H αλόγιστη απόρριψη των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων στο περιβάλλον προκαλεί σοβαρά προβλήματα παγκοσμίως. Πολλά από αυτά όπως π.χ. τυρόγαλα περιέχουν θρεπτικά συστατικά τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν από μικροοργανισμούς προς παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ο ζυμομύκητας Kluyveromyces marxianus για την ζύμωση συνθετικού μέσου με λακτόζη συγκέντρωσης ανάλογης με εκείνη του τυρογάλακτος (~5% w/v) προς παραγωγή αιθανόλης. Προσδιορίσθηκαν οι βέλτιστες φυσικοχημικές συνθήκες και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε pH 7 και 30οC επιτυγχάνεται μέγιστη ταχύτητα ζύμωσης και συγκέντρωση αιθανόλης. Στις ίδιες συνθήκες, μέτρηση του ρυθμού πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14C από τον μικροοργανισμό έδειξε ότι αυτός σχετίζεται άμεσα με την κινητική της ζύμωσης. / Τhe indiscriminate disposal of agro waste in the environment causes serious problems worldwide. However, many of them for example whey, contain nutrients which can be used by microorganisms in order to produce products with high value. In this study is being used the yeast Kluyveromyces Marxianus for the fermentation of synthetic substrate of lactose with lactose concentration similar to that of the whey (~5% w/v) for ethanol production. Having determined the optimal physicochemical conditions and the results showed that at pH 7 and 30οC achieved a maximum speed of fermentation and ethanol concentration. Under the same conditions, measuring the rate of uptake of 14C-labeled lactose by the microorganism showed that this is directly related to the kinetics of fermentation

L'objectif de ce travail était d'étudier une bactérie d'affinage de cet écosystème, Brevibacterium aurantiacum (BA). La mise en place d'outils moléculaires pour l'étude de la biodiversité du genre Brevibacterium. L'approche par MLST avec 9 gènes de ménage est un nouvel outil prometteur pour l'identification des Brevibacteriaceae, nous avons identifié une nouvelle espèce appartenant aux souches d'intérêt technologique, B. antiquum. L'approche par puce ADN a permis d'étudier la biodiversité au sein de l'espèce de BA, les résultats montrent que 13% et 15% du génome de la souche séquencée sont absents et/ou divergents dans les souches BL2 et ATCC 9175. Nous avons ensuite réalisé une reconstruction du métabolisme du soufre chez BA ATCC 9175 et étudié sa régulation en fonction de différentes sources de soufre en utilisant des approches omics. Les résultats montrent une répression des voies d'assimilation du sulfate et de la biosynthèse de la cystéine en présence de cystine et une répression des voies de biosynthèse de la méthionine via l'homocystéine et la voie de transulfuration par la méthionine. Enfin, lors d'un ajout de méthionine dans le milieu, nous observons une induction coordonnée des gènes codant pour la méthionine gamma-lyase et un transporteur de la méthionine suggérant la présence d'un régulateur spécifique pour cette voie. Enfin, nous avons étudié le comportement de BA en présence ou en absence d'une levure d'affinage de fromage Kluyveromyces lactis (KL) par des approches biochimiques et transcriptomiques. Chez BA, on observe une modification du métabolisme carboné et de l'azote, de la voie de biosynthèse des pigments.

Le métabolisme du soufre, qui occupe une place centrale au sein de la cellule, est aussi important lors de la fabrication des fromages à pâte molle à croûte lavée. L'écosystème fromager assimile les acides aminés soufrés et peut ainsi produire des composés soufrés volatils (CSVs) indispensables à la flaveur de ces produits. Nous avons étudié le métabolisme du soufre chez deux micro-organismes d'affinage, les levures hémiascomycètes Kluyveromyces lactis et Yarrowia lipolytica. L'analyse in silico du phylum des hémiascomycètes nous a donné pour la première fois une vision évolutive de ce métabolisme. Nous avons relevé des différences fondamentales au niveau de la synthèse de la cystéine mais aussi au niveau des enzymes impliquées dans la production de CSVs. Cette analyse constitue une base solide pour l'étude du métabolisme du soufre. Nous avons combiné plusieurs approches exploratoires (transcriptome, métabolome, dosage des CSVs) afin d'avoir une vision globale de ce métabolisme chez K. lactis et Y.lipolytica. Les différences observées se situent notamment au niveau des voies de synthèse de la cystéine et de la taurine. La production de CSVs semble liée à la surexpression de transaminases spécifiques à chaque espèce combinée à l'accumulation de méthionine intracellulaire. L'affinage du fromage dépendant de tout un écosystème, nous avons également étudié l'interaction entre deux micro-organismes d'affinage, K. lactis et Brevibacterium aurantiacum via une approche transcriptomique, en comparant l'expression d'une co-culture à celle des cultures pures. Nous avons observé de profondes modifications métaboliques touchant notamment le métabolisme du carbone et celui de la biotine.

The diploma thesis is focused on production possibilities of bioethanol from waste paper by yeast Kluyveromyces marxianus. Waste cardboard was used as a potential substrate for bioethanol production. Several methods for cardboard preparation were introduced and compared as well as methods of fermentation. Simultaneous sacharification and fermentation and separate hydrolysis and fermentation of preprepared cardboard paper were performed in different pH buffer (4,8-7). Simultaneous sacharification and fermentation was held at a temperature of 45°C. Hydrolysis in separate hydrolysis and fermentation was performed at 50°C and fermentation at 25°C. Procedures outputs were obtained by sampling in specific time intervals and samples were analyzed by HPLC for presence and concentration glucose and ethanol. The results of the analysis have shown that the highest concentration of glucose produced by enzymatic hydrolysis was achieved by using microwaves, 2% H2SO4 and 2% NaOH pretreated paperboard at pH 4,8. The highest yield of ethanol was obtained by separate hydrolysis and fermentation of pulp pretreated by microwaves, 2% H2SO4 and 2% NaOH in pH 5,4 buffer. The method SHF proved to be more effective for the production of ethanol than SSF.

AgÃncia Nacional do PetrÃleo / CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In this work, the ethanol production from cashew bagasse was studied after acid followed by alkali pretreatment (CAB-OH) using the Separate Hydrolysis and Fermentation (SHF) and Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) processes. In SHF process, the hydrolysate obtained from enzymatic hydrolysis of CAB-OH was used as carbon source for fermentation with different strains of Saccharomyces (S. cerevisiae CCA008, S. cerevisiae 01, S. cerevisiae 02 and Saccharomyces sp. 1238), Kluyveromyces (K. marxianus CCA510, CE025 and ATCC36907) and Hanseniaspora sp. GPBio03. The bioprocess was conducted at 30 ÂC and 50 g.L-1 initial glucose concentration. The K. marxianus ATCC36907 achieved ethanol concentration of 20 g.L-1 with consumption of all glucose in the hydrolysate. Similar results were obtained with Saccharomyces strains and higher ethanol concentration (23.43 g.L-1) was obtained by Saccharomyces sp. 1238. The maximum ethanol concentration of 24.54 g.L-1 was achieved by Hanseniaspora sp. GPBio03. Focused on further studies using SSF process, it was evaluated the temperature influence of thermotolerant yeast K. marxianus ATCC36907 in glucose and enzymatic hydrolysate from CAB-OH. The results showed that the temperature (30, 35, 40, 45 and 50 ÂC) did not affect the values of YE/G (0.45 to 0.46 gethanol/gglucose) using glucose as substrate. Moreover, the ethanol yields obtained with enzymatic hydrolysate were slightly influenced by temperature, 0.39 and 0.43 gethanol/gglucose were obtained at 30 and 40 ÂC, respectively. Based on this, the SSF of CAB-OH and K. marxianus ATCC36907 was conducted at 40 ÂC with cellulases from Celluclast 1.5L at 15 FPU/gcellulose. The highest ethanol concentration (24.90  0.89 g.L-1) was obtained with 76h of fermentation with 0.33 g.L-1.h-1, 0.34 gethanol/gglucose and 66.3% of productivity, YʹE/G and of ethanol efficiency, respectively. In enzymatic hydrolysis studies, the cellulase NS 22074 at 30 FPU/gcellulose without cellobiases supplementation resulted in glucose yield of 93.77  2.72% which is promising for studies of SSF with this enzyme complex. The temperature (40, 42 , 45 and 50 ÂC) influence in SSF process using microcrystalline cellulose, in contrast with SHF results, higher ethanol concentration, 19.86  0.32 g.L-1, was obtained at 40 ÂC. The SSF using CAB-OH, 30 FPU/gcellulose cellulases NS 22074 at 40 ÂC showed higher ethanol concentration of 37.35  0.64 g.L-1 at 80h, with productivity of 0.46 g.L-1.h-1. In this condition, there was an increase of YʹE/G from 0.34 to 0.49 gethanol/gglucose and the ethanol efficiency from 66.3% to 95.59% when compared to results obtained with SSF using Celluclast 1.5L. Based on the results of efficiency and ethanol yield (YʹE/G), the cashew apple bagasse showed as lignocelulose feedstock promising material for second generation ethanol production by SSF process using the yeast K. marxianus ATCC36907 and NS 22074 cellulases complex. / Nesse trabalho, estudou-se a produÃÃo de etanol de bagaÃo de caju apÃs prÃ-tratamento Ãcido seguido de Ãlcali (CAB-OH) atravÃs dos processos de FermentaÃÃo e HidrÃlise Separadas (SHF) e FermentaÃÃo e HidrÃlise SimultÃneas (SSF). No processo SHF, o hidrolisado obtido da hidrÃlise enzimÃtica de CAB-OH foi submetido à etapa de fermentaÃÃo com diferentes linhagens de Saccharomyces (S. cerevisiae CCA008, Saccharomyces sp. 1238, S. cerevisiae 01, S. cerevisiae 02), Kluyveromyces (K. marxianus CCA510, CE025 e ATCC36907) e Hanseniaspora sp. GPBio03. A fermentaÃÃo do hidrolisado foi conduzida a 30 ÂC com concentraÃÃo inicial de glicose de 50 g.L-1. ApÃs o screening de leveduras, a linhagem de K. marxianus ATCC36907 destacou-se com maior concentraÃÃo de etanol de 20 g.L-1 com consumo de toda glicose no hidrolisado. Resultados similares foram obtidos com Saccharomyces sp. 1238 e com a levedura isolada do caju (Hanseniaspora sp. GPBio03) com maiores concentraÃÃes de etanol de 22,41 g.L-1 e 24,54 g.L-1, respectivamente. Com o propÃsito de estudos posteriores de SSF, avaliou-se a influÃncia da temperatura da levedura termotolerante K. marxianus ATCC36907 em glicose PA e hidrolisado enzimÃtico de CAB-OH. Os resultados mostraram que para a glicose PA, a variaÃÃo da temperatura (30, 35, 40, 45 e 50 ÂC) nÃo influenciou nos valores de conversÃo de glicose em etanol (YE/G) obtendo-se valores na faixa de 0,45-0,46 getanol/gglicose. Por outro lado, os resultados de YE/G em hidrolisado enzimÃtico foram ligeiramente influenciados pela temperatura, obtendo-se 0,39 getanol/gglicose a 30ÂC e 0,43 getanol/gglicose a 40 ÂC. Em seguida, realizou-se a SSF de CAB-OH com K. marxianus ATCC36907 a 40 ÂC e celulases de Celluclast 1.5L a 15 FPU/gcelulose. A maior concentraÃÃo de etanol (24,90  0,89 g.L-1) foi obtida em 76h de fermentaÃÃo com produtividade de 0,33 g.L-1.h-1, conversÃo de glicose em etanol (YʹE/G) de 0,34 e eficiÃncia de produÃÃo de etanol de 66,3%. Contudo, visando aumentar a produÃÃo de etanol em estudos posteriores de SSF, realizou-se o estudo de hidrÃlise enzimÃtica com outros complexos de celulases (NS 22074) e celobiases (NS 50010). Os resultados de hidrÃlise enzimÃtica mostraram que a atividade de celulases NS 22074 a 30 FPU/gcelulose sem suplementaÃÃo de celobiase resultou no rendimento de glicose de 93,77  2,72% sendo resultado promissor para estudos de SSF com esse complexo enzimÃtico. Nos ensaios de SSF com celulases do complexo NS 22074, inicialmente realizou-se o estudo da temperatura (40, 42, 45 e 50 ÂC) com K. marxianus ATCC36907 utilizando celulose microcristalina; e, em contrapartida com os resultados SHF, na temperatura de 40 ÂC foi obtida a maior concentraÃÃo de etanol de 19,86  0,32 g.L-1, em 72h de fermentaÃÃo. Diante desses resultados, realizou-se o processo de SSF de CAB-OH nas seguintes condiÃÃes: 40 ÂC de temperatura e 30 FPU/gcelulose do complexo de celulases NS 22074. A maior concentraÃÃo de etanol (37,35  0,64 g.L-1) foi obtida em 80h de fermentaÃÃo, com produtividade de 0,46 g.L-1.h-1. Diante desses resultados, observa-se que a mudanÃa do complexo enzimÃtico de Celluclast 1.5L para NS 22074 proporcionou o aumento no valor de YʹE/G de 0,34 getanol/gglicose para 0,49 getanol/gglicose e no rendimento de etanol de 66,3% para 95,59%, o que torna o bagaÃo de caju prÃ-tratado promissor como matÃria-prima para produÃÃo de etanol de segunda geraÃÃo por processo SSF utilizando a levedura K. marxianus ATCC36907.

Die Entwicklung neuer humanmilchähnlicher, funktioneller und bioaktiver Lebensmittel (z. B. Trinkmilch oder Joghurt), die Oligosaccharide mit einer möglichen Gesundheitswirkung enthalten („Health Claim”), sind für die menschliche Ernährung von besonderem Interesse. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Verfahren zu entwickeln, um - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - komplexe Galacto-Oligosaccharide aus Lactose zu synthetisieren und nicht-proteingebundene, komplexe milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufzureinigen und zu charakterisieren. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Oligosaccharide wurden zunächst hochempfindliche Analysenmethoden etabliert (siehe Kapitel 4.1). Da Oligosaccharide Minorkomponenten in der Milch sind, mussten diese von Fetten, Proteinen und Lactose abgetrennt werden. Die Entfettung erfolgte durch Zentrifugation in der Kälte. Die Proteinabtrennung war unter Verwendung einer 10kDa-Ultrafiltrations-Membran optimal (siehe Kapitel 4.1.1.1). Die Abtrennung der Lactose von den Oligosacchariden stellte die größte Herausforderung dar, da beide Stoffklassen zu den Kohlenhydraten gehören und sich nur geringfügig in ihren Molmassen unterscheiden. Des Weiteren liegt Lactose in Kuhmilch im ca. 1000-fachen Überschuss im Vergleich zu den Oligosacchariden vor. Beim Vergleich verschiedener Aufarbeitungsmethoden zur Lactoseabtrennung stellte sich die Festphasenextraktion an Aktivkohle (GCC-SPE) als am besten geeignet heraus. Mit dieser Methode wurde - im Gegensatz zur ebenfalls untersuchten Größenausschlusschromatographie - eine hohe Reproduzierbarkeit der Analyten erreicht. Während bei der Größenausschlusschromatographie das Kuhmilch-Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc nahezu vollständigen verloren ging, konnten nach GCC-SPEAufarbeitung fast 100 % des Analyten wiedergefunden werden (siehe Kapitel 4.1.1.2). Zur Charakterisierung der Oligosaccharide wurde eine hochauflösende Anionenaustauscherchromatographie mit pulsierender amperometrischen Detektion (HPAEC-PAD) etabliert. Parallel zur hochempfindlichen Detektion mittels PAD wurde zur direkten Strukturaufklärung von underivatisierten Zuckern eine Online-Kopplung an einen Massendetektor (IT-MS) aufgebaut. Einzelne Analyten konnten mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Oligosaccharidstandards identifiziert und quantifiziert werden (siehe Kapitel 4.1.1.3). Als weitere Möglichkeit zur Quantifizierung der Oligosaccharide wurden photometrische Schnelltests entwickelt (siehe Kapitel 4.1.2). Zur Absicherung der HPAEC-PAD-Analysendaten sollten zukünftig weitere Analysenmethoden etabliert werden (z. B. enzymatischer Verdau der Oligosaccharide, Analyse der Monosaccharide nach Hydrolyse der OS, HILIC-HPLC). Die entwickelte HPAEC-PAD-Methode wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von Oligosacchariden in Milchproben verschiedener Nutztierarten (siehe Kapitel 4.2.1) und in Produktströmen der milch- und molkeverarbeitenden Industrie (siehe Kapitel 4.2.2) verwendet. Die Untersuchungen von Milchproben unterschiedlicher Nutztierarten zeigten, dass jede Milch hinsichtlich der MOS einzigartig ist. Dies konnte anhand der verschiedenen, identifizierten MOS mit unterschiedlichen Konzentrationen belegt werden. Der höchste MOS-Gehalt konnte in Humanmilch detektiert werden, gefolgt von Kamelmilch, Schafsmilch, Ziegenmilch, Kuhmilch und Stutenmilch (siehe Kapitel 4.2.1). Die Untersuchungen der Produktströme der milch- und molkeverarbeitenden Industrie zeigten, dass es während der Lactosekristallisation und der Aktivkohlebehandlung zu Verlusten an MOS kommt. Bei anderen Prozessschritten, wie Entfettung, Proteinabtrennung, Aufkonzentrierung oder Käseherstellung, war kein Einfluss auf die MOS-Konzentrationen ersichtlich (siehe Kapitel 4.2.2). Die entwickelte Methode zur OS-Bestimmung mittels HPAEC-PAD könnte zukünftig auf die Analysen proteingebundener Oligosaccharide ausgedehnt werden [[Grey, 2009] und [Weiß, 2001]]. Zur Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels wurden Galacto-Oligosaccharide enzymatisch - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - aus Lactose synthetisiert (siehe Kapitel 4.3). Für die Entwicklung des Verfahrens wurden verschiedene β-Galactosidasen (Enzyme aus Kluyveromyces lactis, Aspergillus oryzae und Bacillus circulans) bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen getestet. Die höchste GOS-Ausbeute (19,8 Flächenprozent der HPAEC an Haupt-Trisaccharid, 40,5 % GOS) konnte mit Hilfe der β-Galactosidase aus B. circulans bei pH 4, 40 °C und 12 U/g erreicht werden. Dabei wurden v. a. Tri- bis Pentasaccharide gebildet. Das Hauptreaktionsprodukt war das Trisaccharid 4'-Galactosyllactose (4'-GL). Mit Hilfe der β-Galactosidase aus A. oryzae konnte bei pH 4,5, 40 °C und 12 U/g die zweitgrößte GOS-Ausbeute (14,2 % Haupt-Trisaccharid, 19,7 % GOS) synthetisiert werden. Dabei wurden v. a. Tri- und Tetrasaccharide mit dem Hauptreaktionsprodukt 6'-Galactosyllactose (6'-GL) gebildet. Die geringste GOS-Ausbeute (10,5 % Haupt-Trisaccharid, 3,0 % GOS) wurde mit der β-Galactosidase aus K. lactis bei pH 7, 40 °C und 12 U/g erreicht. Di- und Trisaccharide sowie ein geringer Anteil an Tetrasacchariden konnten dabei synthetisiert werden. Das Hauptreaktionsprodukt war hierbei das Trisaccharid 6'-GL. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die milcheigenen Oligosaccharide während der Lactosehydrolyse mit den drei getesteten β-Galactosidasen weitgehend erhalten bleiben (siehe Kapitel 4.3.4). Neben den Galacto-Oligosacchariden, die nach enzymatischer Synthese direkt im Lebensmittel eingesetzt werden können, wurden milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufgereinigt (siehe Kapitel 4.4.1). Zur Aufreinigung der MOS wurden Nanofiltrationsversuche in verschiedenen Maßstäben, mit unterschiedlichen Prozessparametern und diversen Membranen durchgeführt. Die im hohen Überschuss vorhandene Lactose wurde vor der Nanofiltration durch enzymatische Hydrolyse in ihre Monosaccharide gespalten, wodurch die Trennung von Monosacchariden und MOS verbessert wurde. Die Membran SR50/SR2 stellte sich für die MOS-Aufreinigung als am besten geeignet heraus. Mono- und Disaccharide konnten mit dieser Membran nahezu vollständig abgetrennt und MOS zu 42,1 % bis 52,4 % wiedergefunden werden. Das Verhältnis der Mono- und Disaccharide zu MOS konnte von ca. 1000:1 auf 18,5:1 zu Gunsten der MOS verändert werden. Der Anteil der Oligosaccharide am Gesamtzuckergehalt wurde von 0,1 % auf 5,1 % erhöht. Aus 40 kg hydrolysiertem Ultrafiltrations-Magermilchpermeat konnten 332,5 mg GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc, 414,1 mg 3'-SL und 91,5 mg 6'-SL gewonnen werden (Kapitel 4.4.1.4). Die durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben sind für den Einsatz in einem potentiell funktionellen Lebensmittel geeignet. Da der Restlactosegehalt der synthetisierten, GOS-haltigen Proben und der aufgereinigten, MOS-haltigen Proben für weitere Analysen - wie orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung - zu hoch war, erfolgte eine zweite Aufreinigung mittels präparativer Chromatographie an Aktivkohle (siehe Kapitel 4.4.2). Dadurch konnten bei den synthetisierten, GOS-haltigen Proben die Monosaccharide vollständig entfernt, der Restlactosegehalt auf unter 1 % am Gesamtzuckergehalt gesenkt und GOS aufgereinigt werden. Durch die Aktivkohle-Aufreinigung der durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben konnten Mono- und Disaccharide von dem milcheigenen Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc sowie von den GOS - entstanden durch die vorherige Behandlung mit β-Galactosidase - abgetrennt werden. Die Sialyllactosen gingen dabei nahezu vollständig verloren. Auf Grund der vermuteten gesundheitsfördernden Wirkung der Sialyllactosen bedarf es weiterer Forschungsaktivitäten. Insbesondere ist eine Optimierung des Aufgabevolumens, der Konditionierung und der Wahl der stationären Phase wünschenswert. Mit den durch Aktivkohle aufgereinigten GOS-Lösungen, die weniger als 1 % Mono- und Disaccharide am Gesamtzuckergehalt enthielten, wurden orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung durchgeführt (siehe Kapitel 4.5). Die orientierenden Studien mit Bifidobacterium longum ließen eine potentiell bifidogene Wirkung der untersuchten GOS-Lösungen erkennen. Diese GOS-Proben zeigten dabei eine stärkere bifidogene Wirkung als die bifidogene Referenzsubstanz Lactulose und der Vivinal®GOS-Sirup. Zukünftig sollten die Proben, die nach Beendigung der bakteriellen Reaktion gewonnen wurden, mittels HPAEC-PAD analysiert werden. Dadurch könnte der Kohlenhydratabbau bzw. die Bildung organischer Säuren untersucht werden. Der zeitliche Verlauf sowie der Einsatz anderer Mikroorganismen - wie Lactobazillen und Clostridien - könnten ebenfalls untersucht werden. Andere orientierende Studien, wie antiinflammatorische Tests, wären bei der weiteren Charakterisierung der Oligosaccharide hilfreich. Die Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels erfolgte im Labormaßstab unter Zusatz der potentiell bifidogenen GOS-Lösung, die mit Hilfe von β-Galactosidase aus K. lactis synthetisiert wurde. Die Art der Erhitzung des Lebensmittels - Pasteurisierung vs. Hocherhitzung - hatte keinen Einfluss auf die Zuckerzusammensetzung und die Zuckergehalte. Während einer anschließenden sechswöchigen Lagerung in der Kälte konnte kein Abbau der Kohlenhydrate detektiert werden. Als Ausblick für weitere Forschungen ist die Bestätigung der potentiell bifidogenen Wirkung der MOS-haltigen Proben von primärer Bedeutung. Anschließend könnten Studien mit funktionellen, MOS-haltigen Lebensmitteln durchgeführt werden. Dabei sollte versucht werden, ein humanmilchähnliches Lebensmittel mit ca. 20 % sauren und ca. 80 % neutralen Oligosacchariden herzustellen. Die mittels Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben könnten als saurer Zusatz und die enzymatisch synthetisierten, GOS-haltigen Proben als neutraler Zusatz verwendet werden. Des Weiteren sollte eine Überprüfung der potentiell bifidogenen Wirkung sowie eine sensorische Prüfung des hergestellten Lebensmittels durchgeführt werden. Sobald MOS durch Nanofiltration bzw. GOS mittels enzymatischer Synthese im großtechnischen Maßstab aufgereinigt bzw. hergestellt werden können, sind Humanstudien zur Bestätigung der Wirksamkeit von milcheigenen Oligosaccharide bzw. der Galacto-Oligosaccharide möglich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten potentiell funktionelle Lebensmittelinhaltsstoffe (enzymatisch synthetisierte, GOS-haltige Lösungen) und Lebensmittelinhaltsstoffe, deren vermutete Funktionalität noch nicht bestätigt wurde (durch Nanofiltration aufgereinigte, MOS-haltige Lösungen), hergestellt werden. Unter Verwendung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse und der Erfüllung der im Ausblick geschilderten Bedingungen, ist eine großtechnische Produktion eines funktionellen, Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels möglich.

Die Entwicklung neuer humanmilchähnlicher, funktioneller und bioaktiver Lebensmittel (z. B. Trinkmilch oder Joghurt), die Oligosaccharide mit einer möglichen Gesundheitswirkung enthalten („Health Claim”), sind für die menschliche Ernährung von besonderem Interesse. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Verfahren zu entwickeln, um - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - komplexe Galacto-Oligosaccharide aus Lactose zu synthetisieren und nicht-proteingebundene, komplexe milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufzureinigen und zu charakterisieren. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Oligosaccharide wurden zunächst hochempfindliche Analysenmethoden etabliert (siehe Kapitel 4.1). Da Oligosaccharide Minorkomponenten in der Milch sind, mussten diese von Fetten, Proteinen und Lactose abgetrennt werden. Die Entfettung erfolgte durch Zentrifugation in der Kälte. Die Proteinabtrennung war unter Verwendung einer 10kDa-Ultrafiltrations-Membran optimal (siehe Kapitel 4.1.1.1). Die Abtrennung der Lactose von den Oligosacchariden stellte die größte Herausforderung dar, da beide Stoffklassen zu den Kohlenhydraten gehören und sich nur geringfügig in ihren Molmassen unterscheiden. Des Weiteren liegt Lactose in Kuhmilch im ca. 1000-fachen Überschuss im Vergleich zu den Oligosacchariden vor. Beim Vergleich verschiedener Aufarbeitungsmethoden zur Lactoseabtrennung stellte sich die Festphasenextraktion an Aktivkohle (GCC-SPE) als am besten geeignet heraus. Mit dieser Methode wurde - im Gegensatz zur ebenfalls untersuchten Größenausschlusschromatographie - eine hohe Reproduzierbarkeit der Analyten erreicht. Während bei der Größenausschlusschromatographie das Kuhmilch-Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc nahezu vollständigen verloren ging, konnten nach GCC-SPEAufarbeitung fast 100 % des Analyten wiedergefunden werden (siehe Kapitel 4.1.1.2). Zur Charakterisierung der Oligosaccharide wurde eine hochauflösende Anionenaustauscherchromatographie mit pulsierender amperometrischen Detektion (HPAEC-PAD) etabliert. Parallel zur hochempfindlichen Detektion mittels PAD wurde zur direkten Strukturaufklärung von underivatisierten Zuckern eine Online-Kopplung an einen Massendetektor (IT-MS) aufgebaut. Einzelne Analyten konnten mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Oligosaccharidstandards identifiziert und quantifiziert werden (siehe Kapitel 4.1.1.3). Als weitere Möglichkeit zur Quantifizierung der Oligosaccharide wurden photometrische Schnelltests entwickelt (siehe Kapitel 4.1.2). Zur Absicherung der HPAEC-PAD-Analysendaten sollten zukünftig weitere Analysenmethoden etabliert werden (z. B. enzymatischer Verdau der Oligosaccharide, Analyse der Monosaccharide nach Hydrolyse der OS, HILIC-HPLC). Die entwickelte HPAEC-PAD-Methode wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von Oligosacchariden in Milchproben verschiedener Nutztierarten (siehe Kapitel 4.2.1) und in Produktströmen der milch- und molkeverarbeitenden Industrie (siehe Kapitel 4.2.2) verwendet. Die Untersuchungen von Milchproben unterschiedlicher Nutztierarten zeigten, dass jede Milch hinsichtlich der MOS einzigartig ist. Dies konnte anhand der verschiedenen, identifizierten MOS mit unterschiedlichen Konzentrationen belegt werden. Der höchste MOS-Gehalt konnte in Humanmilch detektiert werden, gefolgt von Kamelmilch, Schafsmilch, Ziegenmilch, Kuhmilch und Stutenmilch (siehe Kapitel 4.2.1). Die Untersuchungen der Produktströme der milch- und molkeverarbeitenden Industrie zeigten, dass es während der Lactosekristallisation und der Aktivkohlebehandlung zu Verlusten an MOS kommt. Bei anderen Prozessschritten, wie Entfettung, Proteinabtrennung, Aufkonzentrierung oder Käseherstellung, war kein Einfluss auf die MOS-Konzentrationen ersichtlich (siehe Kapitel 4.2.2). Die entwickelte Methode zur OS-Bestimmung mittels HPAEC-PAD könnte zukünftig auf die Analysen proteingebundener Oligosaccharide ausgedehnt werden [[Grey, 2009] und [Weiß, 2001]]. Zur Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels wurden Galacto-Oligosaccharide enzymatisch - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - aus Lactose synthetisiert (siehe Kapitel 4.3). Für die Entwicklung des Verfahrens wurden verschiedene β-Galactosidasen (Enzyme aus Kluyveromyces lactis, Aspergillus oryzae und Bacillus circulans) bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen getestet. Die höchste GOS-Ausbeute (19,8 Flächenprozent der HPAEC an Haupt-Trisaccharid, 40,5 % GOS) konnte mit Hilfe der β-Galactosidase aus B. circulans bei pH 4, 40 °C und 12 U/g erreicht werden. Dabei wurden v. a. Tri- bis Pentasaccharide gebildet. Das Hauptreaktionsprodukt war das Trisaccharid 4'-Galactosyllactose (4'-GL). Mit Hilfe der β-Galactosidase aus A. oryzae konnte bei pH 4,5, 40 °C und 12 U/g die zweitgrößte GOS-Ausbeute (14,2 % Haupt-Trisaccharid, 19,7 % GOS) synthetisiert werden. Dabei wurden v. a. Tri- und Tetrasaccharide mit dem Hauptreaktionsprodukt 6'-Galactosyllactose (6'-GL) gebildet. Die geringste GOS-Ausbeute (10,5 % Haupt-Trisaccharid, 3,0 % GOS) wurde mit der β-Galactosidase aus K. lactis bei pH 7, 40 °C und 12 U/g erreicht. Di- und Trisaccharide sowie ein geringer Anteil an Tetrasacchariden konnten dabei synthetisiert werden. Das Hauptreaktionsprodukt war hierbei das Trisaccharid 6'-GL. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die milcheigenen Oligosaccharide während der Lactosehydrolyse mit den drei getesteten β-Galactosidasen weitgehend erhalten bleiben (siehe Kapitel 4.3.4). Neben den Galacto-Oligosacchariden, die nach enzymatischer Synthese direkt im Lebensmittel eingesetzt werden können, wurden milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufgereinigt (siehe Kapitel 4.4.1). Zur Aufreinigung der MOS wurden Nanofiltrationsversuche in verschiedenen Maßstäben, mit unterschiedlichen Prozessparametern und diversen Membranen durchgeführt. Die im hohen Überschuss vorhandene Lactose wurde vor der Nanofiltration durch enzymatische Hydrolyse in ihre Monosaccharide gespalten, wodurch die Trennung von Monosacchariden und MOS verbessert wurde. Die Membran SR50/SR2 stellte sich für die MOS-Aufreinigung als am besten geeignet heraus. Mono- und Disaccharide konnten mit dieser Membran nahezu vollständig abgetrennt und MOS zu 42,1 % bis 52,4 % wiedergefunden werden. Das Verhältnis der Mono- und Disaccharide zu MOS konnte von ca. 1000:1 auf 18,5:1 zu Gunsten der MOS verändert werden. Der Anteil der Oligosaccharide am Gesamtzuckergehalt wurde von 0,1 % auf 5,1 % erhöht. Aus 40 kg hydrolysiertem Ultrafiltrations-Magermilchpermeat konnten 332,5 mg GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc, 414,1 mg 3'-SL und 91,5 mg 6'-SL gewonnen werden (Kapitel 4.4.1.4). Die durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben sind für den Einsatz in einem potentiell funktionellen Lebensmittel geeignet. Da der Restlactosegehalt der synthetisierten, GOS-haltigen Proben und der aufgereinigten, MOS-haltigen Proben für weitere Analysen - wie orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung - zu hoch war, erfolgte eine zweite Aufreinigung mittels präparativer Chromatographie an Aktivkohle (siehe Kapitel 4.4.2). Dadurch konnten bei den synthetisierten, GOS-haltigen Proben die Monosaccharide vollständig entfernt, der Restlactosegehalt auf unter 1 % am Gesamtzuckergehalt gesenkt und GOS aufgereinigt werden. Durch die Aktivkohle-Aufreinigung der durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben konnten Mono- und Disaccharide von dem milcheigenen Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc sowie von den GOS - entstanden durch die vorherige Behandlung mit β-Galactosidase - abgetrennt werden. Die Sialyllactosen gingen dabei nahezu vollständig verloren. Auf Grund der vermuteten gesundheitsfördernden Wirkung der Sialyllactosen bedarf es weiterer Forschungsaktivitäten. Insbesondere ist eine Optimierung des Aufgabevolumens, der Konditionierung und der Wahl der stationären Phase wünschenswert. Mit den durch Aktivkohle aufgereinigten GOS-Lösungen, die weniger als 1 % Mono- und Disaccharide am Gesamtzuckergehalt enthielten, wurden orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung durchgeführt (siehe Kapitel 4.5). Die orientierenden Studien mit Bifidobacterium longum ließen eine potentiell bifidogene Wirkung der untersuchten GOS-Lösungen erkennen. Diese GOS-Proben zeigten dabei eine stärkere bifidogene Wirkung als die bifidogene Referenzsubstanz Lactulose und der Vivinal®GOS-Sirup. Zukünftig sollten die Proben, die nach Beendigung der bakteriellen Reaktion gewonnen wurden, mittels HPAEC-PAD analysiert werden. Dadurch könnte der Kohlenhydratabbau bzw. die Bildung organischer Säuren untersucht werden. Der zeitliche Verlauf sowie der Einsatz anderer Mikroorganismen - wie Lactobazillen und Clostridien - könnten ebenfalls untersucht werden. Andere orientierende Studien, wie antiinflammatorische Tests, wären bei der weiteren Charakterisierung der Oligosaccharide hilfreich. Die Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels erfolgte im Labormaßstab unter Zusatz der potentiell bifidogenen GOS-Lösung, die mit Hilfe von β-Galactosidase aus K. lactis synthetisiert wurde. Die Art der Erhitzung des Lebensmittels - Pasteurisierung vs. Hocherhitzung - hatte keinen Einfluss auf die Zuckerzusammensetzung und die Zuckergehalte. Während einer anschließenden sechswöchigen Lagerung in der Kälte konnte kein Abbau der Kohlenhydrate detektiert werden. Als Ausblick für weitere Forschungen ist die Bestätigung der potentiell bifidogenen Wirkung der MOS-haltigen Proben von primärer Bedeutung. Anschließend könnten Studien mit funktionellen, MOS-haltigen Lebensmitteln durchgeführt werden. Dabei sollte versucht werden, ein humanmilchähnliches Lebensmittel mit ca. 20 % sauren und ca. 80 % neutralen Oligosacchariden herzustellen. Die mittels Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben könnten als saurer Zusatz und die enzymatisch synthetisierten, GOS-haltigen Proben als neutraler Zusatz verwendet werden. Des Weiteren sollte eine Überprüfung der potentiell bifidogenen Wirkung sowie eine sensorische Prüfung des hergestellten Lebensmittels durchgeführt werden. Sobald MOS durch Nanofiltration bzw. GOS mittels enzymatischer Synthese im großtechnischen Maßstab aufgereinigt bzw. hergestellt werden können, sind Humanstudien zur Bestätigung der Wirksamkeit von milcheigenen Oligosaccharide bzw. der Galacto-Oligosaccharide möglich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten potentiell funktionelle Lebensmittelinhaltsstoffe (enzymatisch synthetisierte, GOS-haltige Lösungen) und Lebensmittelinhaltsstoffe, deren vermutete Funktionalität noch nicht bestätigt wurde (durch Nanofiltration aufgereinigte, MOS-haltige Lösungen), hergestellt werden. Unter Verwendung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse und der Erfüllung der im Ausblick geschilderten Bedingungen, ist eine großtechnische Produktion eines funktionellen, Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels möglich.