Abstract The increase of cardiac hemodynamic load that requires increased mechanical performance drives adaptation of the heart to maintain cardiac function. Modification of protein synthesis in cardiomyocytes allows the cells to adapt to the increased load. Cardiomyocyte hypertrophy and activation of cardiac fibroblasts over the long term is maladaptive and leads to heart failure (HF). Members of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily contribute to the remodeling process. TGF-β1 acts as a paracrine messenger between cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Connective tissue growth factor (CTGF) modulates TGF-β signaling and plays a role in the development of fibrosis. In the current study, we aimed to investigate whether blocking the actions of CTGF could alleviate ischemic injury and reduce cardiac remodeling. We determined whether blocking the action of these ligands would modulate cardiac hypertrophy and fibrosis. In the first study, we found that antagonizing the function of CTGF protected from transverse aortic constriction (TAC) -induced left ventricular remodeling. In the second study in myocardial infarction (MI) model, blocking the function of CTGF resulted in improved post-MI survival and this prevented to the decrease in left ventricular contractile function as compared to the situation in control mice. Treatment with CTGF mAb attenuated the development of dilated cardiomyopathy and limited the increase in cardiomyocyte size and deposition of interstitial fibrosis in a remote area. In the third study, targeting the TGF-β superfamily members myostatin and activins, by administration of a soluble decoy receptor of activin receptor 2B (ACVR2B-Fc) did not affect the extent of MI injury or cardiac remodeling in MI -induced ischemic HF. Understanding the complex and converging pathways regulating cardiac remodeling is a major challenge, but it may allow for opportunities to develop new therapies, new medicines and provide new hope for people with these life-threatening diseases. / Tiivistelmä Sydämen lisääntynyt kuormitus vaatii lisääntynyttä supistusvoimaa, joka johtaa sydänlihaksen adaptaatioon pumppaustehon ylläpitämiseksi. Alkuvaiheessa sydämen liikakasvu on hyödyllistä, mutta pidempään jatkuessaan se johtaa lopulta pumppaustoiminnan heikkenemiseen ja sydämen vajaatoimintaan. Useiden signalointimekanismien on osoitettu säätelevän sydänlihaksen adaptoitumista patologisille tiloille. Transformoiva kasvutekijä –β (TGF-β) proteiiniperhe säätelee sydämen adaptoitumista sekä vasemman kammion seinämän myötäävyyttä venytykselle. TGF-β1 indusoi supistuskykyisten myofibroblastien muodostumista sekä kollageenin tuotantoa. Runsas kollageenin tuotanto vahvistaa sydämen seinämää ja on tarpeen sydäninfarktivaurion korjaamisessa, mutta pitkään jatkuessaan se heikentää sydämen toimintaa ja altistaa rytmihäiriöille, sydämen vajaatoiminnalle sekä sydänperäiselle äkkikuolemalle. Sidekudoskasvutekijä (CTGF) säätelee TGF-β1:n signalointia ja se osallistuu haavan paranemiseen sekä fibroosiin. Tutkimuksessa selvitettiin, voidaanko sidekudoskasvutekijän tai TGF-β -perheen proteiinien toimintaa estämällä lievittää sydämen vajaatoiminnan kehittymistä. Koetuloksemme osoittavat, että CTGF:n toiminnan estäminen vasta-aineen (mAb) avulla vähentää hemodynaamisen liikakuormituksen indusoimaa vasemman kammion toiminnan heikkenemistä, kammion laajenemista sekä fibroosia. CTGF mAb myös vähentää kuolleisuutta ja estää sydämen toiminnan heikkenemistä sydäninfarktin jälkeen sekä lievittää sydäninfarktin jälkeistä dilatoivan kardiomyopatian kehittymistä. Aktiviinien ja myostatiinin toiminnan esto liukoisen aktiviinireseptori 2B:n (ACVR2B-Fc) avulla sen sijaan ei vaikuta sydäninfarktivaurioon tai iskeemisen vajaatoiminnan kehittymiseen. ACVR2B-Fc kuitenkin lisää luurankolihaksen kasvua, estäen sydämen vajaatoimintaan liittyvää luurankolihaskatoa. Sydämen hypertrofian ja vajaatoiminnan syntymisen kannalta keskeisten signaalinvälitysreittien tunnistaminen ja niiden toiminnan ymmärtäminen auttaisi kehittämään tehokkaampia lääkehoitoja sydänsairauksiin.

Abstract Various bone proteins and growth factors are needed during the bone healing cascade. If the body cannot produce sufficient quantities of these factors, bone trauma healing can be improved with an implant that contains the required growth factors. However, an added bone protein extract needs a suitable delivery system to protect the proteins from degradation and to release them gradually, promoting new bone formation. This study focused on evaluating and optimization of the bone forming capacity of various scaffold systems of reindeer bone protein extract formulations using different experimental models. The tested carrier systems for various reindeer bone protein extract doses were collagen sponge and bioactive glass granules in critical-size defect model of rat femur. Calcium salt compositions (beta-tricalcium phosphate (β-TCP), hydroxyapatite or calcium sulphate) in disc and compressed pellet forms were tested in the thigh muscle pouch model of mouse. Various β-TCP granules combined with polyethylene/glycerol and stearic acid gel were tested in a hole defect model of sheep femur and humerus. Control groups involved carrier materials with no protein extract or untreated defects. In the sheep study, reference materials also included autograft and demineralized bone matrix (DBM). New bone formation, bone healing, and carrier resorption were evaluated based on radiographs, peripheral computerized tomography (pQCT), mechanical tests, histological examination, and micro-CT. New bone formation and bone union were markedly better in groups receiving higher doses of the extract and with follow-ups of six or more weeks, compared to empty defect or carrier without extract. Resorptions of carrier materials in active groups were faster and more active than in the control groups. The greatest bone formation occurred in the groups that had the bone protein extract readily available, which indicated that bone forming factors are required in sufficient concentrations at an early stage. The micro-CT analysis showed that bone formation in the groups with the extract was comparable to autograft, while the least bone formation was observed in the DBM and untreated groups. The present study indicated that the tested reindeer bone protein extract can be used to improve bone formation with various carriers. The study suggests that an inorganic carrier material together with stearic acid is the one of most suitable carrier alternatives for this extract. The developed medical device in paste form can be an alternative for autograft use. / Tiivistelmä Luun paraneminen vaatii erilaisia proteiineja ja kasvutekijöitä. Jos elimistö ei pysty tuottamaan riittävää määrää näitä tekijöitä, luumurtuma ei parane luonnollisesti vaan vaatii hoitoa, jossa murtuma alueelle viedään tarvittavia kasvutekijöitä. Kasvutekijät kiinnitetään tarkoituksenmukaiseen kantaja-aineeseen, jonka avulla kasvutekijöiden vapautumista ja toimintaa voidaan säädellä. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida ja optimoida erilaisissa eläinmalleissa porosta eristetyn luuproteiiniuutteen kantaja-ainesysteemien toimivuutta. Testatut kantaja-ainemateriaalit olivat kollageenihuopa ja bioaktiivinen lasirae. Näitä testattiin useilla luuproteiiniannoksilla, ja mallina oli rotan reisiluun kriittisen koon murtuma. Hiiren reisilihasmallilla testattiin kalsiumsuolayhdistelmiä (beta trikalsiumfosfaatti (β-TCP), hydroksiapatiitti ja kalsiumsulfaatti) tablettina ja pellettinä. Lampaan reisi- ja olkaluiden reikämurtumamallilla testattiin erilaisia β-TCP-rakeita yhdistettynä polyetyleenistä, glyserolista ja steariinihaposta valmistettuun geeliin. Kontrollisryhmistä toinen sisälsi kantaja-aineen ilman luuproteiiniuutetta, toisessa ryhmässä murtuma jätettiin kokonaan hoitamatta. Lammaskokeessa verrattiin lisäksi omaluusiirteen ja demineralisoidun luumateriaalin (DBM) toimivuutta verrattuna poron luuproteiiniuutteeseen. Uudisluun muodostuminen, murtuman paraneminen ja kantaja-aineen hajoaminen arvioitiin natiiviröntgenillä, perifeerisellä tietokonetomografialla (pQCT), mekaanisin testein, histologisesti ja mikro-CT:llä. Luuproteiiniuutetta sisältäneillä ryhmillä oli luun paraneminen ja kantaja-aineen hajoaminen merkittävästi parempaa kuin uutetta sisältämättömillä ryhmillä. Uudisluun muodostuminen oli suurempaa korkeammilla annoksilla ja pitemmillä seuranta-ajoilla. Suurin uudisluun muodostus mitattiin ryhmillä, joissa luuproteiiniuute oli heti käytettävissä implantoinnin jälkeen. Tämä osoittaa, että varsinkin murtuman paranemisen alkuvaiheissa tarvitaan luuta muodostavia kasvutekijöitä riittävinä pitoisuuksina. Mikro-CT-analyysit osoittivat, että luuproteiiniuuttetta sisältäneet ryhmät olivat verrannollisia omaluusiirrehoidolle. Vähiten uudisluuta havaittiin DBM ja tyhjäreikäryhmissä. Tutkimus osoittaa, että poron luuproteiiniuutetta erilaisten kantajamateriaalien kanssa voidaan käyttää parantamaan luun muodostumista. Erityisesti epäorgaaninen kantajamateriaali steariinihapon kanssa on yksi soveltuvimmista vaihtoehdoista luu-uutteelle. Kehitelty pastamutoinen lääkinnällinen laite, joka sisälsi poron luuproteiiniuutteen ja kalsiumsuolakantaja-aineen, osoittautui vaihtoehdoksi omaluusiirrehoidolle.

Abstract Cardiac hypertrophy is the primary adaptive mechanism of the heart to increased workload, though when advanced, it becomes a leading predictor for heart failure and sudden death. The growth stimulus elicited by a hemodynamic load is attributable to a combination of mechanical and neurohumoral factors, but the precise roles of individual growth promoting components are still unclear. This study utilized atrial natriuretic peptide (ANP) and B-type natriuretic peptide (BNP) as model genes with which to investigate the involvement and mechanisms of mechanical stress and peptide growth factors in hypertrophic response of cardiac myocytes. The direct effect of mechanical stretch was studied in two different in vitro models of cultured neonatal rat cardiomyocytes. In the first approach, hypo-osmotic swelling -induced stretch increased ANP mRNA levels in atrial cells. In the second model, cyclic mechanical stretch of ventricular cells grown on flexible membranes evoked ANP and BNP gene expression and secretion. The mechanisms of stretch-induced BNP gene expression were studied by measurement of the activities of transcription factors and by utilizing promoter analysis together with site specific mutations. Stretch activated the binding of the transcription factor GATA-4 similarly to pressure overload in vivo. Mutational studies revealed that specific GATA consensus sites on the BNP promoter, in combination with an Nkx-2.5 binding element, were critical for stretch-activated BNP transcription. Importantly, a reduction of GATA-4 protein levels inhibited the stretch-induced hypertrophic response. Both cyclic mechanical stretchin vitro and hemodynamic overload in vivo activated the expression of peptide growth factor bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). The effects of BMP-2 closely resembled those of mechanical stretch including the increase in the expressions of ANP and BNP. Furthermore, the BMP antagonist noggin inhibited the effect of stretch on ANP and BNP. Fibroblast growth factor 1 stimulated ANP synthesis and secretion in a protein kinase C dependent manner. In conclusion, this work demonstrates that mechanical stretch per se is sufficient to activate the hypertrophic gene program in cardiac myocytes. This effect seems to be at least partially mediated by the growth factor BMP-2 acting in a paracrine manner. The activation of the GATA-4 transcription factor, in cooperation with a factor binding to the Nkx-2.5 binding element, is essential for mechanical stretch-induced cardiomyocyte hypertrophy. / Tiivistelmä Sydämen tärkein mukautumiskeino kohonneeseen työmäärään on sydänlihaksen kasvu. Sydänlihaksen liikakasvu on kuitenkin tärkein sydämen vajaatoiminnan ja äkkikuoleman ennustetekijä. Hemodynaamisen ylikuormituksen kasvua edistävä vaikutus on lukuisten mekaanisten ja neurohumoraalisten tekijöiden summa, jossa kunkin yksittäisen tekijän osuus on vielä epäselvä. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin mekaanisen venytyksen ja peptidikasvutekijöiden osuutta ja vaikutusmekanismeja sydämen liikakasvun synnyssä käyttämällä malligeeneinä sydämen eteispeptidiä (ANP) ja B-tyypin natriureettista peptidiä (BNP). Mekaanisen venytyksen välitöntä vaikutusta tutkittiin vastasyntyneen rotan sydänsoluviljelymalleissa. Osmolaliteetin muutoksella aiheutettu venytys lisäsi ANP:n lähetti-RNA-tasoja eteissoluissa. Venyväpohjaisilla kalvoilla kasvatettujen kammiosolujen syklinen venytys stimuloi ANP:n ja BNP:n geeniekspressiota ja eritystä. BNP:n geenisäätelymekanismeja tutkittiin mittaamalla transkriptiotekijöiden aktiivisuutta sekä geeninsiirtokokeilla hyödyntäen muunneltuja BNP:n geenisäätelyalueita. Venytys lisäsi transkriptiotekijä GATA-4:n sitoutumisaktiivisuutta samaan tapaan kuin painekuormitus koe-eläimillä. Tietyt BNP:n säätelyalueen GATA-sitoutumispaikat yhdessä Nkx-2.5:ttä sitovan elementin kanssa osoittautuivat tärkeiksi venytysvasteen kannalta. GATA-4 -proteiinitasojen vähentäminen esti venytyksen aiheuttamaa kasvuvastetta. Sekä syklinen mekaaninen venytys soluviljelykokeissa että hemodynaaminen ylikuormitus koe-eläimillä lisäsivät peptidikasvutekijä bone morphogenetic protein-2:n (BMP-2) geeniekspressiota. BMP-2:n suorat vaikutukset puolestaan muistuttivat läheisesti mekaanisen venytyksen vaikutusta, ANP:n ja BNP:n lisääntynyt geeniekspressio mukaan lukien. BMP-antagonisti noggin esti lisäksi venytyksen vaikutusta ANP:iin ja BNP:iin. Työssä osoitettiin myös, että fibroblastikasvutekijä 1 stimuloi ANP:n synteesiä ja eritystä proteiinikinaasi C:n välityksellä. Yhteenvetona tulokset osoittavat, että mekaaninen venytys itsessään riittää aktivoimaan sydänlihaksen kasvuun liittyvää geeniohjelmaa. Vasteen välittäjänä näyttää kuitenkin ainakin osittain toimivan paikallisesti tuotettu BMP-2. Edelleen, transkriptiotekijä GATA-4 yhdessä Nkx-2.5 -elementtiin sitoutuvan tekijän kanssa osoittautui välttämättömäksi mekaanisen venytyksen aiheuttamalle kasvuvasteelle.