Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das mechanistische Funktionsprinzip des Rat Organic Cation Transporter 1, stellvertretend für die Gruppe der organischen Kationentransporter, im Hinblick auf die Beteiligung einzelner Aminosäuren der mutmaßlichen Bindungstasche am Transportprozess (Tyr222, Asp475) untersucht. Hierbei stand insbesondere die Frage nach einer gleichzeitigen oder sequentiellen Interaktion der o. g. Aminosäuren mit dem jeweils gewählten Transportliganden im Vordergrund. Bei Mutation der untersuchten Interaktionsstellen (Einzelmutanten Y222F, D475E, Doppelmutante Y222F/D475E) konnten Km-Änderungen für die zelluläre Aufnahme von MPP und TEA sowie IC50-Änderungen für die Hemmung des MPP-Transportes durch TEA bzw. TBuA im Xenopus-laevis-Oozytenmodell mittels radioaktiver Aufnahmemessungen erzielt werden. Trotz eines signifikant additiven Effektes der Doppelmutation auf die TEA-Affinität des Transporters im Vergleich zu den Einzelmutanten erschien ein sequentieller Transportmechanismus aufgrund der nicht additiven IC50(TEA)-Verminderung für den MPP-Transport und der Sicherung der Lokalisation von Tyr222 und Asp475 auf unterschiedlichen Seiten der Plasmamembran durch TBuA-Inhibitionsversuche der MPP-Aufnahme wahrscheinlich. Gestützt wurden diese Ergebnisse durch die analoge Modellierung dreidimensionaler Darstellungen des doppelmutierten rOCT1(Y222F/D475E) anhand bereits kristallographisch vermessener Prokaryotentransporter. Diese Modelle bestätigten eine interaktionsrelevante räumliche Position der modifizierten Aminosäurereste innerhalb der Bindungstasche, welche eine metachrone Substrat- bzw. Inhibitorbindung nahelegte. Demnach interagiert in Kongruenz beider Untersuchungsansätze zunächst Tyr222 auf extrazellulärer Seite mit dem Liganden, während der intramembranären Konformationsänderung des Transporters erfolgt dann eine Transposition des Substrates respektive Inhibitors auf Asp475 auf der Zytosolseite. / The involvement of two amino acids (Y222, D475) of the innermost cavity of rat organic cation transporter 1 (rOCT1) in the transport process was investigated. The study aimed at characterizing the interaction between substrates and the amino acid residues as a synchronous or sequential process. Mutations of the above mentioned amino acids (Y222F, D475E, Y222F/D475E) showed a significantly additive effect on TEA affinity in contrast to MPP for the double mutant on one hand. On the other hand there was no additive decrease in IC50(TEA) values for MPP transport. Additionally, the accessibility of Y222 and D475 on different sides of the plasma membrane during transport was verified by TBuA inhibition of MPP translocation. Taken together these findings strongly suggest a sequential transport mechanism. This interpretation of the experimental data was also supported by computer based three dimensional modelling of the Y222F/D475E double mutant with substrates/inhibitors bound to the innermost cavitiy, which showed the positions of the two amino acids within the tertiary structure of rOCT1 to be suitable for metachronous substrate interactions.

Die organischen Kationentransporter der SLC22-Familie spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung vieler kationischer Medikamente und endogener Substanzen. Der erste klonierte organische Kationentransporter rOCT1 (OCT1 aus der Ratte) wurde bisher eingehend funktionell charakterisiert. rOCT1 ist elektrogen, transportiert organische Kationen unterschiedlicher Struktur wie z.B. Cholin, Tetraethylammonium (TEA) oder das Neurotoxin 1 Methyl-4-Phenylpyridinium (MPP) und wird durch verschiedene Substanzen wie beispielsweise Tetrabutylammonium (TBuA) inhibiert. Für die Entwicklung und Optimierung von Medikamenten ist ein besseres Verständnis der strukturellen Grundlage der polyspezifischen Substraterkennung und des Transportprozesses von entscheidender Bedeutung. Durch modellgestützte Mutagenese konnte für rOCT1 ein großer Spalt identifiziert werden, der von acht Transmembranhelices (TMHs) geformt wird und die putative Substratbindungstasche mit überlappenden Bindungsdomänen beinhaltet. Mittels der „Voltage-Clamp-Fluorometrie“ können Konformationsänderungen von rOCT1 während des Transportzyklus sichtbar gemacht werden. Unter Verwendung dieser Methode wurden spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen in den Positionen 260, 380 und 483 der TMHs 5, 8 und 11 nachgewiesen. Interaktionen mit den Substraten Cholin und MPP sowie dem nicht transportierten Inhibitor TBuA von außen wirkten sich unterschiedlich auf die Bewegungen in den drei Positionen aus. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass rOCT1 spannungsabhängige Konformationen einnimmt, bei deren Änderungen sich mindestens drei Transmembrandomänen (TMH 5, TMH 8 und TMH 11) bewegen und dass in Gegenwart von organischen Kationen die Spannungsabhängigkeit der Transporterkonformation beeinflusst wird. Des Weiteren wurde eine kritische Position innerhalb oder nahe der Substratbindungstasche von rOCT1 identifiziert, mit deren Hilfe der Transportweg irreversibel blockiert werden kann. In Position 478 wurde das Glycin durch ein Cystein ersetzt, das mittels des SH Gruppenreagenzes [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonat Bromid (MTSET) kovalent modifiziert werden konnte. Diese Modifikation bewirkte eine starke Hemmung des Transports verschiedener Substrate wie z.B. Cholin, TEA oder MPP. Anhand von Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass die Bindung von MPP durch die MTSET Modifizierung in der nach außen gerichteten Konformation verhindert wurde. Die Einführung des Cysteins in Position 478 erhöhte die Affinität von TBuA und beeinflusste außerdem die substrat- und spannungsabhängigen Konformationsänderungen. Hierbei zeigte sich, dass in zwei der drei Positionen (260 und 483) die Fluoreszenzantwort des leeren Transporters verändert wurde. Neben den Fluoreszenzen im Gleichgewichtszustand wurden auch die Zeitkonstanten der Fluoreszenzantworten durch die Position 478 beeinflusst. Durch die Einführung eines Serins oder Threonins in diese Position konnten die Effekte des Cysteins 478 in Position 483 nachgeahmt werden. Die Blockierung des Transportwegs durch MTSET veränderte die Bewegungen des leeren Transporters in Position 260 und 483 kaum, während in Position 380 eine deutliche Reduktion der Fluoreszenzantwort gemessen wurde. Auch die substratabhängigen Fluoreszenzänderungen wurden in der Position 483 deutlich reduziert. Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass rOCT1 Konformationsänderungen durchläuft, die spannungs- und substratabhängig sind und durch die Position 478 beeinflusst werden. / Organic cation transporters of the SLC22-family play a pivotal role in the absorption, elimination and distribution of many cationic drugs and endogenous compounds. The first cloned organic cation transporter rOCT1 (rat OCT1) was extensively characterized. rOCT1 is electrogenic and transports a variety of organic cations with very different structures e.g. choline, tetraethylammonium (TEA) and the neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP). In addition rOCT1 is inhibited by various compounds such as tetrabutylammonium (TBuA). For the development and optimization of drugs it is fundamental to understand the structural basics of polyspecific substrate binding and of the transport process. By using model-based mutagenesis, a large cleft of rOCT1 was identified, which is formed by eight transmembrane helices (TMH) and contains the putative substrate binding pocket with overlapping binding domains. Conformational changes of rOCT1 during the transport cycle can be identified by using the “voltage-clamp-fluorometry” technique. Employing this method, potential-dependent fluorescence changes were identified in the positions 260, 380 and 483 in the TMHs 5, 8 and 11. Interactions of the substrates choline and MPP as well as the non-transported inhibitor TBuA acting from the outside, had an individual influence on the movements at these three positions. The results demonstrate that rOCT1 adopts different potential-dependent conformations and that at least three different transmembrane domains (TMH 5, TMH 8 and TMH 11) move during the conformational changes. Additionally, the results suggest that the potential-dependence of the transporter’s conformations is influenced by the presence of organic cations. Furthermore, a critical position was identified within or close to the substrate binding pocket of rOCT1. By modification of this position the transport pathway could be blocked. The replacement of glycine 478 with cysteine allows a covalent modification of this cysteine with an SH-group reagent [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate bromide (MTSET). This modification inhibited the transport of several substrates such as choline, TEA or MPP. With the help of binding studies, we could show that the binding of MPP in the outward facing conformation was prevented by the modification with MTSET. The introduction of cysteine in position 478 increased the affinity of TBuA and also influenced the substrate- and potential-dependent conformational changes. Specifically, it was found that the fluorescence response of the empty transporter changed in two of three positions (260 and 483). Apart from the fluorescence in the state of equilibrium, the time constants of the fluorescence responses were also influenced by the position 478. The effects of cysteine 478 could be mimicked in position 483 by the introduction of a serine or threonine in position 478. The blockage of the transport pathway by MTSET hardly changed the movement of the empty transporter in positions 260 and 483, whereas a clear reduction of the fluorescence response was measured in position 380. Additionally, the substrate-dependent fluorescence changes were reduced clearly in position 483. In conclusion, the data indicate that rOCT1 undergoes conformational changes, which are substrate- and potential-dependent and are influenced by the position 478.

Universiẗat, Diss., 2006--Giessen.

Universiẗat, Diss., 2006--Giessen.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2006

Zur SLC22-Genfamilie von Karnitin- und organischen Ionentransportern gehören u. a. auch die organischen Kationentransporter der Ratte rOCT1 und rOCT2 sowie deren humane Analoga. Diese funtionell bereits gut charakterisierten Proteine werden in verschiedenen Geweben exprimiert und transportieren endogene und pharmakologisch relevante Substanzen. Die Aufklärung des Transportmechanismus und der Regulation sind Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen. In dieser Arbeit wurde durch elekrophysiologische Methoden, die modifiziert auch zur Messung von Membrankapazitäten und des Strom-Teilchen-Aufnahmeverhältnisses (CFR) eingesetzt wurden, der Effekt des ungeladenen, membranpermeablen SH-Gruppenregenz MMTS auf den in Xenopus laevis-Oozyten exprimierten rOCT1 untersucht. Durch MMTS kam es zu einer Aktivierung von substratinduzierten Strömen und Kapazitätsänderungen, einer unterschiedlichen Veränderung von Substrat- und Inhibitoraffinitäten sowie einer Zunahme der absoluten Oozytenmembrankapazität. Die CFR und die Spannungsabhängigkeit änderten sich nicht. An rOCT2 konnten teils gleich-, teils gegensinnige Veränderungen nach MMTS-Exposition gezeigt werden. Diese Phänomene können am ehesten durch eine Konformationsänderung der polyvalenten Substratbindungsregion, einen verstärken Membraneinbau der Transportermoleküle und eine gesteigerte Transportrate des Einzeltransporters erklärt werden. Durch die Untersuchung von Mutanten konnten die Cysteine 322 und 451 als essentiell für den MMTS-Effekt identifiziert werden. Die Daten deuten darauf hin, dass die Modifikation dieser Cysteine für die Effekte zwingend erforderlich ist. Möglicherweise ist aber ein Xenopus-eigenes Regulatorprotein an der Entstehung der Effekte beteiligt, welches in die entsprechenden Proteinregionen des rOCT1 eingreift. Mit der Identifikation von Cystein 451 konnte ein weiterer Beweis für die wichtige Bedeutung der 10. Transmembrandomäne erbracht werden. Mit dem Cystein 322 wurde eine weitere wichtige Aminosäure für die Funktion und möglicherweise auch die Regulation von rOCT1 identifiziert. / rOCT1 and rOCT2 are functionally well characterised members of the SLC22-transporter family. It includes carnitine and organic cation and anion transporters. OCTs are expressed in a variety of tissues and transport a number of drugs and endogenous substrates. Their transport mechanism and regulation are currently intensively being investigated. MMTS is an uncharged and membrane-permeable SH-reactive substance. Using electrophysiological methods the effect of MMTS on rOCT1 expressed in X. laevis-oocytes was investigated. These methods were modified to measure membrane capacitance and current-flux-ratios. MMTS-exposure induced an activation of substrate-induced currents and capacitance changes, a differing alteration of substrate and inhibitor affinities and an increase in the absolute oocyte membrane capacitance. The transport stoechiometry and voltage dependence were not influenced by MMTS exposure. Properties of rOCT2 were partially altered in the same and partially in the opposite way. The effects can most likely be explained by a conformational change of the polyvalent substrate binding region, an increased membrane insertion of OCT molecules and an increased substrate turnover number of the single transporter. Investigating mutants the cysteines 322 and 451 could be identified to be essential for the MMTS-effect. The data suggest that the modification of both cysteines is absolutely necessary to create the seen effects. However the participation of a Xenopus regulatory protein for the induction of the MMTS-effect interfering with the mentioned OCT regions must be taken into account. The identification of cysteine 451 proves once more the importance of the 10th TMD within the OCT family. Cyteins 322 might be another important amino acid for functional properties and the regulation of organic cation transporters.

Polyspezifische organische Kationentransporter (OCTs) der SLC22 Familie transportieren organische Kationen entlang eines elektrochemischen Gradienten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Ausscheidung und Gewebeverteilung von endogenen organischen Kationen und bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung von kationischen Medikamenten und Toxinen. Zu den endogenen transportierten Substanzen gehört auch der Neurotransmitter Acetylcholin (ACh), der unter anderem in der menschlichen Haut eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung und –proliferation spielt. Die dermatologischen Antiinfektiva Gentianaviolett (GV) und Brillantgrün (BG) aus der Gruppe der Triphenylmethanfarbstoffe werden in der Behandlung lokaler Wundinfektionen verwendet und zeigen im klinischen Gebrauch Nebenwirkungen wie Wundheilungsstörungen. Es konnte gezeigt werden, dass die Farbstoffe die OCTs konzentrationsabhängig hemmen und es wurden die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration ermittelt. Dabei zeigte sich, dass GV und BG zu den Hemmstoffen mit der höchsten Affinität zu den OCTs gehören. Ein Transport der Farbstoffe durch die OCTs konnte nicht nachgewiesen werden, die toxische Wirkung auf Keratinozyten in in-vitro Versuchen mit menschlichen Zellreihen wurde bestätigt. Ein Zusammenhang zwischen den beobachteten Wundheilungsstörungen unter der Therapie mit Triphenylmethanfarbstoffen und der Hemmung des ACh-Transportes durch die OCTs konnte nicht bestätigt werden. / Polyspecific organic cation transporters (OCTs) of the SLC22 family mediate downhill transport of organic cations and play an essential role in excretion and distribution of endogenous organic cations and for the uptake, elimination and distribution of cationic drugs and toxins. One of these endogenous transported substances is the neurotransmitter Acetylcholin (ACh), which plays an important role in the differentiation and proliferation of human skin cells. The triphenylmethane dyes gentian violet (GV) and brilliant green (BG), that are used in dermatology for the local treatment of infected wounds show side effects such as disruption of the healing of wounds. It could be shown, that the dyes inhibit the OCTs in a concentration-dependent manner and the IC50-values could be determined. The transport of the dyes through the OCTs could not be shown however the toxicity on human keratinocytes could be confirmed in in-vitro essays with human cell lines. A connection between the disruption of wound-healing under therapy with triphenylmethane dyes and the inhibition of the ACh-transport mediated by the OCTs could not be confirmed.

Polyspecific organic cation transporters (OCTs) of the SLC22 family mediate downhill transport of organic cations and play an essential role in excretion and distribution of endogenous organic cations and for the uptake, elimination and distribution of cationic drugs and toxins. Although physiological and pharmacological significance of OCTs is widely accepted, many questions concerning structure and transport mechanism still remain open. To investigate conformational changes of the rat OCT1 during transport cycle, voltage-clamp fluorometry was performed with a cysteine-deprived mutant in which phenylalanine 483 in transmembrane helix (TMH) 11 close to the extracellular surface was replaced by cysteine and covalently labeled with tetramethylrhodamine-6-maleimide. Potential-dependent fluorescence changes were observed that were sensitive to the presence of substrates choline, tetraethylammonium (TEA), 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP), and of the contransported inhibitor tetrabutylammonium (TBuA). The data suggest that the transporter undergoes conformational changes in voltage- and substrate-dependent manner which are compatible with alternating access mechanism. Using potential-dependent fluorescence changes as readout, one high-affinity binding site per substrate and two highaffinity binding sites for TBuA were identified in addition to the previously described single interaction sites. Coexisting high-affinity cation binding sites in organic cation transporters may collect xenobiotics and drugs; however, translocation of organic cations across the membrane may only be induced when a low-affinity cation binding site is loaded. Whereas high-affinity binding of TBuA has no effect on cation uptake by wildtype rat OCT1, replacement by cysteine or serine of amino acids W147, F483, and F486 located in a modeled contact region between TMH2 and TMH11 outside the binding pocket leads to inhibition of MPP or TEA uptake. Thus, mutations of amino acids in transport relevant key positions, which can be distinct from the cation binding region, may transform noninhibitory highaffinity binding sites of high-affinity inhibition sites and thereby cause adverse drug reactions in patients. / Polyspezifische Transporter für organische Kationen (OCTs) der SLC22 Familie transportieren organische Kationen entlang des elektrochemischen Gradienten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Ausscheidung und Gewebeverteilung von endogenen organischen Kationen und bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung von kationischen Medikamenten und Toxinen. Obwohl die physiologische und pharmakologische Bedeutung von Transportern für organische Kationen allgemein anerkannt ist, bleiben viele Fragen bezüglich der Struktur und des Transportmechanismus dieser Transporter noch offen. Um Konformationsänderungen von rOCT1 während des Transportzyklus zu untersuchen, wurde die „Voltage-clamp-Fluorometrie“ angewandt, bei der in einer cysteinarmen rOCT1 Mutante Phenylalanin 483 in der Transmembranhelix (TMH) 11 nahe an der extrazellulären Seite der Membran durch Cystein ersetzt und mit Tetramethylrhodamin-6-maleimid kovalent markiert wurde. Dabei wurden Spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen beobachtet, die durch die Anwesenheit der Substrate - Cholin, Tetraethylammonium (TEA), 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP) - und des nichttransportierten Hemmstoffes Tetrabutylammonium (TBuA) moduliert wurden. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass der Transporter Konformationsänderungen durchläuft, die spannungs- und substratabhängig sind, was mit dem „alternating access“ Mechanismus vereinbar ist. Die Analyse der spannungsabhängigen Fluoreszenzänderungen zeigte die Existenz je einer hochaffinen Bindungsstelle für Substrate und zweier hochaffinen Bindungsstellen für TBuA zusätzlich zu den früher identifizierten Bindungsstellen. Multiple hochaffine Kationenbindungsstellen in OCTs können Xenobiotika und Arzneimittel anreichern, aber die Translokation von organischen Kationen über die Membran kann erst dann erfolgen, wenn die niederaffine Bindungsstelle besetzt ist. Während die hochaffine Bindung von TBuA an den Wildtyp rOCT1 keine Wirkung auf die Aufnahme von Kationen hat, führt der Austausch der Aminosäuren W147, F483 und F486, die anhangs des Modells in der Kontaktregion zwischen TMH 2 und TMH 11 außerhalb der Bindungstasche lokalisiert sind, durch Cystein oder Serin zur Hemmung der MPP- und TEA-Aufnahme. Die Mutation der Aminosäuren in den für den Transport entscheidenden Positionen, die sich nicht unbedingt in der Kationenbindungstasche befinden, kann also eine nichtinhibitorische hochaffine Bindungsstelle in eine inhibitorische hochaffine Bindungsstelle umwandeln und dadurch unerwartete Effekte bei der Therapie mit verschiedenen Arzneimitteln hervorrufen.

Arzneistofftransporter ermöglichen endogenen und exogenen Molekülen die Überwindung von Zellmembranen und tragen dadurch zur Aufnahme, Verteilung und Elimination von Arzneistoffen bei. Inhalativ applizierte Wirkstoffe, wie Vertreter aus der Gruppe der Beta-2-Sympathomimetika oder Anticholinergika, zählen zu den Substraten wichtiger, pulmonal exprimierter Arzneistofftransporter. Trotz intensivierter Forschung auf dem Gebiet der Transporter-Expression ist diese im humanen Lungengewebe bisher wenig untersucht und deren pharmakokinetische Auswirkungen auf pulmonal verabreichte Arzneistoffe sind kaum bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe untersucht und Erkenntnisse über deren Expressions-Profil im humanen Lungengewebe gewonnen werden. Pharmakokinetische Parameter des inhalativen Anticholinergikums Ipratropiumbromid wurden an einem ex vivo Modell der humanen Lunge untersucht. Nach vorheriger Applikation des kompetitiven OCTN1/2-Inhibitors L-Carnitin wurde keine signifikante Reduktion der absorbierten Wirkstoffmenge detektiert. Damit zeigten sich die beiden organischen Kationen/Carnitin-Transporter OCTN1 und OCTN2, anders als bisher vermutet, nicht als primär an der Absorption von Ipratropiumbromid beteiligte Transporter. Infolgedessen wurde die Beteiligung weiterer Transporter hypothetisiert. Erstmals wurden die am humanen Lungen-Perfusions-Modell gewonnenen pharmakokinetischen Daten zur pulmonalen Absorption in direkter Beziehung zur mRNA- und Protein-Expression von Arzneistofftransportern in den jeweiligen individuellen Gewebeproben betrachtet. Die pulmonale Genexpression des Multidrug Resistance-Related Protein MRP5 wies eine signifikante negative Korrelation mit der Area under the curve (AUC0 – 60 min) von Ipratropiumbromid auf (r = -0,699; p < 0,05), was die Beteiligung von MRP5 an den Umverteilungsprozessen von Ipratropiumbromid in der humanen Lunge nahelegte. Auf Protein-Ebene wurde eine positive Korrelation zwischen der Expression des organischen Kationentransporters OCT3 und der AUC0 – 60 min von Ipratropiumbromid ermittelt (r = 0,7499,p < 0,05), woraus sich eine potentielle Beteiligung von OCT3 an der Aufnahme von Ipratropiumbromid aus dem luminalen Lungenbereich ableiten ließ. Zur Untermauerung dieser Hypothese wurden Untersuchungen mit stabil transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt. Sowohl der organische Kationentransporter OCT1 als auch OCT3 trugen dabei signifikant zu einer erhöhten zellulären Aufnahme der beiden Tritium-markierten Bronchodilatatoren Ipratropiumbromid und Salbutamol bei. Damit wurde für OCT3 zum ersten Mal eine Beteiligung an der zellulären Aufnahme dieser beiden Arzneistoffe nachgewiesen. Im Kontext der Gendermedizin sind geschlechtsspezifische Unterschiede in der Transporter-Expression von großem Interesse. Inwiefern die drei Sexualsteroidhormone Estradiol, Progesteron und Testosteron einen regulatorischen Effekt auf die mRNA-Expression von Membrantransportern haben, wurde erstmals durch in vitro Inkubationsversuche in physiologischen Hormonkonzentrationen mit der humanen Bronchialepithelzelllinie Calu-3 geprüft. Mittels intensiv optimierter und sorgfältig validierter RT-qPCR-Analytik konnten vor allem nach Inkubation mit weiblichen Sexualhormonen verglichen zu keiner Hormon-Zugabe statistisch signifikante Expressions-Unterschiede detektiert werden: Nach Behandlung mit Estradiol zeigten der Oligopeptid-Transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) und OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) eine geringere Genexpression, das Multidrug Resistance-Related Protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) sowie OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) waren nach Zugabe von Estradiol kombiniert mit Progesteron höher exprimiert als ohne Hormon-Zusatz. Da Estradiol überdies als Inhibitor des OCT1- und OCT3-vermittelten Transports gilt, wurde die Auswirkung des Hormons, unter anderem in physiologischer Konzentration, auf die Aufnahme von Tritium-markierten Ipratropiumbromid in stabil transfizierte HEK293-Zellen untersucht, wobei tatsächlich eine reduzierte zelluläre Ipratropiumbromid-Aufnahme beobachtet wurde. Somit könnte auch in vivo eine geschlechtsspezifische Inhibition der beiden Transporter stattfinden, wodurch deren Substrate einer geschlechtsspezifisch variierenden Pharmakokinetik unterliegen könnten. Darüber hinaus wurde in rund 80 humanen Lungengewebsproben die Genexpression von Arzneistofftransportern hinsichtlich geschlechts- und altersspezifischer Unterschiede überprüft. In unter 50-jährigen Männern war das Multidrug-Resistance Protein MDR1 signifikant höher exprimiert verglichen zu Männern von 50 - 60 Jahren. OCT1 war in Patienten von 50 - 60 Jahren signifikant geringer exprimiert als in über 60-Jährigen. Daneben lieferte die Analyse aller Gewebeproben das Genexpressions-Profil von Arzneistofftransportern im humanen Lungengewebe, wobei OCT3 das höchste und OCT2 das geringste mRNA-Expressions-Niveau unter den untersuchten Transportern aufwies. Eine wesentliche Beteiligung von OCT3 an Transportvorgängen im humanen Lungengewebe erschien damit wahrscheinlich. Resümierend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Einflusses von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalativ verabreichter Arzneistoffe geleistet werden. Dabei konnte OCT3 erstmals als maßgeblich an der zellulären Aufnahme von Ipratropiumbromid beteiligter Transporter in der humanen Lunge identifiziert werden, womit einerseits die Beteiligung von Arzneistofftransportern an pharmakokinetischen Prozessen in vivo und andererseits die Bedeutung von Arzneistofftransportern für die inhalative Arzneimitteltherapie deutlich wurde. / Drug transporters facilitate the transport of endogenous and exogenous compounds across cell membranes. Therefore they contribute to the absorption, distribution and elimination of drugs. Pulmonary administered drugs, such as members of the drug class of betamimetics or anticholinergics, are known substrates of relevant pulmonary expressed drug transporters. Despite intensified research in the field of transporter expression few data are available about their expression in the human lung and the pharmacokinetic implications on pulmonary administered drugs. The aim of this thesis was to investigate the impact of drug transporters on the absorption of inhaled drugs and to gain insights into their expression profiles in human lung tissue. Pharmacokinetic properties of the inhaled anticholinergic ipratropium bromide were explored using an ex vivo model of the human lung. After preceding application of the competitive OCTN1/2-inhibitor L-carnitine no significant decrease of the amount of absorbed active ingredient was detected. This contradicted previous assumptions regarding the contribution of the organic cation/carnitine transporters OCTN1 and OCTN2 to the absorption of ipratropium bromide. Consequently the involvement of additional transporters was hypothesized. For the first time pharmacokinetic data of the pulmonary absorption obtained by employing the human lung perfusion model were correlated with the mRNA and protein expression of drug transporters in respective individual tissue samples. The pulmonary gene expression of the multidrug resistance–related protein MRP5 showed a significant negative correlation with the area under the curve (AUC0 – 60 min) of ipratropium bromide (r = -0,699; p < 0,05). This might indicate that MRP5 contributes to the redistribution processes of ipratropium bromide in the human lung. A positive correlation between the protein expression of the organic cation transporter OCT3 and the AUC0 – 60 min of ipratropium bromide was detected (r = 0,7499, p < 0,05) suggesting a potential involvement of OCT3 in the absorption of ipratropium bromide in the luminal lung area. Uptake assays using stably transfected HEK293 cells were performed to substantiate this hypothesis. Both organic cation transporters, OCT1 and OCT3, contributed significantly to an increased cellular uptake of the tritium labeled bronchodilators ipratropium bromide and salbutamol. Thus, the contribution of OCT3 to the cellular uptake of both pharmaceutical substances was demonstrated for the first time. Gender-specific differences of drug transporter expression are of major interest in the context of gender medicine. In vitro incubation studies with the human bronchial epithelial cell line Calu-3 for the first time elucidated whether physiological concentrations of the three sex steroid hormones estradiol, progesterone and testosterone exert a regulatory effect upon the mRNA expression of membrane transporters. By thoroughly optimized and carefully validated RT-qPCR analytics statistically significant differences in gene expression were detected primarily after incubation with female sex hormones compared to no hormone exposure: After incubation with estradiol the peptide transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) and OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) showed decreased expression whereas the multidrug resistance–related protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) as well as OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) were upregulated after addition of both estradiol and progesterone compared to no treatment. Since estradiol is also a known inhibitor of the transport mediated by OCT1 and OCT3 its impact on the uptake of tritium labeled ipratropium bromide was investigated in stably transfected HEK293 cells. Indeed, a reduced cellular uptake of ipratropium bromide was observed after incubation with estradiol, also at physiological concentrations. Therefore, a gender-specific inhibition of both transporters in vivo is conceivable and could result in gender-specific pharmacokinetic characteristics for substrates of these transporters. Moreover, the gene expression of drug transporters in approximate 80 lung tissue samples was examined regarding gender and age related differences. The multidrug resistance protein MDR1 was significantly higher expressed in men younger than 50 years compared to 50 - 60 year old men. OCT1 was significantly less expressed in 50 - 60 years old patients compared to patients older than 60 years. Furthermore, the gene expression profile of drug transporters in the human lung was analyzed. In all tissue samples OCT3 showed the highest mRNA expression level whereas OCT2 was least expressed amongst the investigated transporters. This suggested a substantial involvement of OCT3 in transport processes in human lung tissue. In conclusion, the present research contributed to the elucidation of the role of drug transporters in the pulmonary absorption of inhaled drugs. For the first time OCT3 was identified to be substantially involved in the cellular absorption of ipratropium bromide in human lungs. Hence, the data supported the involvement of drug transporters in pharmacokinetic processes in vivo and emphasized the importance of drug transporters for inhaled pharmacotherapy.

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