Parkinson’s Disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer’s and old age is the strongest risk factor for developing PD. PD has traditionally been seen as a motor disorder, but its non-motor symptoms such as dysautonomia, sensory dysfunction, sleeping problems and neuropsychiatric features equally add to the disease burden. There is no cure for PD and this is probably a reflection of our poor understanding of the disease pathogenesis. One way of tackling this is to focus on the small, but significant number of PD patients with a family history compatible with Mendelian autosomal inheritance (10-15%). Hereditary and sporadic PD share important clinical and neuropathological features, and there is reasonable hope that dissecting molecular pathways of PD gene products will have more general implications for the pathophysiology of PD associated neurodegeneration and help device new treatment strategies. Mutations in the FBXO7 gene have recently been shown to cause an autosomal recessive early onset Parkinsonian-pyramidal syndrome and FBXO7 has been designated as PARK 15 (Di Fonzo et al., 2009). FBXO7 is a member of the F-box protein family, which functions as the variable subunit of Skp1-Cullin1-F-box protein (SCF) E3 ubiquitin ligase complexes and as such dictate substrate specificity. The canonical outcome of ubiquitylation is proteasomal degradation and my working hypothesis is that FBXO7 may be involved in protein quality control in the brain. A perturbation thereof may be a first step towards FBXO7 dependent disease. At the time of starting with my PhD project, little was known about the molecular function of FBXO7 and how mutations in FBXO7 result in neurodegeneration. In order to learn more and dissect the signalling pathway of FBXO7 I have used tagged stable overexpression cell lines of the FBXO7 wildtype as well as human disease mutant proteins for tag-pulldowns followed by mass-spectrometry to identify interacting partners and possible substrates. With this approach I have been able to confirm the interaction between FBXO7 and its core SCF E3 ligase partners as well as some of the previously reported interacting partners. I have been able to show that not only the FBXO7 wildytpe protein, but also all of the so far reported human disease mutants are able to assemble into an SCF complex. Hence, my fist conclusion is that the human disease mutants do not exert their pathogenicity by SCF complex disruption. Next, a knock-in (KI) mouse model of one of the pathogenic FBXO7 mutations (R378G) was generated and evaluated by molecular and biochemical approaches as well as motor and behaviour phenotyping. In particular, I have used the Fbxo7 mouse model for extensive proteomic screens to identify wildtype (wt) and KI Fbxo7 interactors: endogenous Fbxo7 immunoprecipitations from mouse brain lysates and subsequent fingerprint mass-spectrometry; differential whole proteome: ex vivo differential dimethyl labelling of wt and KI brain samples, and Fbxo7-dependent ubiquitinome analysis: quantitative di-GLY capture proteomics combining in vivo SILAC labelling with antibody-based affinity enrichment of “di-GLY remnant motifs”- containing peptides prior to proteomic profiling of the wild-type in comparison to the homozygous R379G Fbxo7 KI ubiquitinome in MEF lysates. The di-GLY remnant motif is the signature peptide of ubiquitinylated protein sites at peptide level after tryptic digestions. Some of my findings are: • For the first time I show that endogenous Fbxo7 actually assembles into an Skp1-Cullin1-Fbxo7 complex and that the pathogenic R378G does not disrupt SCFFbxo7-KI complex formation in vivo. This is true for the Fbxo7 KI mouse model, but also for patient derived immortalized cell lines carrying the R378G FBXO7 mutation.• Endogenous Fbxo7 interacts with the Sumo E3 ligase complex RanBP2/ RanGAP1*Sumo1/Ubc9 complex. • In the differential enrichment of ubiquitylated protein species in SILAC labelled wild-type and homozygous R379G Fbxo7 KI MEFs, I have clearly identifies 2 highly conserved lysine residues, which are conserved amongst VDAC 1, 2, and 3 in mouse as well as human homologous, to be preferentially ubiquitinylated in a Fbxo7 wild-type background (in collaboration with Dr. Patrick Pedrioli, MRC Programme leader).• There is a significant difference in motor performance between wildtype and homozygous R379G KI Fbxo7 mice at 10 months of age (in collaboration with Dr. Steve Martin, Neuroscience Division, Dundee). • Furthermore, I have successfully set up an in vitro FBXO7 dependent ubiquitinylation assays.

CIAP1 (cellular Inhibitor of Apoptosis 1) possède une activité E3-ubiquitine ligase et présente des propriétés oncogéniques. Récemment, notre équipe a montré que cIAP1 pouvait réguler l’activité du facteur de transcription E2F1. L’objectif de mon travail de thèse était d’approfondir les mécanismes de cette régulation et d’évaluer l’importance de la coopération cIAP1-E2F1 dans l’activité oncogénique de cIAP1. J’ai démontré une interaction d’E2F1 avec la poche hydrophobe du domaine BIR3 de cIAP1. J’ai par ailleurs démontré l’importance de la première hélice α de ce domaine pour l’interaction de cIAP1 avec E2F1 et avec les autres protéines partenaires de cIAP1 capables de lier la poche hydrophobe du domaine BIR3. De plus, j’ai participé au travail montrant pour la première fois une régulation d’E2F1 par une ubiquitinylation non dégradative. cIAP1 permet la conjugaison de chaînes d’ubiquitines de type K63 sur les lysines 161 et 164 d’E2F1. Cette modification post-traductionnelle est indispensable à la stabilisation de la protéine lors d’un stress génotoxique et elle permet le recrutement du facteur de transcription sur les promoteurs des gènes cibles. Enfin, l’analyse des propriétés oncogéniques de cIAP1 n’ont pas permis, à ce jour, d’évaluer l’importance de la coopération cIAP1-E2F1. Cependant, nous avons montré l’importance du domaine BIR1 pour les propriétés oncogéniques de cIAP1 (domaine nécessaire à l’interaction de cIAP1 avec l’adaptateur moléculaire TRAF2). / The cellular inhibitor of Apoptosis 1 (cIAP1) behaves as an E3 ubiquitin ligase and has oncogenic properties. Previously, our team has shown that cIAP1 can regulate the E2F1 transcription factor activity. My research project has been focused on deepening our current knowledge on this interaction. Firstly, we characterized the E2F1-cIAP1 interaction, then we analyzed the regulation of E2F1 by cIAP1 and finally assessed the importance of the cIAP1-E2F1 interaction for the oncogenic properties of cIAP1. I have demonstrated a interaction of E2F1 with the hydrophobic pocket of the BIR3 domain of cIAP1. Moreover, I highlighted that the alpha 1 helix of the BIR3 domain is mandatory for the stability of this pocket. Moreover, we discovered an ubiquitination on lysine 161 and 164 of E2F1 by cIAP1. This ubiquitination is essential for the stability and transcriptional activity of E2F1. Finally, it appears that the cIAP1 BIR1 domain that is required for the interaction with TRAF2 is involved in its oncogenic properties.

L’activation de la signalisation NF-κB par de nombreux immunorécepteurs met en jeu un large signalosome. Afin de propager cette signalisation en réponse à différents stimuli, l’oligomérisation d’adaptateurs pourvus de domaines d’interaction protéine-protéine est nécessaire. Alors que certains adapteurs sont communs d’autres sont spécifiques à un immunorécepteur donné. Une des principales caractéristiques partagées par toutes ses protéines est leur capacité à être poly-ubiquitinylé de façon non-dégradative afin d’aboutir à une activation optimale de NF-κB. Ce projet avait pour objectif d’identifier de nouvelles déubiquitinylases impliquées dans la signalisation NF-κB. C’est ainsi que nous avons identifié USP34 comme étant un régulateur négatif de la signalisation NF-κB induite par le TCR dans des cellules Jurkats, une lignée de lymphocytes T immortalisés. Nos données suggèrent un modèle dans lequel USP34 permet d’éviter l’activation excessive de NF-κB, en agissant directement ou indirectement sur les dimères NF-κB/IκBα, en aval d’IKK, et en modulant l’affinité du facteur de transcription pour l’ADN. Parallèlement, l’étude du microenvironnement des membranes endocellulaires responsables du recrutement des signalosomes formés en réponse à l’activation du TCR, du TNFR et du CD40 a permis l’identification d’une protéine - clé de la signalisation NF-κB, la MTDH. Cette protéine du RE s’est révélée être un relais déterminant pour l’activation d’IKK et donc la propagation du signal NF-κB. / Large signalosome assembly is a prerequisite for NF-κB signaling upon engagement of various immunoreceptors. Adaptor proteins containing protein-protein interaction domains oligomerise in response to such stimuli in order to propagate signaling. Each immunoreceptor uses distinct adaptors, as well as common ones, to achieve that. The main characteristic shared by these proteins is their ability to undergo poly-ubiquitinylation in a non-degradative manner, leading to optimal NF-κB activation. In this work, we aimed to identify novel deubiquitinylating enzymes that control ubiquitinylation status. That is how USP34 came up to be a negative regulator of NF-κB signaling in TCR-activated Jurkat cells, a T lymphocyte cell line. Our data suggest a model whereby USP34 prevents excessive NF-κB activation by acting rather late, directly or indirectly on the NF-κB:IκBα dimers, downstream of IKK, altering transcription factor DNA binding affinity. In parallel, studies of the endocellular membrane microenvironment that hosts mature signalosomes in response to TCR-, TNFR- and CD40 ligation led to the identification of an ER-residing protein, Metadherin (MTDH), which seems to globally integrate signaling before forwarding it to downstream pathway components able to activate IKK.

L’apoptose est un processus dont l’importance physiologique et pathophysiologique est de mieux en mieux appréciée. Si plusieurs mécanismes expliquant son initiation et son exécution ont été décrits, les détails de sa régulation fine restent à être précisés. Par ces travaux, nous démontrons une interaction directe entre la protéine pro-apoptotique Siva1 et la queue C-terminale de plusieurs récepteurs couplés aux protéines G, incluant TP, IP, PAF, AT?R et CHRM3. Pour TP, nous prouvons que la stimulation du récepteur par le U46619 entraîne une translocation et une accumulation cytoplasmique de Sival, ainsi qu’une modulation de ses interactions avec Mdm2, XIAP et TRAF2, résultant en une induction de l’apoptose. Nous rapportons également que l’expression de Siva1 potentialise l’ubiquitinylation de TP en réponse à une stimulation et que cette ubiquitinylation n’affecte ni la dégradation, ni l’internalisation du récepteur. Nous démontrons par ailleurs que la stimulation de TP diminue l’expression totale d’i?B?, l’inhibiteur principal de la voie NF?B et que cet effet corrèle avec le niveau d’expression de Siva1. En démontrant l’existence d’un complexe entre TP et TRAF2 suite à une stimulation réceptorielle, nous proposons que la modulation NF?B par TP pourrait résulter d’une signalisation dépendant de l’ubiquitine et analogue à celle des TNFR. D’autre part, nous présentons une interaction entre Siva1 et l’arrestine et apportons des données suggérant que l’expression de Siva1 pourrait moduler l’activation des MAPK. Nous proposons finalement un modèle réconciliant les fonctions anti- et pro-apoptotiques de TP et dans lequel le phénotype final d’une stimulation dépendrait de l’expression relative de Siva1. Les corolaires de ce modèle pourraient possiblement bonifier la prise en charge d’incidents ischémiques comme l’infarctus du myocarde ou l’accident vasculaire cérébral, et améliorer le traitement du cancer par une diminution de la toxicité d’agents chimiothérapeutiques et l’amélioration de la sensibilité tumorale.[symboles non conformes]

La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis) est la maladie génétique la plus fréquente dans les populations d’origine caucasienne. Les malades présentent une symptomatologie variée, dominée par une bronchopneumopathie chronique obstructive due à des sécrétions de mucus abondantes et anormalement épaisses et une réponse inflammatoire chronique excessive. La mucoviscidose résulte de mutations dans le gène codant la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), dont la plus fréquente est la délétion d’une phénylalanine en position 508 (F508del) qui est à l’origine d’un adressage défectueux et d’une fonction altérée de la protéine. Afin d’identifier différents partenaires moléculaires de CFTR qui participent à son processus de maturation, à son trafic à la membrane plasmique ou à sa fonction, un criblage double hybride de levure a été effectué en utilisant la troisième boucle intra-cytoplasmique de CFTR (ICL3) comme appât. A l’issue de ce criblage, 14 clones indépendants ont pu être identifiés dont la protéine COMMD1 qui a initialement été décrite comme un régulateur de l’homéostasie du cuivre, de l’absorption sodique et de la voie de signalisation NF-?B. L’objectif principal de ce travail a été de déterminer quel pouvait être l’impact de la protéine COMMD1 sur la maturation et le trafic intracellulaire de CFTR afin de déterminer le rôle de cette protéine dans la physiopathologie de la mucoviscidose. Nous avons montré que la protéine COMMD1 est un nouveau partenaire cytoplasmique du canal CFTR, qui régule le trafic intracellulaire de ce canal par inhibition de l’ubiquitinylation probablement au niveau des endosomes d’endocytose et de recyclage. Notre étude permet de proposer une nouvelle voie de trafic de CFTR via un modèle d’ubiquitinylation régulé par COMMD1. Au cours de cette étude, nous avons également identifié le récepteur 1 de la transferrine (TFR1) comme un nouveau partenaire de COMMD1 dont le mécanisme de régulation semble similaire à celui proposé pour CFTR. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux propriétés inhibitrices de COMMD1 dans la réaction inflammatoire. COMMD1 a été décrit comme le prototype d’une nouvelle famille de protéines jouant un rôle dans l’inhibition de la voie de signalisation NF-kB. Nous avons observé que la distribution subcellulaire de COMMD1 est différente dans les cellules CF et non-CF. Nous avons mis en évidence que la surexpression de COMMD1 dans les cellules épithéliales bronchiques CF, qui présentent une inflammation excessive, pouvait restaurer un niveau d’inflammation comparable aux cellules non-CF. COMMD1 est impliquée dans plusieurs processus cellulaires altérés dans la physiopathologie de la mucoviscidose, affectant le trafic du canal CFTR, l’absorption de sodium et la réponse inflammatoire. Comprendre comment moduler d’une part le processus d’absorption/sécrétion des ions par le trafic de canaux ioniques et d’autre part, l’inflammation des cellules CF par rapport aux non-CF, devrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Ces traitements permettraient à la fois de réduire la réaction inflammatoire exacerbée, sans nuire à l’activité essentielle de défense contre les pathogènes, et d’améliorer la sécrétion de fluide chez les patients atteints de mucoviscidose / Cystic fibrosis is mainly caused by mutations interfering with the biosynthetic folding of the CFTR protein. The aim of this study was to find proteins able to interact with CFTR and modify its processing. We have identified COMMD1 as a new CFTR partner. COMMD1 is a regulator of copper homeostasis and sodium uptake through interaction with ENaC, as well as the prototype of a new protein family that plays a role in inhibiting NF-?B signalling Co-immunoprecipitation experiments showed that COMMD1 associates with endogenous CFTR in HT29 cells and with F508del-CFTR in heterologously expressing epithelial cells. COMMD1 sub-cellular distribution is both nuclear and cytoplasmic, and more precisely in vesicular cytoplasmic compartments, as assessed by immunocytochemical microscopy. Further studies showed COMMD1 partial codistribution with an early endosomal compartments (TfR). COMMD1 is not involved in CFTR processing (C band) but wt-CFTR cell surface expression was halfreduced when COMMD1 expression was silenced. Unlike F508del-CFTR in temperature rescue, COMMD1 over-expression increased 15% wt-CFTR cell surface expression. Assessment of CFTR ubiquitination showed that COMMD1 over-expression strongly decreased CFTR ubiquitination therefore increasing CFTR cell surface expression. Finally, these data indicate that COMMD1 vesicular compartment is involved in CFTR trafficking through inhibition of CFTR ubiquitination. Understanding how COMMD1 modulation modifies transepithelial transport and inflammation in CF versus non CF cells should give new therapeutic clues to reduce exacerbated inflammation and improve fluid secretion in CF patients

Le facteur de transcription NF-KB joue un rôle essentiel dans le développement, l’homéostasie, la survie du système immunitaire, mais également dans la propagation de certains lymphomes. L’activation optimale de NF-ΚB en réponse à l’engagement de nombreux immunorécepteurs repose sur la mise en place de larges signalosomes dans lesquels des adaptateurs spécifiques sont recrutés et poly-Ubiquitinylés de façon non-Dégradative. En réponse à des cytokines pro-Inflammatoires ou à l’activation des récepteurs antigéniques, ces adaptateurs ubiquitinylés s’accumulent sur la face cytoplasmique du réticulum endoplasmique (RE) via la protéine du RE metadherine (MTDH) qui assure la propagation du signal NF-KB. Toutefois, la nature des E3 ligases en charge de relayer NF-KB au niveau des organites intracellulaires reste méconnue. C’est pourquoi j’ai réalisé le crible par bioluminescence d’une librairie de siRNA dirigée contre les 46 E3 ubiquitine ligases humaines pourvues d’un domaine transmembranaire qui les ancrent au niveau de différents compartiments cellulaires afin d’étudier leur impact sur l’activation de NF-KB en réponse à une stimulation antigénique dans un modèle de lymphocytes T immortalisés Jurkat. Nous avons identifié la protéine du RE TRIM13 comme un régulateur positif de la signalisation NF-ΚB. Nos données suggèrent un modèle dans lequel TRIM13 régule l’activation de NF-KB en modulant indépendamment l’activation de deux membres clés de la famille NF-KB au cours de l’activation lymphocytaire, RelA (p65) et c-Rel.Lors de cette thèse, j’ai également participé au crible d’une librairie de siRNA ciblant les 96 déubiquitinases (DUBs) codées par le génome humain afin d’identifier celles en charge de ramener les cellules vers leur état basal. Ceci a permis la caractérisation de la protéase spécifique de l’ubiquitine USP34 (Ubiquitin specific protease 34). La réduction des niveaux endogènes de USP34 potentialise l’activation de NF-KB en réponse à l’engagement du récepteur antigénique T ou du récepteur au TNFa et la liaison de NF-KB à l’ADN est accrue. Collectivement, ces résultats suggèrent que USP34 est un nouvel acteur impliqué dans la régulation négative de NF-KB.Ces résultats illustrent l’importance des processus d’ubiquitination réversibles dans la régulation de la signalisation NF-ΚB et introduisent les cribles génétiques comme un outil efficace pour l’identification de régulateurs de processus biologiques divers. / The transcription factor NF-KappaB plays a critical role in the development, homeostasis, the survival of the immune system, but also in the propagation of certain lymphomas. The optimal activation of NF-KappaB in response to the engagement of many immunoreceptors rely on the implementation of large signalosomes where specific adaptors are recruited and poly-Ubiquitinylated in a non-Degradative manner. In response to proinflammatory cytokines or activation of antigen receptors, these Ubiquitinylated adaptors accumulate on the cytoplasmic leaflet of the endoplasmic reticulum (ER) via the ER protein metadherin (MTDH) providing NF-KappaB signal propagation . However, the nature of the E3 ligases responsible for relaying NF-KappaB in intracellular organelles remains unknown. This is why I made the screen ingby bioluminescence of a library of siRNAs targeting the 46 human ubiquitin E3 ligases provided with a transmembrane domain that anchor them at different cellular compartments to study their impact on the NF-KappaB activation in response to antigenic stimulation in immortalized T lymphocytes Jurkat. We identified the ER-Protein TRIM13 as a positive regulator of NF-KappaB signaling. Our data suggest a model in which TRIM13 regulates the activation of NF-KappaB activation by modulating independently two key members of the NF-KappaB family during lymphocyte activation, RelA (p65) and c-Rel. In this thesis, I also participated in the screening of a library of siRNAs targeting the 98 deubiquitinases (DUBs) encoded by the human genome to identify those in charge of the reset of the system to basal state. This screen allowed the characterization of the ubiquitin-Specific protease USP34 (ubiquitin specific protease 34). The reduction of endogenous levels of USP34 potentiates the activation of NF-KappaB in response to engagement of the antigen receptor or T receptor antagonists and enhances NF-KappaB DNA binding. Collectively, these results suggest that USP34 is a new player involved in the negative regulation of NF-KappaB. These results illustrate the importance of reversible ubiquitination process in the regulation of the NF-KappaB signaling and introduce genetic screens as an effective tool to identify regulators of diverse biological processes.

Parmi les récepteurs Frizzled, Frizzled 4 est le seul à avoir un phénotype vasculaire fort. Parcriblage, nous avons identifié l’ubiquitine ligase PDZRN3 en tant que nouveau partenaire de la protéineadaptatrice Dvl3 qui agit en aval de Fzd4. En utilisant des modèles murins inductibles, nous montronsque la délétion de PDZRN3 induit une létalité embryonnaire suite à des défauts de vascularisation dusac amniotique ; et que PDZRN3 est requis pour une vascularisation normale de la rétine. De par sonactivité d’ubiquitine ligase, PDZRN3 induit la prise en charge du complexe Fzd4/ Dvl3 par les vésiculesd’endocytose ce qui permet la transduction du signal après fixation du ligand Wnt5a sur le récepteurFzd4. PDZRN3 régule également le maintien des jonctions des cellules endothéliales et l’intégrité de labarrière hémato-encéphalique. La délétion de PDZRN3 stabilise les microvaisseaux après ischémiecérébrale. PDZRN3 induit la disruption des jonctions serrées et la rupture de la barrièrehématoencéphalique en ubiquitinant la protéine d’échafaudage MUPP1. / Fzd4 is the only Frizzled receptor that is essential for angiogenesis. By using a yeast twohybrid screening, we have identified the ubiquitin ligase PDZRN3 as a potential partner of the adaptorprotein Dvl3 that acts downstream of Fzd4. By using inducible mouse models, we have shown that lossof PDZRN3 leads to early embryo lethality due to vascular defects in the yolk sac when deleted inutero, and is then required during post natal retinal vascularization. PDZRN3 would target the Fzd4/Dvl3 complex to endosome, leading to signal transduction upon binding of Wnt5a to Fzd4. PDZRN3also regulates integrity of the blood brain barrier by acting on tight junctions stability. Loss of PDZRN3stabilizes microvessels after cerebral ischemia. PDZRN3 would induce tight junction disruption andblood brain barrier leakage by ubiquitinylating the scaffolding protein MUPP1.

Les mécanismes moléculaires contrôlant les rythmes circadiens sont conservés parmi les organismes des différents règnes (plantes, animaux et champignons). Ils se composent de boucles de rétroaction où un complexe d’activation transcriptionnelle, l’hétérodimère CLK/CYC chez la drosophile, entraîne l'expression des répresseurs de son activité, les gènes et protéines PER et TIM chez la mouche. De manière importante, la période de l'oscillateur dépend en grande partie par des mécanismes post-transcriptionnels qui régulent l’accumulation et l'activité des composantes positifs et négatifs de la boucle. Bien que de nombreux partenaires d'interaction modifiant les composants d'horloge de base ont déjà pu être isolés, le schéma reste encore incomplet. Dans le cadre de la recherche de nouveaux composants de cette horloge, nous avons réalisé un crible comportemental basé sur l'expression ciblée de transgènes ARNi dirigés contre la moitié du génome de Drosophila melanogaster. Cinquante-quatre nouveaux gènes putatifs ont pu être identifiés. Au cours de ce travail, j'ai étudié le rôle de deux d’entre eux, sélectionnés pour les forts défauts comportementaux de l'expression de leur transgène ARNi. Le gène CG12082 de la drosophile est l’orthologue de l’Ubiquitin-specific protéase 5 (USP5) chez l’homme. La dérégulation d’Usp5 retarde les oscillations de la protéine PER dans les neurones d'horloge et allonge la période d'activité locomotrice des mouches. Chez les mouches ARNi Usp5, des formes à haut poids moléculaire des protéines PER et TIM s'accumulent pendant le matin, alors qu’elles sont normalement dégradées chez les contrôles. On a pu montrer que Usp5 participe directement à la dégradation de la protéine PER, indépendamment de TIM. En accord avec le rôle décrit pour l’orthologue humaine, Usp5 serait susceptible de contrôler la dégradation des protéines par son activité de démontage des chaînes libres de polyubiquitine présents dans la cellule, qui peuvent entrer en compétition avec les protéines ubiquitinylées pour la reconnaissance au niveau du protéasome, bloquant leur dégradation. La majorité des travaux ont porté sur un gène isolé au cours de notre crible, Strip, dont les fonctions étaient encore inconnues. Strip interagit avec Cka, une nouvelle sous-unité régulatrice de l’enzyme phosphatase PP2A. La dérégulation à la fois de Strip et/ou de Cka amène à des phénotypes comportementaux de période longue. D’un point de vue moléculaire, des formes hyper-phosphorylées de la protéine CLK s’accumulent dans la matinée quand Cka et/ou Strip sont perturbées. La dérégulation des activités générales de PP2A produit également une hyper-phosphorylation de CLK le matin, indiquant que, grâce à Cka/Strip, les complexes PP2A contrôlent la déphosphorylation de CLK à la fin du cycle. Il est connu que les formes hyper-phosphorylés de CLK sont transcriptionnellement inactives. En effet, la transcription des gènes tim et vrille, cibles de CLK, est fortement réduite dans les mouches ARNi Cka. En plus de PP2A/Cka, des complexes PP2A contenant une autre sous-unité régulatrice, Wdb, ont été montré pour déstabiliser CLK en culture des cellules (Kim et Edery, 2006). Nous montrons que la dérégulation de Wdb affecte la stabilité du CLK également dans la mouche adulte, sans toutefois induire aucun effet apparent sur sa phosphorylation. En conclusion, deux complexes PP2A différents agissent sur la protéine CLK : le complexe PP2A/Cka/Strip contrôle la déphosphorylation de CLK et sa réactivation, tandis que PP2A/Wdb affecte la stabilité de CLK indépendamment ou après PP2A/Cka. Ces résultats enrichissent l’étude de la régulation post-traductionnelle de la protéine CLK, qui était largement mal connue.Pour conclure, cette étude a permis de décrire deux nouveaux composants de la boucle moléculaire qui contrôle les rythmes circadiens chez la mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster. / The molecular mechanism underlying circadian rhythms is conserved among organisms and consists of feedback loops where a transcriptional activating complex (the CLOCK (CLK)/CYCLE (CYC) heterodimer in Drosophila) drives the expression of the repressors of its activity (the period (per) and timeless (tim) genes and proteins in Drosophila). Importantly, the pace of the oscillator largely depends on post-transcriptional mechanisms that regulate the accumulation and activity of both the positive and negative components of the loop. A number of interacting partners that modify core clock components have already been isolated, but more are expected. Looking for new clock components, we set up a behavioral screen based on targeted expression of RNAi transgenes directed to half of the Drosophila genome. 54 putative new clock genes have been identified. Among them, some were independently reported to function within the fruit fly molecular clock, thus validating the screen. In this work, I investigated the circadian role of additional “positive” genes, selected for the strong behavioral defect induced by the expression of the corresponding RNAi. The CG12082 gene codes for the fruit fly ortholog of the human Ubiquitin-specific protease 5 (USP5). Downregulation of USP5 in clock cells lengthens the period of locomotor activity of flies as well as PER protein oscillations in clock neurons. High molecular weight forms of PER and TIM proteins accumulate during the morning after USP5 knockdown, while these forms are degraded in controls. In addition, TIM is not stabilized in the absence of PER, while PER still accumulate in the absence of TIM. Therefore, USP5 directly participates in the degradation of the PER protein and, later, of the TIM protein at the end of the cycle. Being a deubiquitinylase enzyme, USP5 may directly deubiquitinate PER. However, accordingly to the role described for the human ortholog, USP5 likely controls protein degradation through the disassembling of the unanchored polyubiquitin chains present in the cell that could compete with ubiquitinated-PER for proteasome recognition and subsequent breakdown.The majority of the work has focused on an unknown gene isolated in the screen, that, accordingly to the human homolog, we named STRIP. We show that STRIP interacts with Connector of Kinase to AP-1 (CKA), a novel regulatory subunit for the PP2A phosphatase holoenzyme, both in insect S2 cells and in fly head extracts. Downregulation of both STRIP and/or CKA causes long-period behavioral phenotypes and high molecular weight forms of the CLK protein to accumulate in the morning. Perturbation of general PP2A activities also produces hyper-phosphorylated CLK in the morning indicating that, through CKA/STRIP, PP2A complexes controls CLK dephosphorylation at the end of the cycle. Hyper-phosphorylated CLK forms are transcriptionally inactive. Accordingly, transcription of the tim and vrille (vri) CLK targets is strongly reduced in Cka-RNAi fly head extracts. PP2A complexes containing the Widerborst (WDB) regulatory subunits were already shown to affect CLK stability in insect S2 cells (Kim and Edery, 2006). We show that WDB downregulation also affects the stability of CLK in fly head extracts, but has no apparent effects on CLK phosphorylation. Therefore, we could describe two different PP2A complexes acting on the CLK protein: PP2A/CKA/STRIP complex controls CLK dephosphorylation and reactivation, while PP2A/WDB affects CLK stability independently or after PP2A/CKA functions. Moreover, STRIP, but not CKA, downregulation affects the stability of PER, indicating that STRIP possesses some functions unrelated to CKA. In conclusion, this work has allowed the isolation of new components of the Drosophila molecular clock. In particular, we give evidence for a double role for the PP2A phosphatase in modulating the activity and stability of the CLK protein, the regulation of which is not well understood yet.

Le virus T lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1, Human T-cell Leukemia Virus type 1) est le premier rétrovirus oncogène humain à avoir été découvert. Sa protéine régulatrice Tax est la principale responsable du processus d’immortalisation et de transformation des lymphocytes T, cibles préférentielles d’HTLV-1 in vivo, qui est associé au développement de leucémies à cellules T de l’adulte. Ce mécanisme oncogénique est dû à la capacité de Tax à interagir avec de nombreux acteurs cellulaires, détournant ainsi différentes voies qui contrôlent notamment la prolifération et la survie des cellules. L’un des événements majeurs de ce mécanisme est l’activation constitutive de la voie NF-κB induite par Tax. Notre laboratoire ainsi que d’autres équipes ont montré que l’ubiquitinylation de Tax, notamment avec des chaînes liées en K63, est nécessaire pour que Tax recrute et active le complexe IKK (IκB Kinase), en se liant à sa sous-unité régulatrice NEMO dans le cytoplasme. Par ailleurs, il a également été décrit que Tax est SUMOylée ce qui lui permet de recruter les dimères NF-κB dans des corps nucléaires pour activer la transcription de leurs gènes cibles. Toutefois, de nombreuses interrogations persistent autour de l’implication et du mode d’action de chacune de ces modifications post-traductionnelles de Tax dans l’activation de la voie NF-κB. L’importance de la SUMOylation de Tax a en effet été remise en cause par notre laboratoire, suscitant une controverse qui nous décida à réexaminer complètement son rôle dans l’activation de la voie NF-κB. Pour cela, nous avons élaboré une nouvelle stratégie basée sur l’inhibition de la machinerie de SUMOylation endogène, grâce au blocage de l’unique enzyme E2 identifiée dans ce processus, l’enzyme Ubc9. Nous avons prouvé qu’une protéine Tax non SUMOylée, mais toujours ubiquitinylée, active la transcription à partir de promoteurs dépendants de NF-κB, qu’ils soient transfectés, intégrés stablement dans la chromatine cellulaire ou endogènes, démontrant ainsi que la SUMOylation de Tax n’est pas nécessaire à l’activation de la voie NF-κB, contrairement à son ubiquitinylation. Un autre point de questionnement concerne l’association de Tax au complexe NEMO/IKKα/IKKβ, pour laquelle l’ubiquitinylation de Tax est essentielle. Nous avons étudié l’implication de l’enzyme TRAF5 dans ces mécanismes, qui semblait être une potentielle E3 ligase de Tax, celle-ci restant encore inconnue. Grâce au blocage de TRAF5, nous avons montré que cette protéine interagit avec Tax et qu’elle est nécessaire à son ubiquitinylation, notamment avec des chaînes K63, sans toutefois que son activité ligase n’entre en jeu, excluant donc son rôle en tant qu’E3 ligase de Tax. Nous avons également découvert que TRAF5 induit la formation du complexe Tax/IKKα/IKKβ, mais n’est pas impliquée dans l’association Tax/NEMO, dessinant alors un nouveau modèle pour le recrutement et l’activation du complexe IKK par Tax. Ce travail permet donc d’apporter un nouvel éclairage sur l’impact de la SUMOylation et de l’ubiquitinylation de Tax dans l’activation de la voie NF-κB et de décrypter les étapes de cet événement crucial dans le mécanisme oncogénique déclenché par la protéine Tax du virus HTLV-1. / The Human T-cell Leukemia Virus type I is the first human oncoretrovirus discovered. The regulatory Tax protein is the main responsible of the immortalization process of primary CD4+ T lymphocytes, the preferential target cells of HTLV-1 in vivo, which is associated with adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), a highly aggressive malignant proliferation of CD4+ T lymphocytes. The oncogenic property of Tax is mainly due to its capacity to interact with many different cellular proteins belong to several pathways which control cell proliferation and survival. Constitutive activation of the NF-κB pathway induced by Tax plays a crucial role in this oncogenic mechanism. Our laboratory, and others, demonstrated that Tax ubiquitination, notably with K63-linked ubiquitin (Ub) chains, is required for the activation of the cytoplasmic IκB kinase (IKK) complex by directly interacting with the regulatory subunit NEMO. Moreover, in previous studies, we and others describe that Tax is also conjugated to either SUMO-1 or SUMO-2/3 molecules which facilitates its interaction with the NF-κB dimers in particular structures named Tax nuclear bodies, inducing promoter activation of target genes in the nucleus. However, many questions remain concerning the exact role of each Tax post-translational modification in the NF-κB pathway activation process. In the laboratory, we recently reconsidered the importance of Tax SUMOylation, provoking a controversy in our field. So, we decided to reexamine the role of this modification on NF-κB activation. To do this, we designed a novel strategy based on the inhibition of the endogenous SUMOylation machinery by blocking or silencing Ubc9, the unique E2-conjugating enzyme involves in this process. We found that an ubiquitinated but not SUMOylated Tax protein is still able to activate a transfected, an integrated or an endogenous NF-κB promoters, demonstrating that Tax SUMOylation is not required for Tax induced NF-κB pathway activation contrary to its ubiquitination. Another interrogation concerning the formation of the Tax/NEMO/IKKα/IKKβ complex, in which Tax ubiquitination is critical. We studied the role of TRAF5 in these mechanisms because this enzyme could be a potential Ub E3-ligase of Tax, which remains unknown. Thanks to the blockage of TRAF5, we showed that this protein interacts with Tax and that TRAF5 is necessary for Tax ubiquitination, notably with K63-linked Ub chains. However, TRAF5 is not the direct E3-ligase of Tax since we demonstrated that its ligase activity is not involved in Tax conjugation to ubiquitin. We also discovered that TRAF5 induces the formation of the Tax/ IKKα/IKKβ complex but not the association between Tax and NEMO, showing a new model for the recruitment and the activation of the IKK complex by Tax. In conclusion, our results led us to propose a new light on the impact of Tax SUMOylation and ubiquitination in the NF-κB pathway activation and to figure out the different steps of this process, which is crucial for the oncogenic mechanism induced by the HTLV-1 Tax protein.

Le virus T lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1, Human T-cell Leukemia Virus type 1) est le premier rétrovirus oncogène humain à avoir été découvert. Sa protéine régulatrice Tax est la principale responsable du processus d’immortalisation et de transformation des lymphocytes T, cibles préférentielles d’HTLV-1 in vivo, qui est associé au développement de leucémies à cellules T de l’adulte. Ce mécanisme oncogénique est dû à la capacité de Tax à interagir avec de nombreux acteurs cellulaires, détournant ainsi différentes voies qui contrôlent notamment la prolifération et la survie des cellules. L’un des événements majeurs de ce mécanisme est l’activation constitutive de la voie NF-κB induite par Tax. Notre laboratoire ainsi que d’autres équipes ont montré que l’ubiquitinylation de Tax, notamment avec des chaînes liées en K63, est nécessaire pour que Tax recrute et active le complexe IKK (IκB Kinase), en se liant à sa sous-unité régulatrice NEMO dans le cytoplasme. Par ailleurs, il a également été décrit que Tax est SUMOylée ce qui lui permet de recruter les dimères NF-κB dans des corps nucléaires pour activer la transcription de leurs gènes cibles. Toutefois, de nombreuses interrogations persistent autour de l’implication et du mode d’action de chacune de ces modifications post-traductionnelles de Tax dans l’activation de la voie NF-κB. L’importance de la SUMOylation de Tax a en effet été remise en cause par notre laboratoire, suscitant une controverse qui nous décida à réexaminer complètement son rôle dans l’activation de la voie NF-κB. Pour cela, nous avons élaboré une nouvelle stratégie basée sur l’inhibition de la machinerie de SUMOylation endogène, grâce au blocage de l’unique enzyme E2 identifiée dans ce processus, l’enzyme Ubc9. Nous avons prouvé qu’une protéine Tax non SUMOylée, mais toujours ubiquitinylée, active la transcription à partir de promoteurs dépendants de NF-κB, qu’ils soient transfectés, intégrés stablement dans la chromatine cellulaire ou endogènes, démontrant ainsi que la SUMOylation de Tax n’est pas nécessaire à l’activation de la voie NF-κB, contrairement à son ubiquitinylation. Un autre point de questionnement concerne l’association de Tax au complexe NEMO/IKKα/IKKβ, pour laquelle l’ubiquitinylation de Tax est essentielle. Nous avons étudié l’implication de l’enzyme TRAF5 dans ces mécanismes, qui semblait être une potentielle E3 ligase de Tax, celle-ci restant encore inconnue. Grâce au blocage de TRAF5, nous avons montré que cette protéine interagit avec Tax et qu’elle est nécessaire à son ubiquitinylation, notamment avec des chaînes K63, sans toutefois que son activité ligase n’entre en jeu, excluant donc son rôle en tant qu’E3 ligase de Tax. Nous avons également découvert que TRAF5 induit la formation du complexe Tax/IKKα/IKKβ, mais n’est pas impliquée dans l’association Tax/NEMO, dessinant alors un nouveau modèle pour le recrutement et l’activation du complexe IKK par Tax. Ce travail permet donc d’apporter un nouvel éclairage sur l’impact de la SUMOylation et de l’ubiquitinylation de Tax dans l’activation de la voie NF-κB et de décrypter les étapes de cet événement crucial dans le mécanisme oncogénique déclenché par la protéine Tax du virus HTLV-1. / The Human T-cell Leukemia Virus type I is the first human oncoretrovirus discovered. The regulatory Tax protein is the main responsible of the immortalization process of primary CD4+ T lymphocytes, the preferential target cells of HTLV-1 in vivo, which is associated with adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), a highly aggressive malignant proliferation of CD4+ T lymphocytes. The oncogenic property of Tax is mainly due to its capacity to interact with many different cellular proteins belong to several pathways which control cell proliferation and survival. Constitutive activation of the NF-κB pathway induced by Tax plays a crucial role in this oncogenic mechanism. Our laboratory, and others, demonstrated that Tax ubiquitination, notably with K63-linked ubiquitin (Ub) chains, is required for the activation of the cytoplasmic IκB kinase (IKK) complex by directly interacting with the regulatory subunit NEMO. Moreover, in previous studies, we and others describe that Tax is also conjugated to either SUMO-1 or SUMO-2/3 molecules which facilitates its interaction with the NF-κB dimers in particular structures named Tax nuclear bodies, inducing promoter activation of target genes in the nucleus. However, many questions remain concerning the exact role of each Tax post-translational modification in the NF-κB pathway activation process. In the laboratory, we recently reconsidered the importance of Tax SUMOylation, provoking a controversy in our field. So, we decided to reexamine the role of this modification on NF-κB activation. To do this, we designed a novel strategy based on the inhibition of the endogenous SUMOylation machinery by blocking or silencing Ubc9, the unique E2-conjugating enzyme involves in this process. We found that an ubiquitinated but not SUMOylated Tax protein is still able to activate a transfected, an integrated or an endogenous NF-κB promoters, demonstrating that Tax SUMOylation is not required for Tax induced NF-κB pathway activation contrary to its ubiquitination. Another interrogation concerning the formation of the Tax/NEMO/IKKα/IKKβ complex, in which Tax ubiquitination is critical. We studied the role of TRAF5 in these mechanisms because this enzyme could be a potential Ub E3-ligase of Tax, which remains unknown. Thanks to the blockage of TRAF5, we showed that this protein interacts with Tax and that TRAF5 is necessary for Tax ubiquitination, notably with K63-linked Ub chains. However, TRAF5 is not the direct E3-ligase of Tax since we demonstrated that its ligase activity is not involved in Tax conjugation to ubiquitin. We also discovered that TRAF5 induces the formation of the Tax/ IKKα/IKKβ complex but not the association between Tax and NEMO, showing a new model for the recruitment and the activation of the IKK complex by Tax. In conclusion, our results led us to propose a new light on the impact of Tax SUMOylation and ubiquitination in the NF-κB pathway activation and to figure out the different steps of this process, which is crucial for the oncogenic mechanism induced by the HTLV-1 Tax protein.