Objetivo general: Estudiar la potencialidad de los microorganismos del gránulo de kefir y sus metabolitos para inhibir el desarrollo de hongos toxicogénicos y para secuestrar micotoxinas. Objetivos específicos: - Estudiar el efecto antifúngico de los productos fermentados con kefir sobre los hongos toxicogénicos. - Analizar el efecto que ejercen los ácidos orgánicos puros y en mezclas en concentraciones similares a las presentes en los productos fermentados con kefir, en la inhibición del crecimiento de hongos filamentosos toxicogénicos. - Indagar el efecto de los productos fermentados del kefir y de los ácidos orgánicos sobre la producción de micotoxinas por los hongos estudiados. - Evaluar la aplicación potencial de los microorganismos del kefir como un conservante natural sobre alimento para pollos. - Determinar la capacidad de los microorganismos totales del kefir y de microorganismos aislados de los mismos para capturar aflatoxinas bajo diferentes condiciones de cultivo. - Estudiar la capacidad protectora de los microorganismos totales del kefir sobre modelos celulares in vitro

Le lactosérum et le perméat de lactosérum (WP) sont les principaux sous-produits du processus de fabrication du fromage et de la caséine. Ils sont considérés comme des polluants environnementaux en raison de leur charge organique élevée caractérisée par une haute demande biologique et chimique en oxygène. Ils créent un problème majeur d'élimination pour l'industrie laitière en raison des grands volumes de leur production annuelle. Par conséquent, il y a une demande constante de développer une approche durable pour leur utilisation afin d'éviter la pollution de l'environnement. Dans ce contexte, cette étude visait à comparer la technologie d'électro-activation (EA) à un processus d'isomérisation chimique, à alcalinité équivalente de la solution, pour produire du lactulose, qui est un prébiotique reconnu et éprouvé, en utilisant du lactose pur, du lactosérum et du perméat de lactosérum, comme matières premières sources de lactose, et de valoriser les produits électro-activés en produisant des métabolites à haute valeur ajoutée en utilisant une culture de kéfir et une culture pure de Kluyveromyces marxianus comme approche intégrée pour la valorisation complète de ces résidus de l'industrie laitière. La technologie d'électro-activation a été appliquée pour isomériser le lactose en lactulose dans un réacteur d'électro-activation modulé par des membranes échangeuses d'anions et de cations. L'électro-isomérisation du lactose en lactulose a été réalisée en utilisant des solutions de lactose (5, 10, 15 et 20 % p/v), de lactosérum (7, 14 et 21 % p/v) et de perméat de lactosérum (6, 12 et 18 % p/v) sous des intensités de courant électrique de 300, 600 et 900 mA pendant 60 min avec un intervalle d'échantillonnage de 5 min. L'isomérisation chimique conventionnelle a été réalisée à une alcalinité de la solution équivalente au KOH correspondant à celle mesurée dans les substrats électro-activés (lactose, lactosérum et perméat de lactosérum) à chaque intervalle de 5 min en utilisant de la poudre de KOH comme catalyseur à température ambiante (22 ± 2 °C). Les résultats obtenus ont montré que la production de lactulose en utilisant l'approche par électro-activation dépendait de l'intensité du courant électrique, de la concentration de la solution soumise à l'électro-activation et du temps de réaction. Les rendements les plus élevés de lactulose sont de 38 % en utilisant une solution de lactose de 10 % électro-activé pendant 40 min sous 900 mA, de 32 % en utilisant une solution de 7 % de lactosérum électro-activé sous 900 mA pendant 60 min et de 37 % en utilisant une solution de 6 % de perméat de lactosérum électro-activé sous 900 mA pendant 50 min. Parallèlement, les résultats ont montré qu'avec une approche chimique conventionnelle avec du KOH comme catalyseur, les rendements de lactulose étaient de ~27 % en utilisant une solution de 10 % de lactose pendant 60 min et de 25,47 % en utilisant une solution de 6 % de perméat de lactosérum pendant 50 min. Cependant, aucune formation de lactulose n'a été observée en utilisant du lactosérum dans le procédé chimique conventionnel à une alcalinité équivalente de la solution traitée par électro-activation. Les résultats de cette étude ont révélé que la technologie d'électro-activation est plus efficace pour la production du lactulose à partir du lactose pur, du lactosérum et du perméat de lactosérum par rapport au processus d'isomérisation chimique conventionnelle. Par la suite, la faisabilité d'utiliser les substrats à base de lactose électro-activé, du lactosérum électro-activé et du perméat de lactosérum électro-activé comme sources de carbone pour produire de la biomasse riche en protéines et métabolites à valeur commerciale élevée comme des acides organiques (lactique, acétique, citrique et propionique) et des biomolécules aux propriétés aromatiques et gustatives a été étudiée en utilisant une culture microbienne mixte provenant de grains de kéfir comme ferment et une culture pure de Kluyveromyces marxianus. La fermentation a été réalisée pendant 96 h à 30 °C en utilisant les substrats électro-activés et non électro-activés du lactose, du lactosérum et du perméat de lactosérum. Les résultats obtenus ont montré que les substrats électro-activés ont permis d'atteindre une croissance de la biomasse la plus élevée en un temps de fermentation réduit comparativement aux substrats non électro-activés en utilisant la culture de kéfir comme agent de fermentation. La croissance cellulaire la plus élevée (6,04 g/L) a été obtenue dans le lactosérum électro-activé après 72 h, qui était 1,7 fois supérieure à ce qui était obtenu dans le milieu clostridien renforcé (RCM). De plus, le lactosérum électro-activé a permis de produire un maximum de 8,46, 3,97, 0,60 et 1,02 g/L d'acide lactique, acétique, citrique et propionique, respectivement. De plus, le lactosérum électro-activé a permis la production de kéfiran la plus élevée de 2,99 g/L, suivi par le lactosérum (2,67 g/L), le perméat de lactosérum électro-activé (2,31 g/L), le perméat de lactosérum (1,88 g/L), le milieu RCM (1,42 g /L), le lactose électro-activé (1,37 g/L) et le lactose (0,91 g/L). Les résultats ont également démontré que divers composés aromatiques volatils étaient produits au cours de la fermentation du lactosérum électro-activé, ce qui peut améliorer les caractéristiques organoleptiques et la qualité sensorielle des produits fermentés. Également, K. marxianus a également montré une production satisfaisante de la biomasse dans tous les substrats utilisés et que le lactosérum électro-activé a permis d'atteindre une biomasse maximale (4,23 g/L) après 96 h de fermentation, suivie du milieu standard YM (4,85 g/L). La biomasse produite avait une teneur élevée en protéines et en lipides (24,43-57,83 et 15,44-25,64 %, respectivement) dépendamment des substrats utilisés et des conditions de fermentation. Plusieurs acides organiques majeurs comme les acides lactique, acétique, citrique et propionique ont été produits pendant la fermentation sur tous les milieux, avec des différences significatives entre les substrats électro-activés et non électro-activés. De plus, K. marxianus a produit divers composés aromatiques volatils aux propriétés organoleptiques appréciées. Le milieu de culture YM a entraîné la plus faible production d'éthanol (8,42 g/L à 48 h) tandis que la plus forte production d'éthanol a été produite dans le lactosérum non électro-activé (28,13 g/L à 48 h), suivi du lactose (27,85 g/L à 48 h), du lactose électro-activé (26,77 g/L à 36 h), du perméat de lactosérum (25,99 à 72 h), du perméat de lactosérum électro-activé (24,66 g/L à 36 h) et du lactosérum électro-activé(22,06 g/L à 48 h). De plus, un maximum de 393,85 à 988,22 mg/L de 2-phényléthanol a été atteint, selon les substrats utilisés. Par conséquent, les résultats de ce projet suggèrent que la technologie d'électro-activation peut être une approche durable émergente permettant d'atteindre le double objectif de production de lactulose, un prébiotique reconnu et éprouvé, et de valorisation intégrale du lactosérum et de ses dérivés en utilisant des bioprocédés à base de culture de kéfir et de K. marxianus pour produire des métabolites à valeur commerciale élevée pour différentes applications; y compris pour l'industrie de l'alimentation humaine et animale. Ainsi, les connaissances obtenues dans ce projet pourront servir à améliorer la valorisation du lactosérum. / Whey and whey permeate (WP) are the main agro-industrial by-products from cheese or casein production process that are regarded as environmental pollutants because of their high organic load (high biochemical and chemical oxygen demand) and are creating a major disposal problem for the dairy industry. Consequently, there is a serious demand of developing a sustainable approach for their utilization to evade environmental pollution. In this context, the study was intended to compare the electro-activation (EA) technology with a chemical isomerization process at equivalent solution alkalinity to produce a prebiotic lactulose using lactose, whey, and WP as feedstocks and to valorize the electro-activated materials into valuable metabolites using a whole Kefir culture and a pure culture of Kluyveromyces marxianus as an integrated approach for complete valorization of these waste products. The EA technique was applied to isomerize lactose into lactulose in an EA react or modulated by anion and cation exchange membranes. Electro-isomerization of lactose into lactulose was performed by using lactose (5, 10, 15, and 20%, w/v), whey (7, 14, and 21%, w/v), and WP (6, 12, and 18%, w/v) solutions under current intensities of 300, 600, and 900 mA during 60 min with a sampling interval of 5 min. The conventional chemical isomerization was carried out at the KOH-equivalent solution alkalinity corresponding to that measured in the electro-activated lactose (EA-lactose), electro-activated whey (EA-whey), electro-activated whey permeate (EA-WP) solutions at each 5 min interval using KOH powder as a catalyst at ambient temperature (22 ± 2 °C). The results showed that the production of lactulose using the EA approach was current intensity-, solution concentration-, and reaction time-dependent. The highest lactulose yields of 38 (at 40 min for a 900 mA and 10% lactose solution), 32 (at 60 min for a 900 mA and 7% whey solution), and 36.98% (at 50 min for a 900 mA and 6% WP solution) were achieved for lactose, whey, and WP, respectively. Whereas the maximum lactulose yields of ~27 (at 60 min for 10% lactose solution) and 25.47% (at 50 min for 6% WP solution) were obtained for lactose and WP, respectively. However, no lactulose was produced for whey using the chemical process at the equivalent solution alkalinity as in the EA technique. The outcomes of this study revealed that the EA technology is a more efficient technique for the enhanced production of lactulose from lactose, whey, and WP compared to the convention chemical isomerization process. Thereafter, the feasibility of using electro-activated whey-based substrates including EA-lactose, EA-whey, EA-WP as carbon sources to produce protein enriched biomass and valuable metabolites including organic acids (i.e., lactic, acetic, citric, and propionic acids) and biomolecules with aroma and flavor properties was studied using a mixed microbiota originated from whole kefir grains as a starter culture and a pure culture of Kluyveromyces marxianus ATCC 64884. Fermentation was performed for 96 h at 30 °C using both electro-activated (EA) and non-electroactivated (non-EA) substances of lactose, whey, and WP. The results showed that the EA-substrates achieved a higher biomass growth in a reduced fermentation time than their non-EA mediums using the kefir culture. The highest cell growth (6.04 g/L) was obtained for EA-whey after 72 h which was even 1.7-fold higher than a standard nutrition broth, the reinforced clostridial medium (RCM). Furthermore, EA-whey produced a maximum of 8.46, 3.97, 0.60, and 1.02 g/L of lactic, acetic, citric, and propionic acid, respectively. Moreover, EA-whey achieved the highest kefiran production of 2.99 g/L, followed by the whey (2.67 g/L), EA-WP (2.31 g/L), WP (1.88 g/L), RCM broth (1.42 g/L), EA-lactose (1.37 g/L), and lactose (0.91 g/L). The results also demonstrated that various aromatic volatile compounds were produced during the fermentation of EA-whey, which may increase the organoleptic characteristic/sensory quality of the fermented products. Nevertheless, K. marxianus also demonstrated a satisfactory biomass growth in all substrates used and EA-whey achieved a maximum biomass (4.23 g/L) at 96 h of fermentation followed by YM broth (4.85 g/L). The produced biomass had high protein and lipid content (24.43-57.83, and 15.44-25.64%) depending on the used substrates and fermentation conditions. Several major organic acids including lactic, acetic, citric, propionic acids were produced during the fermentation on all media, with significant differences between electro-activated and non-electro-activated substrates. Furthermore, K. marxianus produced various volatile aroma compounds with valued organoleptic properties. The YM-broth resulted in the lowest ethanol production (8.42 g/L at 48 h) while the highest ethanol was produced in the non-electro-activated whey (28.13 g/L at 48 h), followed by lactose (27.85 g/L at 48 h), EA-lactose (26.77 g/L at 36 h), WP (25.99 at 72 h), EA-WP (24.66 g/L at 36 h), EA-Whey (22.06 g/L at 48 h). Moreover, a maximum of 393.85 to 988.22 mg/L of 2-phenylethanol was achieved, depending on the substrates used. Therefore, the results of this work suggest that the EA technology can be an emergent sustainable technology for achieving dual objectives of prebiotic lactulose production and concurrent valorization of whey and its derivatives in Kefir culture and K. marxianus driven bioprocesses to produce valuable metabolites for different applications including in food and feed industry. Thus, this knowledge is not only helpful to reduce the production cost of dairy industries, but also provide an eco-friendly alternative for the disposal of whey/WP as a part of integrated approach for complete valorization.

Le lactosérum est un coproduit de l'industrie de fabrication du fromage et de la caséine et se caractérise par une forte demande chimique et biologique en oxygène. Les énormes quantités de lactosérum générées dans le monde, sa composition particulière et son utilisation limitée dans l'industrie alimentaire rendent nécessaire la recherche d'autres moyens d'ajouter de la valeur à cet ingrédient en vue d'augmenter la rentabilité de la transformation du lait. Dans ce contexte, la technologie de l'électro-activation (EA) offre la possibilité de valoriser le lactosérum par la conversion in situ d'une partie du lactose en lactulose, un prébiotique bien connu et éprouvé. De plus, l'EA cathodique du lactosérum a montré une formation des bases de Schiff suite à la glycation avec différents sucres des protéines, des peptides et des acides aminés libres dans le processus d'électro-isomérisation du lactose en lactulose. Ces produits sont connus pour leur forte activité antioxydante. Ainsi, l'EA ouvre une possibilité de générer un ingrédient fonctionnel avec une valeur ajoutée significative. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de doctorat était d'étudier et de démontrer la faisabilité technologique de l'utilisation du lactosérum électro-activé comme ingrédient fonctionnel à haut potentiel prébiotique dans la production de différents produits laitiers fermentés. La première étape de ce projet a été l'évaluation du comportement du lactosérum électro-activé dans la matrice de gel de lait fermenté. Une comparaison entre le pourcentage de matière grasse du lait, l'inoculum de lactosérum et le type de lactosérum a été effectuée. À cette fin, des échantillons de lait fermenté ont été préparés avec un ajout de 3, 6 et 9 % de lactosérum des deux types (électro-activé et non électro-activé). Il a été constaté que le lactosérum électro-activé prolongeait le temps d'obtention d'un pH de 4,6 en fonction de la quantité ajoutée. Ceci a été attribué à la capacité tampon plus élevée du lactosérum électroactivé; les résultats de l'acidité titrable ayant démontré des niveaux élevés de groupes acides libres. La microstructure du gel obtenu avec l'ajout du lactosérum électro-activé a montré une structure uniforme et moins poreuse, ce qui était en accord avec les résultats de la réduction de la synérèse. Pour confirmer ces résultats, un autre produit laitier fermenté avec un ajout de lactosérum électro-activé a été également développé. Le kéfir enrichi de lactosérum électro-activé présentait également une phase de fermentation prolongée. Les particules de lactosérum EA ont été incorporées de manière homogène dans la matrice du gel de kéfir. Par conséquent, aucune synérèse n'était visible dans les échantillons de kéfir additionnés de lactosérum EA à 9 %. De plus, les deux produits contenaient des niveaux élevés d'acides organiques (lactique, citrique, acétique, propionique et butyrique) lorsqu'ils étaient supplémentés avec du lactosérum EA. La production d'acide butyrique a été induite par l'ajout de lactosérum des deux types. L'analyse HPLC a révélé qu'environ 75-85% des niveaux initiaux de lactulose ont été conservés dans les produits avec du lactosérum EA après le processus de fermentation, ce qui démontre que la consommation de tels produits pourrait constituer une source de lactulose pour le consommateur. La deuxième étape de cette recherche a été d'optimiser l'utilisation du lactosérum électro-activé en tant qu'ingrédient par son incorporation dans le produit qui convient à sa couleur et aux caractéristiques de la réaction de Maillard et des conjugués entre les matières azotées avec les sucres. Le lait fermenté cuit, Ryazhenka, a été testé comme une matrice alimentaire appropriée pour véhiculer le lactosérum EA enrichi en lactulose. L'extension du temps de fermentation a été moins importante pour ce produit. Ainsi, le Ryazhenka additionné de lactosérum à 9% a atteint un pH de 4,6 après 4 h de fermentation. Le produit additionné de lactosérum EA (9%) a atteint ce niveau après 6,5 h. De plus, le lactosérum EA a amélioré la capacité antioxydante de Ryazhenka. Au cours de cette étape, nous avons démontré par des tests in vitro que l'électro-activation du lactosérum peut diminuer l'allergénicité de la β-lactoglobuline de 19,52 mg/kg à 7,56 mg/kg, qui s'est stabilisée à 12,13 mg/kg après neutralisation. Comme le protocole de production de Ryazhenka comprend une étape de cuisson de 3 à 5 h à 97-100°C, on considère qu'il présente des taux d'allergénicité plus faibles en raison des changements de conformation des protéines induits par la chaleur. Ainsi, l'ajout de lactosérum électro-activé ne contribue pas à l'augmentation de l'allergénicité de ce produit. Le troisième objectif de cette étude était de démontrer un potentiel prébiotique du lactosérum électro-activé en cultivant des bactéries probiotiques Lactobacillus rhamnosus subsp, Lactobacillus rhamnosus GG et Lactobacillus acidophilus ATCC4356. La densité optique(OD₆₀₀), le dénombrement sur plaques de Petri, la stabilité durant l'entreposage à 4 °C et la tolérance aux acides et à la bile des bactéries cultivées pendant 24 heures dans du lactosérum électro-activé ont été étudiés et comparés aux résultats obtenus par la culture sur du lactosérum, du lactosérum additionné de lactulose, du MRS et du MRS avec ajout de lactulose. Les valeurs OD₆₀₀ les plus élevées (>2) ont été obtenues dans les biomasses de lactosérum EA pour toutes ces bactéries. Cependant, les numérations sur plaque de Petri n'ont pas confirmé un nombre plus élevé de cellules bactériennes dans du lactosérum électro-activé. On peut donc conclure que le lactosérum électro-activé a probablement stimulé un métabolisme distinct chez les bactéries testées, ce qui est conforme à la définition des prébiotiques qui ont la particularité d'induire une stimulation de la croissance et/ou de l'activité des bactéries probiotiques afin de conférer des avantages pour la santé. En résumé, cette recherche a validé la faisabilité technologique de l'utilisation du lactosérum électro-activé comme ingrédient dans la production de lait fermenté et source de lactulose qui reste stable durant l'entreposage pendant 14 jours à 4 °C. Également, ce projet a montré que le lactosérum électro-activé est un ingrédient fonctionnel prometteur pour une éventuelle utilisation potentielle comme additif alimentaire fonctionnel et prébiotique dans l'industrie laitière. De plus, il peut être utilisé comme agent protecteur pour améliorer la viabilité et l'activité des probiotiques.