Cellular response to inflammatory cytokines involves concerted changes in gene expression. Cytokines, such as IL-6 and TNF-α, regulate gene expression through multiple intracellular signaling pathways. The activation of transcription factors is one of the important mechanisms through which these cytokines regulate gene expression, and NF-κB is a key transcription factor that is activated by TNF-α during inflammation. In this study, we have utilized green fluorescent protein reporter cells along with fluorescence microscopy, image analysis and mechanistic modeling to determine the activation dynamics of NF-κB in H35 rat hepatoma cells upon TNF-α stimulation. NF-κB reporter cells were monitored for induction of GFP expression for 24 hours following continuous stimulation with 2.5ng/mL, 10ng/mL and 25ng/mL TNF-α. As expected, TNF-α addition resulted in a significant increase in fluorescence. Relative fluorescence profiles were generated from the fluorescence intensity data, and indicated that fluorescence increases up to 24 hours after an initial delay of approximately four hours. The fluorescence data was also used to develop a model describing significant events leading to NF-κB activation and GFP expression. In addition, a model describing regulatable expression of GFP upon stable integration into the genome was also developed. Comparing these two models led to the construction of a third model depicting NF-κB activation dynamics. Simulation of the model representing NF-κB activation dynamics yielded an NF- κB activation profile, which demonstrated that in the presence of constant TNF-α stimulation, there is an approximate 90 minute hour time delay followed by a rapid increase in nuclear NF-κB, that reaches a steady state value at approximately two hours. This study establishes a method to derive NF-κB activation from reporter cell fluorescence data, and can be used to infer dynamics of activation of other transcription factors using GFP reporter cell lines.

Le NF-κB est un facteur de transcription crucial dans la régulation de lexpression de gènes impliqués dans la réponse immune, la prolifération et la survie cellulaires. Ce facteur de transcription peut être activé par de nombreux inducteurs incluant notamment les espèces réactives de loxygène (ROS). En labsence de stimuli, NF-κB est séquestré dans le cytoplasme des cellules par la protéine IκBα. Lors dun stimulus, IκBα est phosphorylée et par la suite dégradée permettant ainsi la translocation du NF-κB dans le noyau. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés au mécanisme dactivation du NF-κB par un stress oxydant via la phosphorylation dIκBα sur tyrosine (voie atypique). Nous avons eu recours à deux types dapproches : une première in vitro et une seconde in vivo, se rapprochant fortement de conditions physiopathologiques chez lhomme. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la chaperonne Hsp90 jouait un rôle clé dans la voie dactivation du NF-κB par un inducteur de stress oxydant, le pervanadate de sodium (PV). Cette voie dactivation requiert la phosphorylation de la protéine IκBα sur la tyrosine 42 par la tyrosine kinase c-Src. Grâce à lutilisation dun inhibiteur dHsp90, la geldanamycine, nous avons observé que la phosphorylation dIκBα et lactivité de c-Src étaient inhibées par ce composé pharmacologique et par conséquent lactivation du NF-κB également. Dans la suite de ce travail, nous avons utilisé deux techniques expérimentales permettant dinduire un stress oxydant, in vivo, au niveau du cerveau murin. Celles-ci sont linjection intracérébrale de FeCl2 et lischémie/reperfusion cérébrale. En ce qui concerne linjection intracérébrale de FeCl2, nous avons confirmé que cette technique engendrait une production importante de ROS. Nous avons observé que linjection de FeCl2 induisait lactivation du NF-κB. De plus, nos résultats suggèrent que cet inducteur active NF-κB via la phosphorylation dIκBα sur la tyrosine 42. Les mêmes observations ont été effectuées lors dune ischémie/reperfusion cérébrale. En effet, celle-ci induit également une activation du NF-κB ainsi que la phosphorylation dIκBα sur la tyrosine 42. Lensemble de ces données suggère dune part quHsp90 joue un rôle clé dans la voie dactivation atypique du NF-κB et dautre part quun stress oxydant in vivo induit lactivation du NF-κB ainsi que la phosphorylation dIκBα sur la tyrosine 42.

Cellular response to inflammatory cytokines involves concerted changes in gene expression. Cytokines, such as IL-6 and TNF-α, regulate gene expression through multiple intracellular signaling pathways. The activation of transcription factors is one of the important mechanisms through which these cytokines regulate gene expression, and NF-κB is a key transcription factor that is activated by TNF-α during inflammation. In this study, we have utilized green fluorescent protein reporter cells along with fluorescence microscopy, image analysis and mechanistic modeling to determine the activation dynamics of NF-κB in H35 rat hepatoma cells upon TNF-α stimulation. NF-κB reporter cells were monitored for induction of GFP expression for 24 hours following continuous stimulation with 2.5ng/mL, 10ng/mL and 25ng/mL TNF-α. As expected, TNF-α addition resulted in a significant increase in fluorescence. Relative fluorescence profiles were generated from the fluorescence intensity data, and indicated that fluorescence increases up to 24 hours after an initial delay of approximately four hours. The fluorescence data was also used to develop a model describing significant events leading to NF-κB activation and GFP expression. In addition, a model describing regulatable expression of GFP upon stable integration into the genome was also developed. Comparing these two models led to the construction of a third model depicting NF-κB activation dynamics. Simulation of the model representing NF-κB activation dynamics yielded an NF- κB activation profile, which demonstrated that in the presence of constant TNF-α stimulation, there is an approximate 90 minute hour time delay followed by a rapid increase in nuclear NF-κB, that reaches a steady state value at approximately two hours. This study establishes a method to derive NF-κB activation from reporter cell fluorescence data, and can be used to infer dynamics of activation of other transcription factors using GFP reporter cell lines.

Le cytosquelette dactine est une structure dynamique impliquée dans de nombreux processus biologiques tels que les mouvements cellulaires, la phagocytose ou encore la mitose. En plus de son intervention dans ces différents événements essentiels pour lhoméostasie de la cellule, de nombreuses études ont démontré quil était également capable dinfluer sur des voies de transduction notamment en modulant lactivité de protéines kinases ou de facteurs de transcription. Un facteur de transcription important est le facteur de transcription NF-κB. Ce facteur de transcription joue un rôle majeur dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que les réponses immunitaires innée et adaptative, la réponse inflammatoire, lapoptose et la division cellulaire. Il peut être activé en réponse à de nombreux stimuli tels que les cytokines pro-inflammatoires, les produits bactériens ou viraux ou encore suite à un stress oxydant. Malgré les différentes études démontrant que le cytosquelette dactine est capable de moduler certaines voies de signalisation et que certains stimuli capables dactiver le NF-κB, comme le LPS et le TNFα, sont également associés à des modifications du cytosquelette dactine, peu de travaux ont été réalisés afin de déterminer limpact des perturbations du cytosquelette dactine sur lactivation de cet important facteur de transcription. Ces différents arguments nous ont donc poussé à étudier le rôle des perturbations du cytosquelette dactine dans les voies dactivation du NF-κB. Ainsi, dans une première partie, nous avons étudié leffet de plusieurs agents perturbant le cytosquelette dactine [la Cytochalasine D (CytD), le Jasplakinolide (JP) et la Latrunculine B (Lat B)] sur lactivation du NF-κB. Nous avons pu mettre en évidence que ces différentes substances sont capables dinduire la voie classique dactivation du NF-κB uniquement dans des cellules myélomonocytaires. De plus, nous avons également observé que ces agents sont capables dinduire la production despèces réactives à loxygène (ROS) Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à leffet de la CytD sur lactivation du NF-κB dans des cellules myélomonocytaires induites par le TNFα ou le LPS. Nous avons pu démontrer que la CytD promouvoit la voie classique du NF-κB dans les cellules induites par le LPS. En effet, il semblerait que la CytD agisse notamment sur cette voie en augmentant le temps de résidence du récepteur à cet inducteur, le TLR4, à la surface de la membrane plasmique. Parallèlement à ces observations, nous avons pu mettre en évidence que la CytD augmente la phosphorylation de certains résidus de la sous-unité RelA du NF-κB induite par les deux inducteurs classiques ce qui permet un meilleur recrutement de la RNA polymérase II sur le promoteur endogène de la chémokine IL-8.

Le facteur de transcription NF-KB joue un rôle essentiel dans le développement, l’homéostasie, la survie du système immunitaire, mais également dans la propagation de certains lymphomes. L’activation optimale de NF-ΚB en réponse à l’engagement de nombreux immunorécepteurs repose sur la mise en place de larges signalosomes dans lesquels des adaptateurs spécifiques sont recrutés et poly-Ubiquitinylés de façon non-Dégradative. En réponse à des cytokines pro-Inflammatoires ou à l’activation des récepteurs antigéniques, ces adaptateurs ubiquitinylés s’accumulent sur la face cytoplasmique du réticulum endoplasmique (RE) via la protéine du RE metadherine (MTDH) qui assure la propagation du signal NF-KB. Toutefois, la nature des E3 ligases en charge de relayer NF-KB au niveau des organites intracellulaires reste méconnue. C’est pourquoi j’ai réalisé le crible par bioluminescence d’une librairie de siRNA dirigée contre les 46 E3 ubiquitine ligases humaines pourvues d’un domaine transmembranaire qui les ancrent au niveau de différents compartiments cellulaires afin d’étudier leur impact sur l’activation de NF-KB en réponse à une stimulation antigénique dans un modèle de lymphocytes T immortalisés Jurkat. Nous avons identifié la protéine du RE TRIM13 comme un régulateur positif de la signalisation NF-ΚB. Nos données suggèrent un modèle dans lequel TRIM13 régule l’activation de NF-KB en modulant indépendamment l’activation de deux membres clés de la famille NF-KB au cours de l’activation lymphocytaire, RelA (p65) et c-Rel.Lors de cette thèse, j’ai également participé au crible d’une librairie de siRNA ciblant les 96 déubiquitinases (DUBs) codées par le génome humain afin d’identifier celles en charge de ramener les cellules vers leur état basal. Ceci a permis la caractérisation de la protéase spécifique de l’ubiquitine USP34 (Ubiquitin specific protease 34). La réduction des niveaux endogènes de USP34 potentialise l’activation de NF-KB en réponse à l’engagement du récepteur antigénique T ou du récepteur au TNFa et la liaison de NF-KB à l’ADN est accrue. Collectivement, ces résultats suggèrent que USP34 est un nouvel acteur impliqué dans la régulation négative de NF-KB.Ces résultats illustrent l’importance des processus d’ubiquitination réversibles dans la régulation de la signalisation NF-ΚB et introduisent les cribles génétiques comme un outil efficace pour l’identification de régulateurs de processus biologiques divers. / The transcription factor NF-KappaB plays a critical role in the development, homeostasis, the survival of the immune system, but also in the propagation of certain lymphomas. The optimal activation of NF-KappaB in response to the engagement of many immunoreceptors rely on the implementation of large signalosomes where specific adaptors are recruited and poly-Ubiquitinylated in a non-Degradative manner. In response to proinflammatory cytokines or activation of antigen receptors, these Ubiquitinylated adaptors accumulate on the cytoplasmic leaflet of the endoplasmic reticulum (ER) via the ER protein metadherin (MTDH) providing NF-KappaB signal propagation . However, the nature of the E3 ligases responsible for relaying NF-KappaB in intracellular organelles remains unknown. This is why I made the screen ingby bioluminescence of a library of siRNAs targeting the 46 human ubiquitin E3 ligases provided with a transmembrane domain that anchor them at different cellular compartments to study their impact on the NF-KappaB activation in response to antigenic stimulation in immortalized T lymphocytes Jurkat. We identified the ER-Protein TRIM13 as a positive regulator of NF-KappaB signaling. Our data suggest a model in which TRIM13 regulates the activation of NF-KappaB activation by modulating independently two key members of the NF-KappaB family during lymphocyte activation, RelA (p65) and c-Rel. In this thesis, I also participated in the screening of a library of siRNAs targeting the 98 deubiquitinases (DUBs) encoded by the human genome to identify those in charge of the reset of the system to basal state. This screen allowed the characterization of the ubiquitin-Specific protease USP34 (ubiquitin specific protease 34). The reduction of endogenous levels of USP34 potentiates the activation of NF-KappaB in response to engagement of the antigen receptor or T receptor antagonists and enhances NF-KappaB DNA binding. Collectively, these results suggest that USP34 is a new player involved in the negative regulation of NF-KappaB. These results illustrate the importance of reversible ubiquitination process in the regulation of the NF-KappaB signaling and introduce genetic screens as an effective tool to identify regulators of diverse biological processes.

Suite à une infection par des microorganismes tels que des virus, lorganisme hôte met rapidement en place une réponse immunitaire. Celle-ci a lieu en deux étapes. Tout dabord, la réponse immunitaire innée et ensuite, la réponse immunitaire adaptative. Lors de la réponse immunitaire innée, lactivation des Pathogen Recognition Receptors par les Pathogen-Associated Molecular Patterns conduit à lactivation de deux facteurs de transcription clés, NF-kappaB et IRF3 qui coopèrent afin dinduire lexpression de lIFN-beta. À son tour, lIFN-beta active une seconde voie de signalisation assurant lexpression des Interferon-Stimulated Genes encodant des protéines qui possèdent des fonctions antivirales leur permettant de limiter la propagation de linfection. Durant cette thèse de doctorat, nous nous sommes intéressés à la capacité du virus de la varicelle et du zona (VZV) à activer une telle réponse immunitaire innée. Nous avons observé que le VZV induit une phosphorylation atypique dIRF3 lempêchant dhomodimériser et conduisant dès lors à une inhibition de lexpression des gènes cibles tels que lIFN-beta et lISG15. Nous avons également démontré que la phosphorylation atypique dIRF3 induite par le VZV dépendait dune des deux kinases virales, celle encodée par lORF47 et non pas par lORF66. En effet, lutilisation de deux virus mutants incapables dexprimer soit lORF47p (VZV ROka47S) soit lORF66p (VZV ROka66S), nous ont permis de démontrer, que seulement en labsence dexpression de la kinase virale ORF47p, le VZV est incapable dinduire la phosphorylation atypique dIRF3 ce qui lui permet à nouveau dhomodimériser. Nous avons également montré que, contrairement à ce qui est observé dans des cellules infectées par le VZV sauvage, les quantités dARN messagers de lIFN-beta et de lISG15 sont considérablement accrues en labsence dexpression de lORF47p. De plus, nous avons montré, par expérience de co-immunoprécipitation dans des cellules exprimant de façon artificielle lORF47p taggé HA et lIRF3 taggé V5, que lORF47p interagit physiquement avec IRF3. Toutes ces données démontrent que le VZV a développé des mécanismes lui permettant déchapper au système immunitaire de lhôte en ciblant lactivation dIRF3. En effet, par le biais de sa kinase encodée par lORF47, le VZV est capable dinterférer avec lactivation dIRF3 et lexpression subséquente de lIFN-beta et de lISG15, deux protéines cellulaires importantes pour la mise en place de la réponse antivirale. Cependant, le mécanisme exact par lequel lORF47p induit la phosphorylation atypique dIRF3 en réponse à une infection par le VZV reste encore inconnu. Nous avons également consacré une partie de cette thèse à létude de lactivation du NF-kappaB par le VZV. Comme démontré précédemment par notre équipe (El Mjiyad et al., 2007), nous avons observé que le VZV interfère avec lactivation du NF-kappaB et que cette inhibition, contrairement à IRF3, ne dépend pas des kinases virales ORF47p et ORF66p.

CK2 is a ubiquitous serine/threonine protein kinase implicated in numerous cellular processes as well as in tumorigenesis. CK2 is composed of two catalytic (αα, αα’, α’α’) subunits and two regulatory (ββ) subunits that assemble to form the active CK2 holoenzyme. CK2 has been shown to phosphorylate, interact with, and regulate other proteins, including other protein kinases. CK2 substrates can be initially bound by the CK2β regulatory subunit, which acts as a docking site to facilitate phosphorylation and mediate CK2 substrate specificity. In a screen to identify novel CK2β interacting proteins, I identified three novel CK2β interactors, including the mitogen- and stress-activated kinase 2 (MSK2), which I pursued for further characterization. MSK2, and the closely related isoform MSK1, are nuclear kinases that are activated following mitogen stimulation or cellular stress, including UV radiation, by the ERK1/2 and p38-MAPK signaling cascades, respectively. However, factors that differentially regulate MSK1 and MSK2 have not been well characterized. In my thesis, I demonstrate that CK2, which contributes to NF-κB activation following UV radiation in a p38-dependent manner, physically interacts with MSK2 but not MSK1 and that CK2 inhibition specifically impairs UV-induced MSK2 kinase activation. A putative site of CK2 phosphorylation was mapped to MSK2 residue serine-324 and when substituted to alanine (S324A) also compromised MSK2 activity. RNA interference-mediated depletion of MSK2 in human MDA-MB-231 cells, but not MSK1 depletion, resulted in impaired UV-induced phosphorylation of NF-κB p65 at serine-276 in vivo, which was restored by the ectopic expression of MSK2 but not by MSK2-S324A. Furthermore, UV-induced p65 transactivation capacity was dependent on MSK2, MSK2 residue S324, and p65-S276. These results suggest that MSK1 and MSK2 are differentially regulated by CK2 during the UV response and that MSK2 is the major protein kinase responsible for the UV-induced phosphorylation of p65 at S276 that positively regulates NF-κB activity in MDA-MB-231 cells.

L'ajout simultané d'inhibiteurs des histones déacétylases (HDAC) au TNFα prolonge l'induction du facteur de transcription NF-kB en stabilisant l'activation du complexe IKK. Au cours de ce travail, l'effet de la Trichostatin A (TSA), un inhibiteur de HDACs à large spectre daction, sur les différentes voies d'activation du NF-kB a été étudié. L'effet de laddition simultanée de la TSA aux inducteurs de la voie classique (TNFα, PMA), de la voie alternative (Lymphotoxine β) et des voies alternatives (H2O2 et Pervanadate de Sodium) a été analysé. Le pervanadate de sodium (PV) est agent insulino-mimétique qui inhibe les tyrosines phosphatases et mime un stress oxydant. Ces études comparatives ont montré un prolongement de l'activité du NF-kB si la TSA est ajoutée simultanément au TNFα, PMA et au PV ; pas si elle est ajoutée à l'H2O2 ou à des agents induisant la voie alternative. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux prolongements de l'activation élicitée par le TNFα et le PV ont été étudiés en détails. Deux processus différents sont impliqués. La TSA ajoutée aux inducteurs de la voie classique prolonge l'activité du complexe IKK alors qu'ajoutée au PV elle induit un retard de synthèse important du mRNA de l'inhibiteur IkBα. De nombreuses expériences d'immuno-précipitation de la chromatine ont montré que l'ajout de la TSA au PV diminue (i) le recrutement de l'ARN polymérase II, (ii) l'acétylation et la phosphorylation de l'histone H3 sur la Lys14 et la Ser 10 respectivement, (iii) la phosphorylation sur la Ser 536 de p65 et (iv) le recrutement d'IKKα. Il est important de savoir qu'aucune de ces différences ne s'observent au niveau du promoteur d'Icam-1, un autre gène dépendant du NF-kB. Ces observations ont donc montré que l'effet de la TSA sur l'activation du NF-kB dépend non seulement du type de stimuli mais aussi du promoteur. Ce travail met en évidence un rôle inhibiteur des HDAC dans l'activation du NF-kB qui varie en fonction des stimuli.

The transcription factor NF-κB is a key regulator in many physiological processes, including innate and adaptative immune responses, inflammation and lymphoid organ development. NF-κB plays a crucial role in the development of B and T cells, by maintaining the cell death/survival equilibrium and therefore, constitutive activation of NF-κB is thought to contribute to the development and/or progression of B and T cell malignancies. The nfκb2 gene is frequently involved in chromosomal translocations associated with the development of various lymphomas and leukemias. These rearrangements all lead to the production of C-terminally truncated p100 proteins lacking variable portions of the ankyrin repeats domain, suggesting that this common feature may be involved in tumor development. However, whereas the oncogenic potential of such proteins is well established, the underlying mechanisms remain poorly understood. The aim of this work was to better understand these mechanisms by which such alterations contribute to lymphomagenesis. We then choose to investigate the functions of the protein Hut78 as representative of these p100ΔC mutants found in tumor cells. We identified mmp9 as a target gene of p52 and p52-producing NF-κB2 mutants and defined p52 as a key molecule for the invasive potential of lymphoma-derived cells harboring enhanced activity of the NF-κB alternative pathway. Moreover, we found that this p52/Hut78-mediated transcriptional induction of MMP9 involves the recruitment of MLL1 and MLL2 H3K4 histone methyltransferase complexes by p52 on the mmp9 gene promoter. Taken together, our results provide further insights into the oncogenic potential of the truncated p100 proteins, and by extension, will help to better understand how mutated IκB proteins contribute to deregulated NF-κB activities in haematological disorders.

The IkappaB kinase epsilon (IKKepsilon, IKKi, IKBKE) is both a regulator of innate immunity and a breast cancer oncogene that is amplified and overexpressed in ~30% of breast cancers. IKKepsilon promotes malignant transformation through the activation of NF-kappaB signaling. In addition, breast cancers that harbor amplifications in the IKBKE gene are dependent on IKKepsilon protein expression for survival. IKKepsilon has been characterized as a non-canonical inhibitor of kappaB kinase (IKK) that activates both the interferon response pathway and NF-kappaB signaling in innate immunity. In this dissertation, I explore both the regulation and effectors of the IKKepsilon kinase in the context of malignant transformation. I found that IKKepsilon is modified and regulated by K63-linked polyubiquitination, a proteasome- and degradation-independent form of ubiquitination, at Lysine 30 and Lysine 401. This modification is essential for IKKepsilon-induced kinase function and IKKepsilon-mediated NF-kappaB activation and malignant transformation. Furthermore, I identified TRAF2 as the K63 ubiquitin E3 ligase that associates with and modifies IKKepsilon. I also found that TBK1, a close family member of IKKepsilon, is also regulated by K63-linked ubiquitination. In collaborative work, we used an unbiased positional scanning peptide library screen to identify two novel downstream targets of IKKepsilon phosphorylation in the context of cancer. Specifically, we found IKKepsilon phosphorylates the tumor suppressor CYLD at Serine 418. CYLD phosphorylation at Ser418 downregulates its deubiquitinase activity and is necessary for IKKepsilon-driven transformation. IKKepsilon also phosphorylates TRAF2 at Serine 11. This activity promotes K63-linked TRAF2 ubiquitination, NF-kappaB activation and is also essential for IKKepsilon-transformation. In addition, breast cancer cells that depend on IKKepsilon expression for survival are also dependent on TRAF2. Together, these observations define an oncogenic network that promotes NF-kappaB-mediated cell transformation through the K63-linked ubiquitination of IKKepsilon and subsequent phosphorylation of two novel substrates, TRAF2 and CYLD.