Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sarah_Romano_Ortolan.pdf: 975526 bytes, checksum: d72ab61fc7bdc88b6ddbab0eb3a86e42 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Wheat is considered the main cereal diet of the world population, but in recent years has achieved some gain in productivity of this culture despite having increased the use of nitrogen fertilizer. The use of plant growth promoting bacteria such as Herbaspirillum seropedicae SmR1 among others has been studied to obtain development of plants with less use of nitrogen fertilizers. However there is little information relating the effects of this interaction in plant development and grain yield. Objective of this study was to evaluate the carbon and nitrogen metabolism by certain enzymes, metabolites and indices related to the response to infectious stress on the wheat cultivars CD 104 and CD 120 in association with Herbaspirillum seropedicae bacteria. Two experiments were conducted. The experimental design was completely randomized with four replications in a 4x2. The first factor relates to the conditions inoculation with bacteria and/or nitrogen source in coverage are: control without inoculation with bacteria or added nitrogen fertilizer (C); application of nitrogen fertilizer (50 kg.ha-1) 30 days after sowing (N); inoculation with 106 cells of the bacterium H. seropedicae/seed at planting (Hs) and inoculation with bacteria combined with the application of nitrogen fertilizer (Hs + N) and the second factor refers to the phenological stages (tillering and booting). The results indicated that inoculation with H. seropedicae in wheat seeds of cv.s CD 104 and CD 120 in the two growth stages answered in relation to the indices related to stress with the involvement of enzymes of carbon and nitrogen metabolism. However prominent effect was not noticed to promote plant growth of wheat in late development, nor a deleterious effect of the bacterium for inoculation cv. CD 104 under the experimental conditions. For cv. CD 120 the differential effects indicate lower levels of stress and some level of association to positive effect on productivity when combined inoculation of bacteria to nitrogen fertilization. It was concluded that as well as pathogenic and stressors, H. seropedicae able to beneficially associate with wheat also provides similar interference pattern of carbon and nitrogen metabolism and stress levels / O trigo é considerado o principal cereal da dieta da população mundial, entretanto nos últimos anos tem se obtido pouco ganho de produtividade desta cultura apesar de se ter aumentado o uso de fertilizante nitrogenado. O uso de bactérias promotoras do crescimento vegetal, como Herbaspirillum seropedicae SmR1 entre outras, tem sido estudado para se obter desenvolvimento de plantas com menor uso de fertilizantes nitrogenados. Entretanto existem poucas informações que relacionam os efeitos desta interação no desenvolvimento da planta e de produtividade de grãos. Objetivo deste trabalho foi avaliar o metabolismo de carbono e nitrogênio através de algumas enzimas, metabólitos e índices relacionados à resposta ao estresse infeccioso em trigo das cultivares CD 104 e CD 120 em associação com a bactéria Herbaspirillum seropedicae em dois estádios fenológicos. Foram realizados dois experimentos. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso, com 4 repetições, em esquema fatorial 4x2. O primeiro fator refere-se às condições de inoculação com bactéria e/ou fertilização nitrogenada em cobertura, sendo: controle, sem inoculação com bactéria ou adição de fertilizante nitrogenado (C); aplicação de fertilizante nitrogenado (50 kg.ha-1) após 30 dias da semeadura (N); inoculação de 106 células da bactéria H. seropedicae/semente na semeadura (Hs) e inoculação com a bactéria combinada com a aplicação de fertilizante nitrogenado (Hs + N) e o segundo fator refere-se aos estádios fenológicos (perfilhamento e emborrachamento). Os resultados indicaram que a inoculação com H. seropedicae em sementes de trigo das cv.s CD 104 e CD 120 nos dois estádios fenológicos responderam em relação aos índices relacionados ao estresse com envolvimento das enzimas do metabolismo de carbono e nitrogênio. Entretanto não foi percebido efeito proeminente de promoção do crescimento vegetal no final do desenvolvimento do trigo, tampouco efeito deletério da inoculação de bactéria para a cv. CD 104, nas condições experimentais. Para a cv. CD 120 os efeitos diferenciais indicam menor nível de estresse e algum nível de associação para efeito positivo na produtividade quando combinada a inoculação da bactéria com a fertilização nitrogenada. Foi possível concluir que assim como para agentes patogênicos e estressantes, a H. seropedicae, capaz de associar beneficamente com trigo também apresenta padrão semelhante de interferência do metabolismo de carbono e nitrogênio e índices de estresse

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TaffarelMT_DISSERT.pdf: 2213102 bytes, checksum: 779f70cd3a9747e4f3a386630bd3d1cc (MD5) Previous issue date: 2013-04-09 / Funda??o de Apoio ? Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte / Oilseeds are a high-value natural resource, due to its use as a substitute for petroleum. However, the storage time can reduce seed viability and oil quality. Therefore, scientific efforts have been made to provide a increment of storage time, germination rates and plant establishment of high-value oilseeds. The seedling establishment depends of the plant pass over the functional transition stage, characterized by a metabolic change from heterotrophic condition to autotrophic one. The storage oil mobilization is performed by β-oxidation process and the glyoxylate cycle. Also, the functional transition involves acclimation to photosynthetic condition, which generally includes the participation of antioxidant system and the reactive oxygen species, the latter are produced in various reactions of primary and secondary metabolism. In the present study, Catalase was inhibited during the functional transition of sunflower and safflower, after were performed many analyzes to elucidate the effects caused on the SOD and APX antioxidant systems. Also, were checked the changes in expression pattern of the glyoxylate cycle enzymes markers, ICL and MLS. It was observed that after CAT inhibition, the SOD and APX antioxidant systems allow the seedling establishment. Besides, was verified that both oilseeds can be accelerate the reverse mobilization and the photosynthetic establishment when Catalase activity has dramatically decreased / As sementes oleaginosas armazenam ?leos, um recurso natural de alto valor econ?mico devido a sua aplicabilidade como substituto aos derivados do petr?leo. Por?m, o tempo de armazenamento pode inviabilizar a semente provocando a redu??o da qualidade do ?leo e perda da viabilidade da semente. Por este motivo, esfor?os cient?ficos t?m sido realizados para proporcionar um maior tempo de armazenamento e incrementar taxas de germina??o e estabelecimento destas plantas com alto valor econ?mico. O estabelecimento da pl?ntula depende da capacidade do vegetal transpassar a etapa de transi??o funcional, caracterizada pela mudan?a do estado heterotr?fico para o autotr?fico. O consumo das reservas de ?leo depende das vias de β-oxida??o e do ciclo do glioxilato. No entanto, o processo de transi??o envolve a aclimata??o do vegetal ? condi??o de organismo fotossintetizante, que em geral conta com a participa??o fundamental do sistema antioxidante do vegetal devido ? produ??o de esp?cies reativas de oxig?nio em v?rias rea??es do metabolismo prim?rio e secund?rio. Neste estudo, a Catalase foi inibida durante a transi??o funcional de girassol e c?rtamo para analisar os efeitos provocados nos sistemas antioxidantes de APX e da SOD e verificar as modifica??es no padr?o de express?o das enzimas marcadoras do ciclo do glioxilato, ICL e MLS. Constatou-se que diante da inibi??o da Catalase o sistema antioxidante da APX e da SOD permitem o estabelecimento da pl?ntula. Verificou-se tamb?m que as duas oleaginoasas parecem acelerar a mobiliza??o de reservas e o estabelecimento fotossint?tico quando a Catalase tem a atividade drasticamente reduzida

[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de optimizar la técnica y probar su eficiencia en distintas dianas se modificaron dos genes implicados en LMA. Estos fueron el gen IDH2, en el cuál se buscó introducir la mutación R172, y el gen MYBL2. Finalmente, las eficiencias de edición obtenidas se compararon con el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR, muy utilizados por su alta eficiencia. Mientras que los complejos de ribonucleoproteínas presentaron una mayor eficiencia de corte, la eficiencia de edición de la mutación R172 fue similar en ambas estrategias. Mediante secuenciación masiva se confirmó y caracterizó esta edición y se comprobó que la maquinaria de edición no había producido cortes inespecíficos en regiones similares del genoma. Por tanto, la nueva metodología desarrollada permitió editar de forma precisa líneas celulares leucémicas con eficiencias similares a otras técnicas CRISPR más extendidas y sin producir efectos inespecíficos no deseados. Por otro lado, gracias a la gran conservación evolutiva del gen IDH2, los residuos R140 y R172 se encuentran conservados en la proteína idh-2 de Caenorhabditis elegans. Se empleó la estrategia co-CRISPR para desarrollar y seleccionar cepas mutantes con las mutaciones ortólogas a R140 y R172, y una cepa con ambas mutaciones. A pesar de la conservación, no se observó el aumento del oncometabolito 2-HG esperado en las cepas mutantes en comparación con la cepa salvaje control N2. Un estudio exhaustivo de las vías implicadas nos serviría para desarrollar modelos de investigación con las alteraciones moleculares observadas en los pacientes. Para concluir, la estrategia desarrollada de introducción de elementos CRISPR en líneas celulares, junto a los modelos producidos en C. elegans, permitirán en futuros estudios investigar en detalle los efectos moleculares de mutaciones detectadas en pacientes de LMA, su implicación en el desarrollo y pronóstico de la LMA y comprender su papel en la estratificación de los pacientes. / [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i provar la seua eficiència en diferents dianes es van modificar dos gens implicats en LMA. Aquests van ser el gen IDH2, en el qual es va buscar introduir la mutació R172, i el gen MYBL2. Finalment, les eficiències d'edició obtingudes amb la nova estratègia es van comparar amb l'ús de complexos ribonucleotproteïnes CRISPR, molt utilitzats per la seua alta eficiència. Mentre que els complexos de ribonucleoproteïnes van presentar una major eficiència de tall, l'eficiència d'edició de la mutació R172 va ser similar en les dues estratègies. Mitjançant seqüenciació massiva es va confirmar i caracteritzar aquesta edició i es va comprovar que la maquinària d'edició no havia produït talls inespecífics en regions similars del genoma. D'aquesta manera, la nova metodologia desenvolupada permet editar de manera precisa línies cel·lulars leucèmiques amb eficiències similars a altres tècniques CRISPR més esteses i sense produir efectes inespecífics no desitjats. D'altra banda, gràcies a la gran conservació evolutiva del gen IDH2, els residus R140 i R172 es troben conservats en la proteïna idh-2 de Caenorhabditis elegans. Es va utilitzar l'estratègia co-CRISPR per a desenvolupar i seleccionar ceps mutants amb les mutacions ortòlogues a R140 i R172, i un cep amb dues mutacions. Malgrat l'alta conservació, no es va observar l'augment del oncometabolit 2-HG esperat en els ceps mutants en comparació amb el cep salvatge control N2. Un estudi exhaustiu de les vies implicades ens serviria per a desenvolupar models d'investigació amb les alteracions moleculars observades en els pacients. Per a concloure, l'estratègia desenvolupada d'introducció d'elements CRISPR en línies cel·lulars, al costat dels models produïts en C. elegans permetran en estudis futurs investigar detalladament els efectes moleculars de mutacions detectades en pacients, la seua implicació en el desenvolupament i prognosi de la LMA i comprendre el seu paper en l'estratificació dels pacients. / [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with the new strategy were compared with CRISPR ribonucleoproteins methodology, widely used for its high efficiency. Whereas ribonucleoprotein complexes showed higher cut efficiencies, the efficiency of edition of R172 mutation efficiency was similar in both strategies. These results were validated and characterized by means of next generation sequencing, and no off-target effects were found. Therefore, the new developed methodology allows precise gene editing in leukemic cell lines with similar efficiencies with other popular CRISPR techniques and without off-target effects. On the other hand, thanks to the high evolutive conservation of IDH2 gene R140 and R172 residues are conserved in Caenorhabditis elegans idh-2 protein. The co-CRISPR strategy was used to produce and select mutant strains with ortholog mutations to R140, R172 and one strain with both mutations. Despite the high conservation, the expected increase in oncometabolite 2-HG concentration was not detected in mutant strains compared to the N2 wild type strain. A comprehensive study of the pathways involved would help us to develop a research model with molecular alterations noticed in patients. In conclusion, the new developed strategy for CRISPR elements introduction in cell lines, together with C. elegans models, will allow an in-depth research of molecular effect of mutations detected in patients, its implication in AML progression and prognosis and understand their role in patient stratification. / González Romero, E. (2022). Investigación de la Leucemia Mieloide Aguda mediante el desarrollo de modelos in vitro e in vivo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181891 / TESIS