Abstract Cardiac hypertrophy is the primary adaptive mechanism of the heart to increased workload, though when advanced, it becomes a leading predictor for heart failure and sudden death. The growth stimulus elicited by a hemodynamic load is attributable to a combination of mechanical and neurohumoral factors, but the precise roles of individual growth promoting components are still unclear. This study utilized atrial natriuretic peptide (ANP) and B-type natriuretic peptide (BNP) as model genes with which to investigate the involvement and mechanisms of mechanical stress and peptide growth factors in hypertrophic response of cardiac myocytes. The direct effect of mechanical stretch was studied in two different in vitro models of cultured neonatal rat cardiomyocytes. In the first approach, hypo-osmotic swelling -induced stretch increased ANP mRNA levels in atrial cells. In the second model, cyclic mechanical stretch of ventricular cells grown on flexible membranes evoked ANP and BNP gene expression and secretion. The mechanisms of stretch-induced BNP gene expression were studied by measurement of the activities of transcription factors and by utilizing promoter analysis together with site specific mutations. Stretch activated the binding of the transcription factor GATA-4 similarly to pressure overload in vivo. Mutational studies revealed that specific GATA consensus sites on the BNP promoter, in combination with an Nkx-2.5 binding element, were critical for stretch-activated BNP transcription. Importantly, a reduction of GATA-4 protein levels inhibited the stretch-induced hypertrophic response. Both cyclic mechanical stretchin vitro and hemodynamic overload in vivo activated the expression of peptide growth factor bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). The effects of BMP-2 closely resembled those of mechanical stretch including the increase in the expressions of ANP and BNP. Furthermore, the BMP antagonist noggin inhibited the effect of stretch on ANP and BNP. Fibroblast growth factor 1 stimulated ANP synthesis and secretion in a protein kinase C dependent manner. In conclusion, this work demonstrates that mechanical stretch per se is sufficient to activate the hypertrophic gene program in cardiac myocytes. This effect seems to be at least partially mediated by the growth factor BMP-2 acting in a paracrine manner. The activation of the GATA-4 transcription factor, in cooperation with a factor binding to the Nkx-2.5 binding element, is essential for mechanical stretch-induced cardiomyocyte hypertrophy. / Tiivistelmä Sydämen tärkein mukautumiskeino kohonneeseen työmäärään on sydänlihaksen kasvu. Sydänlihaksen liikakasvu on kuitenkin tärkein sydämen vajaatoiminnan ja äkkikuoleman ennustetekijä. Hemodynaamisen ylikuormituksen kasvua edistävä vaikutus on lukuisten mekaanisten ja neurohumoraalisten tekijöiden summa, jossa kunkin yksittäisen tekijän osuus on vielä epäselvä. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin mekaanisen venytyksen ja peptidikasvutekijöiden osuutta ja vaikutusmekanismeja sydämen liikakasvun synnyssä käyttämällä malligeeneinä sydämen eteispeptidiä (ANP) ja B-tyypin natriureettista peptidiä (BNP). Mekaanisen venytyksen välitöntä vaikutusta tutkittiin vastasyntyneen rotan sydänsoluviljelymalleissa. Osmolaliteetin muutoksella aiheutettu venytys lisäsi ANP:n lähetti-RNA-tasoja eteissoluissa. Venyväpohjaisilla kalvoilla kasvatettujen kammiosolujen syklinen venytys stimuloi ANP:n ja BNP:n geeniekspressiota ja eritystä. BNP:n geenisäätelymekanismeja tutkittiin mittaamalla transkriptiotekijöiden aktiivisuutta sekä geeninsiirtokokeilla hyödyntäen muunneltuja BNP:n geenisäätelyalueita. Venytys lisäsi transkriptiotekijä GATA-4:n sitoutumisaktiivisuutta samaan tapaan kuin painekuormitus koe-eläimillä. Tietyt BNP:n säätelyalueen GATA-sitoutumispaikat yhdessä Nkx-2.5:ttä sitovan elementin kanssa osoittautuivat tärkeiksi venytysvasteen kannalta. GATA-4 -proteiinitasojen vähentäminen esti venytyksen aiheuttamaa kasvuvastetta. Sekä syklinen mekaaninen venytys soluviljelykokeissa että hemodynaaminen ylikuormitus koe-eläimillä lisäsivät peptidikasvutekijä bone morphogenetic protein-2:n (BMP-2) geeniekspressiota. BMP-2:n suorat vaikutukset puolestaan muistuttivat läheisesti mekaanisen venytyksen vaikutusta, ANP:n ja BNP:n lisääntynyt geeniekspressio mukaan lukien. BMP-antagonisti noggin esti lisäksi venytyksen vaikutusta ANP:iin ja BNP:iin. Työssä osoitettiin myös, että fibroblastikasvutekijä 1 stimuloi ANP:n synteesiä ja eritystä proteiinikinaasi C:n välityksellä. Yhteenvetona tulokset osoittavat, että mekaaninen venytys itsessään riittää aktivoimaan sydänlihaksen kasvuun liittyvää geeniohjelmaa. Vasteen välittäjänä näyttää kuitenkin ainakin osittain toimivan paikallisesti tuotettu BMP-2. Edelleen, transkriptiotekijä GATA-4 yhdessä Nkx-2.5 -elementtiin sitoutuvan tekijän kanssa osoittautui välttämättömäksi mekaanisen venytyksen aiheuttamalle kasvuvasteelle.

Abstract Intracoronary administration of autologous bone marrow derived stem cells (BMC) has been postulated to repair the myocardial damage in patients who have suffered acute ST-elevation myocardial infarction (STEMI). The aim of this study was to find determinants for the left ventricular functional recovery after BMC treatment of STEMI and to study the effect of BMC treatment on different biochemical and clinical parameters associated with the outcome of STEMI patients. In this study, STEMI patients treated with thrombolysis were randomly assigned to receive either intracoronary BMC (n=39) or placebo (n=39) into the infarct related artery at the time of percutaneous coronary intervention. The efficacy of the BMC treatment was assessed by measurement of the change of left ventricular ejection fraction (LVEF) from baseline to six months after STEMI. Two-dimensional echocardiography was used to assess PA pressure, LV systolic and diastolic function. Blood samples were drawn for biochemical determinations at several time points and BMCs were cultured in the laboratory for in vitro analyses. In the BMC group, the most powerful determinant of the change of LVEF was the baseline LVEF. Patients with baseline LVEF at or below the median (≤62.5%) experienced a more marked improvement of LVEF than those above the median. Elevated levels of N-terminal probrain natriuretic peptide (NT-proBNP) and N-terminal proatrial natriuretic peptide (NT-proANP) were also associated with an improvement of LVEF in the BMC group. However, no difference was observed between the BMC group and the placebo group in the changes of the levels of NT-proANP, NT-proBNP or any of the inflammatory markers measured. The BMC group showed a trend toward a reduction of peak PA pressure, while the placebo group had a significant increase of peak PA pressure at 6 months. In addition, there was a greater improvement in the LV diastolic function, assessed in quartiles, in the BMC group. The in vitro studies of BMCs revealed that exposure to tumor necrosis factor alpha (TNF-α) significantly enhanced the proliferation of BMCs and resulted in activation of immunosuppression by altering the expression of several immunosuppressive proteins. In conclusion, low baseline LVEF as well as high levels of natriuretic peptides NT-proANP and NT-proBNP, which reflect the severity of the hemodynamic and neurohumoral reactions evoked by the myocardial damage, have a considerable association to a better response to stem cell therapy after an acute STEMI. BMC therapy also prevents the increase of PA pressure and improves the cardiac diastolic function. Based on in vitro studies, the inflammatory cytokine TNF-α seems to evoke an enhanced proliferation of the bone marrow-derived mesenchymal stem cells and activation of several immunosuppressive defence mechanisms. / Tiivistelmä Sydäninfarktipotilaiden sepelvaltimoon pallolaajennuksen yhteydessä injektoitujen kantasolujen tiedetään parantavan hieman sydämen pumppauskykyä, mutta taustalla olevaa mekanismia ei tunneta. Kantasoluhoidon onnistumiseen vaikuttavia tekijöitä on tutkittu vasta vähän, eikä myöskään sitä tiedetä, miksi kaikki potilaat eivät hyödy kantasoluhoidosta. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää infarktialueelle annetun kantasoluhoidon vaikutuksia äkillisen ST-nousuinfarktin (STEMI) sairastaneissa potilaissa, ja etsiä hoidon onnistumiseen vaikuttavia tekijöitä. Tutkimuksessa käytettiin potilasaineistoa, johon otettiin 78 äkilliseen sydäninfarktiin sairastunutta potilasta, jotka hoidettiin liuotushoidolla ja sen jälkeen pallolaajennuksella. Puolet potilaista satunnaistettiin saamaan lumeliuosta ja puolet omaa luuydinsolukkoaan (BMC), joka ruiskutettiin pallolaajennuksen yhteydessä sepelvaltimon kautta infarktialueelle. Hoidon vaikusta tutkittiin mittaamalla angiografian avulla vasemman kammion ejektiofraktion (LVEF) muutosta lähtötilanteen ja kuuden kuukauden seurannan välillä. Lisäksi sydämen ultraäänitutkimuksella määritettiin keuhkovaltimopainetta ja vasemman kammion systolista ja diastolista toimintaa. Potilaista otettiin lisäksi verinäytteitä, joista määritettiin erilaisia tulehdusmerkkiaineita ja natriureettisia peptidejä. Lisäksi potilaista kerättyjä luuydinkantasoluja viljeltiin laboratoriossa in vitro-analyyseja varten. Tutkimuksessa todettiin, että LVEF ennen kantasoluhoitoa oli voimakkain ennustetekijä suotuisalle LVEF:n muutokselle kantasoluhoidon jälkeen. Potilaat, joilla LVEF oli ennen kantasoluhoitoa alle mediaaniarvon (≤62.5%), hyötyivät kantasoluhoidosta enemmän kuin potilaat, joilla LVEF oli yli mediaanin. Myös natriureettisten peptidien NT-proBNP:n ja NT-proANP:n korkea taso infarktin jälkeen oli yhteydessä suurempaan LVEF:n paranemiseen BMC-potilailla. Natriureettisten peptidien ja tulehdusmerkkiaineiden pitoisuuksien muutoksissa kantasoluhoidon jälkeen ei kuitenkaan todettu eroa BMC- ja kontrolliryhmän välillä. Sydämen diastolisen toiminnan havaittiin paranevan enemmän BMC-ryhmässä kuin kontrolliryhmässä. Lisäksi BMC-ryhmässä havaittiin lievää laskua keuhkovaltimopaineessa, kun taas kontrolliryhmässä se nousi merkittävästi. In vitro-tutkimukset luuytimestä erilaistetuilla mesenkymaalisilla kantasoluilla puolestaan osoittivat, että tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α)-altistus lisäsi solujakautumista ja monien immunosupressiivisten proteiinien tuottoa soluissa. Matala LVEF sekä natriureettisten peptidien NT-proBNP:n ja NT-proANP:n korkea taso sydäninfarktin jälkeen kuvaavat infarktivaurion aiheuttamien hemodynaamisten ja neurohumoraalisten reaktioiden vakavuutta, ja tässä tutkimuksessa niiden osoitettiin olevan vahvasti yhteydessä äkillisen ST-nousuinfarktin jälkeen annetun kantasoluhoidon hyötyyn. Kantasoluhoito saattaa myös suojata infarktipotilaita haitalliselta keuhkovaltimopaineen nousulta ja parantaa sydämen diastolista toimintaa. Tulehdusvälittäjäaine TNF-α näytti in vitro-kokeiden perusteella lisäävän luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen jakautumista ja aktivoivan niissä monia immunosuppressiivisia puolustusmekanismeja tulehdusta vastaan.

Abstract Intracellular signalling cascades regulate cardiomyocyte hypertrophic response. Initially hypertrophy of individual myocytes occurs as an adaptive response to increased demands for cardiac work, e.g. during hypertension or after myocardial infarction, but a prolonged hypertrophic response, accompanied by accelerated fibrosis and apoptosis, predisposes the heart to impaired performance and the syndrome of heart failure. The goal of this work was to elucidate some of the main signalling pathways in experimental models of the cardiac hypertrophic response. Mechanical stretching of cultured neonatal rat cardiomyocytes in vitro activates the B-type natriuretic peptide (BNP) gene, a well-established marker of the hypertrophic response, through intracellular signalling cascades mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and protein kinase A (PKA) -pathway. Further, transcription factors transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) and activating transcription factor 3 (ATF3) were induced during stretch, and TEF-1 activation was shown to be regulated by extracellular signal-regulated kinase (ERK), while ATF3 activation was modulated by PKA. The BNP gene was also activated by the adenoviral overexpression of the p38 MAPK isoforms p38α and p38β in vitro. Importantly, p38α–induced activation was mediated through activator protein-1 (AP-1) while p38β mediated BNP transcription through GATA-4, which suggests distinct physiological roles for different p38 isoforms. This was further confirmed by quantitative PCR, which demonstrated pro-fibrotic role for the p38α isoform and a pro-hypertrophic role for the p38β isoform. Finally, adenoviral overexpression of ATF3 in vitro and in vivo resulted in activation of cardiac survival factors nuclear factor-κВ and Nkx-2.5, and attenuation of central pro-inflammatory and pro-fibrotic mediators. Together these data suggest a protective role for ATF3 in the heart. Overall this study provides new insights into the role of several signalling molecules involved in cardiac hypertrophic process and suggests potential therapeutic strategies for the diagnosis and treatment of heart failure. / Tiivistelmä Sydämen kammioiden seinämät paksuuntuvat kuormituksen lisääntyessä mm. verenpainetaudissa tai sydäninfarktin jälkeen. Lisääntynyt kuormitus aiheuttaa sydänlihassolujen koon kasvun (hypertrofioitumisen) ohella sidekudoksen kertymistä (fibroosia) ja solukuolemaa. Nämä solutason muutokset lopulta vioittavat sydämen rakennetta niin, että sen toiminta pettää, ja sydän ajautuu vajaatoimintaan. Tätä taudin etenemistä säätelevät molekyylitasolla lukuisat solunsisäiset signaalinvälitysjärjestelmät, joita tässä väitöskirjatyössä tutkittiin eri koemalleissa. Sydämen täyttöpaineen nousun aiheuttama sydänlihassolujen mekaaninen venytys aktivoi natriureettisten peptidien (eteispeptidi, ANP ja B-tyypin natriureettinen peptidi, BNP) synteesiä ja vapautumista verenkiertoon. BNP geenin säätelyä mekaanisen venytyksen aikana tutkittiin rotan sydänlihassoluviljelmissä. Mitogeeni-aktivoituvat proteiinikinaasit (MAPK) sekä proteiinikinaasi A (PKA) säätelivät mekaanisen ärsykkeen aiheuttamaa BNP geenin ekspressiota. Venytys aktivoi myös transkriptiotekijöitä TEF-1 (transcriptional enhancer factor-1) ja ATF3 (activating transcription factor 3). TEF-1 sääteli venytyksen aiheuttamaa BNP:n aktivaatiota ERK:n (extracellular signal-regulated kinase) välityksellä BNP geenin säätelyalueella olevan sitoutumispaikkansa (M-CAT elementti) kautta. ATF3:n säätelyssä PKA:lla oli keskeinen merkitys. Tutkimus osoitti myös, että p38 MAPK:n alatyypeistä p38α lisäsi fibroosiin liittyvien geenien aktiivisuutta, kun taas p38β aiheutti solujen hypertrofioitumista lisäävien geenien ekspressiota. Molemmat alatyypit aktivoivat BNP geenin ekspressiota, mutta aktivaatio tapahtui eri transkriptiotekijöiden kautta. Tutkimuksessa havaittiin myös, että ATF3:n yliekspressio adenovirusvälitteisellä geeninsiirrolla lisäsi kahden sydäntä suojaavan transkriptiotekijän (nuclear factor-κВ ja Nkx-2.5) aktiivisuutta, sekä vähensi sydämen tulehdusvastetta ja fibroosia lisäävien tekijöiden (interleukiini-6 ja plasminogeeniaktivaattorin inhibiittori-1) ekspressiota. Väitöskirjatutkimus antaa uutta tietoa solunsisäisistä signaalinvälitys-järjestelmistä, jotka säätelevät sydänlihaksen kuormitusvastetta sydän- ja verenkiertoelimistön sairauksissa. Näiden solutason mekanismien tunteminen osaltaan edesauttaa jatkossa uusien menetelmien kehittämistä sydämen vajaatoiminnan ehkäisyyn ja hoitoon.