbamylated proteins were associated with uremia and smoking, conditions with enhanced carbamylation. The human IgG and IgM antibodies binding to carbamyl-epitopes were associated with oxidation-specific epitopes in plasma. Monoclonal Fab antibodies with characteristics of a natural antibody and ability to bind both carbamyl- and malondialdehyde-derived epitopes were cloned from healthy humans. An investigated Fab antibody was able to bind epitopes found in atherosclerotic lesions and inhibit the uptake of modified LDL by macrophages. Human plasma antibodies and the monoclonal Fab bound to epitopes found on apoptotic cells. Human B-cells secreted antibodies with similar cross-reactive binding properties between carbamyl- and malondialdehyde adducts and apoptotic cells in vitro. Immunization with mouse carbamyl-LDL without adjuvant resulted in specific IgG immune response in LDLR-/- mice, but also a cross-reaction with malondialdehyde-adducts was observed. Carbamyl-LDL immunized mice had enhanced plasma antibody binding to apoptotic cells. Carbamyl-LDL immunization did not affect atherogenesis in mice. This thesis demonstrates that IgG antibodies to carbamyl-epitope might serve as a novel indicator of carbamylation in vivo in uremic patients or smokers. The cross-reactivity between antibodies binding to carbamylated and oxidation-specific epitopes, and apoptotic cells may have a role in explaining the link between enhanced atherogenesis and kidney disease. / Tiivistelmä Proteiinien karbamylaatiota tapahtuu syanaatin vaikutuksesta. Sitä muodostuu urean hajotessa tai myeloperoksidaasin katalysoimana tiosyanaatin hapettuessa. Low-density lipoproteiinin eli LDL:n karbamylaation on esitetty edistävän valtimonkovettumataudin eli ateroskleroosin kehittymistä munuaisten vajaatoimintaa sairastavilla ureemisilla potilailla. Väitöskirjatyössä tutkittiin, onko terveillä ihmisillä ja ureemisilla potilailla karbamyyli-epitooppeja tunnistavia vasta-aineita, ja mikä niiden merkitys on elimistössä. Humoraalista immuunivastetta karbamyyli-LDL-immunisaation jälkeen sekä sen vaikutusta ateroskleroosin kehittymiseen tutkittiin LDL-reseptoripuutteellisilla hiirillä. Tutkimuksessa osoitettiin, että ihmisillä on plasmassa karbamyloituja proteiineja tunnistavia vasta-aineita. IgG-luokan vasta-aineet ovat yhteydessä uremiaan ja tupakointiin, joissa karbamylaatio on lisääntynyt. Karbamyyli- ja hapettuneita epitooppeja tunnistavien plasman IgG- ja IgM-vasta-aineiden välillä havaittiin olevan yhteys. Työssä kloonattiin terveistä ihmisistä monoklonaalisia Fab-vasta-aineita, joilla on luonnollisten vasta-aineiden kaltaisia ominaisuuksia ja kyky sitoutua sekä karbamyyli- että malonidialdehydi-epitooppeihin. Yksi tutkittu Fab-vasta-aine sitoutui valtimonkovettumataudin ateroomissa oleviin epitooppeihin ja esti muuntuneen LDL:n sisäänoton makrofagi-soluihin. Ihmisen plasman vasta-aineet ja monoklonaalinen Fab-vasta-aine sitoutuivat apoptoottisten solujen pinnalla oleviin rakenteisiin. Soluviljelyolosuhteissa ihmisen B-solut tuottivat vasta-aineita, joilla oli samanlaisia ristireaktio-ominaisuuksia karbamyyli- ja malonidialdehydi-epitooppeja sekä apoptoottisia soluja kohtaan. Karbamyyli-LDL-immunisaatio sai aikaan IgG-immuunivasteen hiirillä karbamyyli-LDL:a kohtaan, mutta myös ristireaktio malonidialdehydi-rakenteita sekä apoptoottisia soluja kohtaan havaittiin. Karbamyyli-LDL-immunisaatio ei vaikuttanut ateroskleroosin kehittymiseen hiirillä. Tutkimus osoittaa, että IgG-vasta-aineet karbamyyli-epitooppeja kohtaan voivat olla uudenlainen karbamylaation merkkiaine elimistössä ureemisilla potilailla ja tupakoitsijoilla. Karbamyloituneiden ja hapettuneiden epitooppien sekä apoptoottisten solujen välillä havaituilla vasta-aineiden ristireaktioilla voi olla merkitystä valtimonkovettumataudin etenemiseen munuaisten vajaatoiminnassa.