In der modernen Zahnmedizin stellen rekonstruktive Maßnahmen große Anforderungen an den Behandler. Verlorengegangener Alveolarknochen kann mit der geführten Knochenregeneration wieder aufgebaut und sogar vermehrt werden. Dieses Verfahren hat sich als sogenannter „Goldstandard“ etabliert. In der Medizin gehört die Anwendung hyperbaren Sauerstoffs bei ausgewählten Krankheitsbildern mittlerweile zum Standard. Aufgrund seiner positiven Eigenschaften auf die Neoangiogenese, Sauerstoffdiffusion und seiner bakteriziden Wirkung wird das Behandlungsergebnis teilweise erheblich verbessert oder eine Therapie dadurch erst möglich. Ziel der vorliegenden Arbeit war, quantitative Aussagen darüber zu treffen, ob die Kombination aus geführter Knochenregeneration mit nichtresorbierbaren Membranen aus expandiertem Polytetrafluorethylen und der Anwendung hyperbaren Sauerstoffs das Knochenneuwachstum signifikant beeinflusst. Dazu wurde ein Modell mit 40 Albino Sprague-Dawley Ratten, unterteilt in 4 Gruppen à 10 Tieren, gewählt, um nach einer Versuchsdauer von 14 Tagen anhand angefertigter histologischer Schnittbilder Neuknochen histometrisch zu bestimmen und zu vergleichen. Untersuchungsparameter waren die Neuknochenlänge und Neuknochenfläche. Die statistische Auswertung der ermittelten Daten bestätigte die Überlegenheit membrangeführter Knochenregeneration (Gruppe 4) im Vergleich zur rein schleimhaut- und periostgedeckten Defektbehandlung (Gruppe 3). Zahlreiche Untersuchungen dazu liegen in der Literatur vor. Die zusätzliche Anwendung von hyperbarem Sauerstoff ergab keine signifikante Verbesserung der Ergebnisse. Im Gegenteil zeigte sich eine tendenzielle Verschlechterung, was die Signifikanzen beim statistischen Vergleich der Gruppen 2 und 4 belegen. In diesem Modell konnte nicht gezeigt werden, dass die vielen positiven Eigenschaften des hyperbaren Sauerstoffs auf den Knochen für Knochendefekte „kritischer Größe“ begünstigend und verbessernd anwendbar sind. / In modern dentistry the regeneration of lost hard tissues still requires high skills. Reconstruction of deficient alveolar ridges using guided bone regeneration is possible and considered the “gold standard”. Hyperbaric oxygen therapy (HBOT) is standard in certain diseases since its positive effects on angiogenesis and oxygen diffusion and its antibacterial effect allows for better wound healing results. It was the aim of this study to investigate the influence of hyperbaric oxygen therapy and guided bone regeneration with expanded non-absorbable polytetrafluoroethylene membranes on the formation of new bone. Forty albino sprague-dawley rats, divided in 4 groups, were used for this investigation. After a period of 14 days new bone formation was histologically described and histomorphometrically assessed. The use of a membrane (group 4) revealed significantly better results when compared soft tissue coverage only (group 3) However, no significant advantages could be demonstrated upon application of hyperbaric oxygen with or without the use of a membrane (groups 2 and 4). On the contrary, there was a tendency towards worse regenerative results. The various positive effects of hyperbaric oxygen therapy on bone tissue could not be demonstrates in defects of “critical size” in this rat model.

Thesis (doctoral)--Universität, Marburg, 2004.

Zugl.: München, Univ., Diss., 2008

The goal of the project VascuBone is to develop a tool box for bone regeneration, which on one hand fulfills basic requirements (e.g. biocompatibility, properties of the surface, strength of the biomaterials) and on the other hand is freely combinable with what is needed in the respective patient's situation. The tool box will include a variation of biocompatible biomaterials and cell types, FDA-approved growth factors, material modification technologies, simulation and analytical tools like molecular imaging-based in vivo diagnostics, which can be combined for the specific medical need. This tool box will be used to develop translational approaches for regenerative therapies of different types of bone defects. This project receives funding from the European Union's Seventh Framework Program (VascuBone 2010). The present study is embedded into this EU project. The intention of this study is to assess the changes of the global gene expression patterns of endothelial progenitor cells (EPCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) after direct cell-cell contact as well as the influence of conditioned medium gained from MSCs on EPCs and vice versa. EPCs play an important role in postnatal vasculogenesis. An intact blood vessel system is crucial for all tissues, including bone. Latest findings in the field of bone fracture healing and repair by the use of tissue engineering constructs seeded with MSCs raised the idea of combining MSCs and EPCs to enhance vascularization and therefore support survival of the newly built bone tissue. RNA samples from both experimental set ups were hybridized on Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 and analyzed by microarray technology. Bioinformatic analysis was applied to the microarray data and verified by RT-PCR. This study gives detailed information on how EPCs and MSCs communicate with each other and therefore gives insights into the signaling pathways of the musculoskeletal system. These insights will be the base for further functional studies on protein level for the purpose of tissue regeneration. A better understanding of the cell communication of MSCs and EPCs and subsequently the targeting of relevant factors opens a variety of new opportunities, especially in the field of tissue engineering. The second part of the present work was to develop an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for a target protein from the lists of differentially expressed genes revealed by the microarray analysis. This project was in cooperation with Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany. The development of the ELISA aimed to have an in vitro diagnostic tool to monitor e.g. the quality of cell seeded tissue engineering constructs. The target protein chosen from the lists was klotho. Klotho seemed to be a very promising candidate since it is described in the literature as anti-aging protein. Furthermore, studies with klotho knock-out mice showed that these animals suffered from several age-related diseases e.g. osteoporosis and atherosclerosis. As a co-receptor for FGF23, klotho plays an important role in bone metabolism. The present study will be the first one to show that klotho is up-regulated in EPCs after direct cell-cell contact with MSCs. The development of an assay with a high sensitivity on one hand and the capacity to differentiate between secreted and shedded klotho on the other hand will allow further functional studies of this protein and offers a new opportunity in medical diagnostics especially in the field of metabolic bone disease. / Das Ziel des durch die europäische Union geförderten Projekts VascuBone ist die Entwicklung einer tool box zur Knochenregeneration, die einerseits sämtliche Grundanforderungen erfüllt, beispielsweise an die Biokompatibilität, Oberflächenbeschaffenheit und Robustheit der Biomaterialien, und andererseits frei an den Bedarf der individuellen Patientensituation angepasst werden kann. Sie beinhaltet unterschiedlichste biokompatible Materialien und Zelltypen, FDA-zugelassene Wachstumsfaktoren, materialmodifizierende Technologien sowie Simulations- und analytische Werkzeuge, wie die auf molekularer Bildgebung basierende in-vivo-Diagnostik (MRI und PET/CT), die für den spezifischen medizinischen Bedarf kombiniert werden können. Die tool box wird für die Entwicklung translationaler Ansätze in der regenerativen Medizin für unterschiedliche Arten von Knochendefekten verwendet (VascuBone 2010). Eingebettet in dieses EU-Projekt sollten in der vorliegenden Arbeit die molekularen Grundlagen und Änderungen der globalen Genexpressionsmuster von endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) nach direktem Zell-Zell-Kontakt sowie nach Gabe von konditioniertem Medium untersucht werden. EPCs spielen eine wichtige Rolle in der postnatalen Vaskulogenese. Ein intaktes Blutgefäßsystem ist überlebensnotwendig für alle Gewebe, einschließlich Knochen. Neueste Erkenntnisse in der Knochenheilung und -regeneration durch die Nutzung von Tissue-Engineering-Konstrukten, die mit MSCs besiedelt wurden, förderten die Idee, MSCs und EPCs zu kombinieren, um die Vaskularisierung – und somit das Überleben – des neu gebildeten Knochengewebes zu begünstigen. Die RNA-Proben aus beiden Versuchsansätzen wurden für die Microarray-Analysen auf Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 hybridisiert. Die Array-Daten wurden bioinformatisch ausgewertet und mittels RT-PCR verifiziert. Die vorliegende Arbeit gibt detailliert Aufschluss darüber, wie MSCs und EPCs miteinander kommunizieren, und erlaubt somit wichtige Einblicke in Signalwege des muskuloskelettalen Systems. Dies wiederum ermöglicht weitere funktionelle Studien auf Proteinebene zum Zwecke der Geweberegeneration. Das bessere Verständnis der Zellkommunikation zwischen MSCs und EPCs und somit die gezielte Adressierung von relevanten Faktoren eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Anwendung, insbesondere im Bereich Tissue Engineering. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte in Kooperation mit der Firma Immundiagnostik AG, Bensheim, ein ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) aufgebaut werden. Ziel war es, für ein geeignetes Protein aus den zu erwartenden Listen regulierter Gene ein in-vitro-diagnostisches Nachweisverfahren zu entwickeln, das ggf. später als Qualitätsnachweis für erfolgreich besiedelte Tissue-Engineering-Konstrukte herangezogen werden könnte. Als geeigneter Kandidat wurde Klotho ausgewählt. Klotho gilt als anti-aging-Protein, da Klotho-knock-out-Mäuse alle alterstypischen Erkrankungen wie Osteoporose oder Arteriosklerose zeigen. Als Co-Rezeptor für FGF23 spielt Klotho außerdem eine wichtige Rolle im Knochenstoffwechsel. Diese Studie ist die erste, die zeigt, dass in EPCs nach direktem Zell-Zell-Kontakt mit MSCs Klotho hochreguliert wird. Die Entwicklung eines sensitiven und differenzierten Nachweises von sezerniertem Klotho sowie der von der Membran proteolytisch abgespaltenen Form von Klotho, eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Diagnostik, insbesondere im Bereich der Knochenstoffwechselerkrankungen

The skeletal system forms the mechanical structure of the body and consists of bone, which is hard connective tissue. The tasks the skeleton and bones take over are of mechanical, metabolic and synthetic nature. Lastly, bones enable the production of blood cells by housing the bone marrow. Bone has a scarless self-healing capacity to a certain degree. Injuries exceeding this capacity caused by trauma, surgical removal of infected or tumoral bone or as a result from treatment-related osteonecrosis, will not heal. Critical size bone defects that will not heal by themselves are still object of comprehensive clinical investigation. The conventional treatments often result in therapies including burdening methods as for example the harvesting of autologous bone material. The aim of this thesis was the creation of a prevascularized bone implant employing minimally invasive methods in order to minimize inconvenience for patients and surgical site morbidity. The basis for the implant was a decellularized, naturally derived vascular scaffold (BioVaSc-TERM®) providing functional vessel structures after reseeding with autologous endothelial cells. The bone compartment was built by the combination of the aforementioned scaffold with synthetic β-tricalcium phosphate. In vitro culture for tissue maturation was performed using bioreactor technology before the testing of the regenerative potential of the implant in large animal experiments in sheep. A tibia defect was treated without the anastomosis of the implant’s innate vasculature to the host’s circulatory system and in a second study, with anastomosis of the vessel system in a mandibular defect. While the non-anastomosed implant revealed a mostly osteoconductive effect, the implants that were anastomosed achieved formation of bony islands evenly distributed over the defect. In order to prepare preconditions for a rapid approval of an implant making use of this vascularization strategy, the manufacturing of the BioVaSc-TERM® as vascularizing scaffold was adjusted to GMP requirements. / Das Skelett bildet die mechanische Struktur des Körpers und besteht aus Knochen, einem harten Bindegewebe. Knochen übernehmen mechanische, metabolische und synthetische Aufgaben. Schlussendlich ermöglichen Knochen die Synthese von Blutzellen durch die Beherbergung des Knochenmarks. Wird die Heilungskapazität von Knochen durch Trauma, operative Entfernung von infiziertem oder tumorösem Knochen oder als Ergebnis behandlungsbedingter Osteonekrose, überschritten, findet keine vollständige Heilung statt. Knochendefekte, die eine kritische Größe überschreiten, sind daher immer noch Gegenstand umfangreicher, klinischer Forschung. Bei herkömmlichen Behandlungsmethoden können Eingriffe notwendig werden, die den Patienten belasten, wie bei der Gewinnung von autologem Knochenmaterial. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines prävaskularisierten Implantats unter Verwendung minimalinvasiver Methoden, um die Belastung von Patienten und die Morbidität an der Entnahmestelle, zu verringern. Zur Herstellung eines vaskularisierten Implantats bildete ein dezellularisiertes Darmsegment (Jejunum) porcinen Ursprungs die Grundlage (BioVasc-TERM®). Diese Trägerstruktur stellte ein funktionales Blutgefäßsystem nach Wiederbesiedelung mit autologen Endothelzellen bereit. Der Knochenanteil des Implantats wurde durch die Kombination der genannten Trägerstruktur mit dem synthetischen Knochenersatzmaterial β-Tricalciumphosphat gebildet. In-vitro-Kultivierung in einem Bioreaktor führte zur Reifung des Implantats vor der Testung seines Potenzials zur Knochenregeneration in Großtierversuchen bei Schafen. Ein Tibiadefekt wurde behandelt ohne die Anastomose des implantateigenen Gefäßsystems an den Blutkreislauf und ein Mandibeldefekt wurde mit Gefäßanschluss behandelt. Das Implantat ohne Gefäßanschluss hatte einen osteokonduktiven Effekt, während das anastomosierte Implantat zur Bildung zahlreicher Knocheninseln, gleichmäßig über den Defekt verteilt, führte. Um eine zügige Zulassung eines Implantats, das diese Strategie zur Vaskularisierung von Knochen nutzt, zu ermöglichen, wurde die Herstellung der BioVaSc-TERM® an die Vorgaben der Guten Herstellungspraxis angepasst.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die biologische Charakterisierung neuartiger nanostrukturierter und für die Knochenregeneration geeigneter Calciumphosphatzemente (CPC). Hierzu wurde ein aus α-Tricalciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, gefälltem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat bestehender CPC verwendet, der mit den Biomolekülen Cocarboxylase, Glucuronsäure, Weinsäure, Glucose-1-phosphat, Arginin, Lysin und Asparaginsäure-Natriumsalz modifiziert wurde. Ermittelt wurde dabei der Einfluss der Modifikationen auf die Proteinadsorption und die Biokompatibilität. In Vorversuchen wurden die Zementmodifikationen hinsichtlich ihrer Bindungskapazität für humane Serumproteine und für das knochenspezifische Protein Osteocalcin (OC) sowie hinsichtlich ihrer Eignung für die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen fötalen Osteoblasten (hFOB 1.19) und humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dabei erwiesen sich die Modifikationen mit Cocarboxylase, Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz als besonders günstig. Mit diesen „Favoriten“ erfolgte eine detailliertere Analyse der Adsorption humaner und boviner Serumproteine sowie der knochen-spezifischen Proteine Osteocalcin, BMP-2 und VEGF. Dabei führte sowohl der Zusatz von Cocarboxylase, als auch der von Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz zu einer erhöhten Adsorption von Serumproteinen. Die Bindungsaffinität des Basiszements gegenüber Osteocalcin, BMP-2 und VEGF konnte durch Funktionalisierung mit Arginin gesteigert werden. Während die Modifizierung mit Cocarboxylase nur die VEGF-Adsorption förderte, bewirkte der Zusatz von Asparaginsäure-Natriumsalz eine Erhöhung der Osteocalcin- und BMP-2-Adsorption. Bedingt durch die größere spezifische Oberfläche der noch nicht abgebundenen Zemente, war die Menge adsorbierter Proteine auf frisch hergestellten Zementproben im Vergleich zu abgebundenen und ausgehärteten Zementen signifikant höher. Die Eignung der ausgewählten Zementvarianten als Knochenersatzmaterialien wurde mithilfe humaner mesenchymaler Stammzellen zweier verschiedener Spender getestet. Bei Verwendung abgebundener und ausgehärteter Zemente waren die hMSC in der Lage, auf allen Modifikationen zu adhärieren, zu proliferieren und in die osteogene Richtung zu differenzieren. Eine vorherige Inkubation der Zementproben mit humanem Serum förderte dabei vor allem die Zelladhäsion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass hMSC im Gegensatz zu anderen Studien auch auf frisch hergestellten Zementproben adhärieren, proliferieren und differenzieren können. Die Modifizierung des Basiszements mit Cocarboxylase führte hierbei zu einer gegenüber den anderen Modifikationen signifikant erhöhten Zelladhäsion und -vitalität. Neben den verschieden modifizierten Pulver/Flüssigkeitszementen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige ready-to-use Zementpasten untersucht. Diese zeigten allerdings im Vergleich zu den herkömmlichen Zementen eine geringere Proteinbindungsaffinität. HMSC, die auf den Pastenzementen kultiviert wurden, war es wiederum möglich zu adhärieren, zu proliferieren und den osteoblastenspezifischen Marker Alkalische Phosphatase zu exprimieren. Hinsichtlich ihrer Biokompatibilität sind sie damit vergleichbar zu den herkömmlichen Pulver/Flüssigkeitszementen.

Aus der Sicht von Klinikern – Orthopäden und Unfallchirurgen – besteht ein großer Bedarf an degra¬dierbaren Knochenersatzmaterialien für den osteoporotischen und den krebskranken Knochen. Fraktu¬ren am Oberschenkelhals oder auch der Wirbelsäule heilen bei diesen systemischen Erkrankungen gar nicht oder nur sehr langsam. Frakturen des gesunden Knochens heilen ins¬besondere bei älteren Patienten schwer, wenn große Defektbereiche vorhanden sind. Gilt bei einem ge¬sunden Patienten ein Defekt von etwa 1,5 – 2 cm als überkritisch und bedarf somit der Versorgung mit einem Knochen¬ersatz¬material, so kann bei einem älteren oder erkrankten Menschen bereits eine Spalt¬breite von mehr als 3 mm problematisch sein. Der Sonderforschungsbereich Transregio 79 mit dem Thema 'Werkstoffe für die Geweberegeneration im systemisch erkrankten Knochen' hat sich dieses Problems angenommen und will es ätiologiebasiert durch die Verbindung von Erkenntnissen und Charakterisierungs-methoden aus Werkstoffwissenschaft, Biologie und Medizin lösen. Die vorliegende Dissertation wurde im Rahmen dieses Vorhabens und in der Gruppe Biomimetische Materialien und Biomaterialanalytik des Instituts für Werkstoffwissenschaft, Professur Biomaterialien, der Technischen Universität Dresden erarbeitet. Sie beschäftigt sich vorrangig mit der Entwicklung von Knochenersatz¬material für den gesunden sowie den osteoporotischen Knochen. Der Arbeitshypothese folgend, dass die Defekt-/Frakturheilung im osteoporotischen Knochen durch Knochenersatzmaterial bestehend aus Calcium-/Strontiumphosphaten verbessert werden kann, soll die Ionenfreisetzung durch geeignete Kristallstrukturen gezielt eingestellt werden, um den Knochenwiederaufbau direkt über die Osteo¬blastenaktivität oder indirekt über die Cytokinausschüttung der Osteoklasten zu stimulieren. Für die Materialentwicklung sind eine hinreichende Kenntnisse über die Struktur und den Aufbau des Knochens, über die Mineralisation und die Zellbiologie des Knochens einschließlich des Immunsystems notwendig. Zu Beginn der Arbeit war es deshalb notwendig, diesen Kenntnisstand zur Mineralbildung im Knochen zu vertiefen. Eine intensive Zusammenarbeit mit Projekten innerhalb des Transregio 79, die sich der Strukturaufklärung und der Zellbiologie des Knochens widmen beziehungsweise die Tierexperimente durchführen, war daher erforderlich. Diese Verknüpfung erfordert eine tiefgehende Auseinandersetzung mit der Frakturheilung, um interdisziplinär erfolgreich wirken zu können. Im Verlauf der Materialentwicklung erwies es sich als vorteilhaft, auch im eigenen Labor Zellkultur¬untersuchungen durchzuführen. Sie ermöglichten eine schnellere Umsetzung von Erkenntnissen der Zell¬reaktion in die Materialkonzeption. Aus werkstoffwissenschaftlicher Sicht ist der Knochen ein durch die Evolution geprägtes und hinsicht¬lich seiner mechanischen und biologischen Eigenschaften herausragend aufgebautes Verbundmaterial, das aus organischen und anorganisch nichtmetallischen Komponenten besteht und hierarchisch strukturiert ist. Kollagen I und Hydroxylapatit sind seine Hauptbestandteile. Daneben gibt es aber eine Reihe von Calciumphosphatstrukturen und Spuren von Fremdionen sowie nichtkollagenen Proteinen, deren Wirkung im Zuge der Mineralisation bisher kaum verstanden wird. Die zeitliche Abfolge, die Vielzahl an beteiligten Komponenten und die zelluläre Steuerung ergeben eine umfangreiche Parametervielfalt, die sich zum Teil durch Kompensationsmechanismen einer definitiven Ursachen-Wirkungs-Beschreibung entziehen. Eine Auseinandersetzung mit dem Knochenaufbau ist jedoch essen¬tiell für die Orientierung am natürlichen Vorbild. Zudem bedarf es der Kenntnis des zellulären Verhal¬tens auf extrazelluläre Einflüsse, um die Biomaterialcharakterisierung und eine geeignete Material¬modifizierung zu vollziehen. Deshalb wird im Stand des Wissens im nachfolgenden Kapitel zunächst auf die Struktur und den Aufbau des Knochens eingegangen, ehe auf die Besonderheiten der Mineralisation Bezug genommen wird. Letztere erfolgt nicht nach dem Prinzip der klassischen Mineralisation. Stattdessen liegen im Knochen Nanokristallite vor, die mithilfe organischer Moleküle zu sogenannten mesoskopischen Partikeln zusammengeführt werden. Die Kristallisation wird auf diesem Weg unabhängiger von Ionenprodukten und kann ohne Änderungen von pH-Werten stattfinden. Eine Schlüs¬sel¬position bei dieser Mineralisation nehmen strukturdirigierende Moleküle ein. Es ist bisher unklar geblieben, welche strukturdirigierenden Moleküle in welcher Reihenfolge oder auch gemeinsam im Knochen wirken und welches Molekül den Mineralisationsprozess einleitet und wie es mit den Haupt-komponenten des Knochens in Wechselwirkung steht. Das Materialkonzept sah daher von Beginn an vor, knochennahe Komponenten wie Kollagen Typ I und Calciumphosphatphasen als Grund¬bestandteile für den Knochenersatz zu verwenden, aber auch das nicht¬kollagene Protein Osteocalcin beziehungs¬weise Asparaginsäure als dessen Modellsubstanz werden als mögliche strukturdirigierende Moleküle mit einbezogen. Aufbauend auf dem gegenwärtigen Stand des Wissens wurde auch Strontium als Fremdion, wegen seiner bekannten positiven Wirkung auf den osteoporotischen Knochen, mit in das Konzept eingebunden. Weil bei einer Einführung in die medizinische Praxis auch ökonomische Gesichtspunkte eine wichtige Rolle spielen, war es naheliegend, statt Tropokollagen und Kollagen¬fibrillen auch Gela¬tine als organische Hauptkomponente zu verwenden. Die Forschung an einem temporären Knochenersatz für die Behandlung überkritischer Defekte und Frakturen durch ein degradierbares Biomaterial erfordert die Anregung der Knochenneubildung und gegebenenfalls die Einbindung in den Remodellierungsprozess, was einerseits von der biologisch medizinischen Seite, andererseits aber von der Seite der Handhabbarkeit im operativen Einsatz zu beur¬teilen ist. Beiderseits sind werkstoffwissenschaftliche Untersuchungen und Beschreibungen der Struktur sowie des Gefüges und die Herstellung einer Beziehung zu den daraus resultierenden Eigenschaften erforderlich. Auf dieser Basis wird aus der Materialforschung der technisch anwendbare Werkstoff. Im Anschluss an den Stand des Wissens werden die Ergebnisse zur Knochenuntersuchung, ebenso wie die der verschiedenen Mineralisationsmethoden aufgeführt und jeweils in den darauffolgenden Kapiteln diskutiert, um die Weiterentwicklung der Biomaterialsynthese zu erläutern. Das daraus resultierende Materialkonzept wird ausführlich in vitro charakterisiert und die Materialauswahl für den ersten in vivo Einsatz im Rahmen des Transregio 79 im osteoporotischen Rattenmodell erörtert. Die abschließende Zusammenfassung führt die Teilerkenntnisse zusammen und ermöglicht einen Ausblick für die weitere Materialentwicklung auf der Basis biomimetisch mineralisierter organischer Makromoleküle.:Danksagung Eigenständigkeitserklärung Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Stand des Wissens 2.1 Biomineralisation und Selbstorganisation: Der Knochen 2.1.1 Organische Knochenbestandteile: Kollagen und Osteocalcin 2.1.2 Anorganik des Knochens 2.1.3 Hierarchischer Aufbau des Knochens 2.1.4 Knochenzellen und die Knochenremodellierung 2.1.5 Physiologische Bedeutung von Calcium und Strontium 2.2 Materialien und Werkstoffe für den Knochenersatz 2.2.1 Synthetische Calciumphosphate 2.2.2 In vitro Mineralisation von organischen Makromolekülen 2.2.3 Bioaktivität von Knochenersatzmaterialien 2.2.4 Natürliche Knochenersatzmaterialien 2.2.5 Artifizielle Knochenersatzmaterialien 2.3 Zusammenfassung 3 Materialien und Methoden 3.1 Dual-Membran-Migrationsmethode und Doppelmigrationsmethode 3.1.1 Kollagenaufreinigung 3.1.2 Resuspendierung und Fibrillogenese des Tropokollagens 3.1.3 Dual-Membran-Migrationsmethode 3.1.4 Doppelmigrationsmethode 3.2 Fällungsreaktion im Batch-Prozess 3.2.1 Mineralpräzipitation – Mineralisation und Reifung 3.2.2 Mineralverarbeitung zur Probekörperherstellung 3.3 Charakterisierung und Analysemethoden 3.3.1 Strukturanalytik 3.3.2 Morphologische Untersuchungen 3.3.3 Mechanische Charakterisierung 3.3.4 Glühverlust 3.3.5 Optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP OES) 3.3.6 Dichte und Porosität 3.3.7 Degradation in physiologische Lösungen: Bioaktivität, pH Wertmessung und Masseänderung 3.3.8 Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und humanen Monozyten 3.3.9 Biochemische Untersuchungsmethoden 3.4 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Analytik humanen Knochens 4.1.1 Transmissionselektronenmikroskopische Analyse 4.1.2 Hypothese der Kollagenmineralisation 4.2 Dual-Membran-Migrationsmethode: (Tropo-)Kollagen mit poly Asparaginsäure und Osteocalcin 4.2.1 Mineralisation von Kollagenscaffolds, suspendiertem fibrillärem Kollagen und Tropokollagen 4.2.2 Erkenntnisse aus der in vitro Mineralisation mittels DM3 4.3 Zusammenfassung zur Hypothese der in vivo Kollagenmineralisation mit in vitro Vergleich 4.4 Doppelmigrationsmethode: Mineralisation von Gelatine 4.4.1 Struktur der gebildeten Calciumphosphatphasen 4.4.2 Degradation der mineralisierten Gelatine 4.4.3 Untersuchung des Zellverhaltens in der Osteoblasten/Osteoklasten-Co-Kultivierung 4.4.4 Diskussion des ormoHAp-Aufbaus und der Einflussnahme auf die hMSC/Monozyten-Co-Kultur 4.5 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine durch Calciumphosphate 4.5.1 Kristallstruktur und Materialcharakterisierung 4.5.2 Analyse der mechanischen Eigenschaften, des Degradationsverhaltens und der Bioaktivität 4.5.3 In vitro Biokompatibilität von verpresstem gelatinemodifizierten Calciumphosphat 4.5.4 Zusammenfassung der Analytik des gelatinemodifizierten Calciumphosphats 4.6 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine in Gegenwart von Calcium- und Strontiumionen 4.6.1 Charakterisierung der gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphate 4.6.2 Probekörperherstellung 4.6.3 Eigenschaften des Biomaterials: Degradation und in vitro Biokompatibilität 4.6.4 Untersuchung der in vitro Biokompatibilität von gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphaten 4.6.5 Erste Resultate der in vivo Implantation im Femurdefekt osteoporotischer Ratten 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Quellenverzeichnis Anhang A1 Aufbereitungs- und Testchemikalien A2 Zellkulturmaterialien A3 Puffer und Lösungen A4 Technische Geräte, Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien Eigene Publikationen und Mitautorschaften / From the point of view of clinicians - orthopedists and trauma surgeons - there is a great need for degradable bone substitutes for osteoporotic and cancerous bone. Fractures of the femoral neck or even the spine do not heal at all or only very slowly in these systemic diseases. Fractures of healthy bone heal with difficulty, especially in older patients, if large defect areas are present. While a defect of about 1.5 - 2 cm in a healthy patient is considered supercritical and thus requires the use of bone substitute material, a gap width of more than 3 mm in an elderly or affected person can be problematic. The Collaborative Research Center Transregio 79 with the topic 'Materials for Tissue Regeneration within Systemically Altered Bone' has taken up this problem and aims to solve it in an etiology-based manner by combining findings and characterization methods from materials science, biology and medicine. This dissertation was written within the framework of this project and in the Biomimetic Materials and Biomaterial Analysis Group of the Institute of Materials Science, Chair of Biomaterials, at the Technical University of Dresden. It is primarily concerned with the development of bone substitute materials for healthy and osteoporotic bone. Following the working hypothesis that defect/fracture healing in osteoporotic bone can be improved by bone substitute material consisting of calcium/strontium phosphates, the ion release is to be specifically adjusted by suitable crystal structures in order to stimulate bone reconstruction directly via osteoblast activity or indirectly via cytokine release by osteoclasts. Sufficient knowledge of the structure and composition of bone, of mineralization and of the cell biology of bone, including the immune system, is necessary for material development. At the beginning of the work, it was therefore necessary to deepen this knowledge of mineral formation in bone. An intensive cooperation with projects within the Transregio 79, which are dedicated to the structural elucidation and the cell biology of bone or which perform animal experiments, was therefore necessary. This linkage requires an in-depth examination of fracture healing in order to be able to work successfully on an interdisciplinary basis. In the course of material development, it proved advantageous to also carry out cell culture investigations in our own laboratory. They enabled faster implementation of cell reaction findings in the material concept. From the point of view of materials science, bone is an evolutionary composite material with outstanding mechanical and biological properties, consisting of organic and inorganic non-metallic components with a hierarchical structure. Collagen I and hydroxyapatite are its main components. In addition, however, there are a number of calcium phosphate structures and traces of foreign ions as well as non-collagenous proteins, whose action in the course of mineralization is poorly understood so far. The temporal sequence, the multitude of components involved and the cellular control result in an extensive variety of parameters, some of which elude a definitive cause-effect description by compensatory mechanisms. However, a discussion of bone structure is essential for orientation to the natural model. In addition, knowledge of the cellular response to extracellular influences is required for biomaterial characterization and suitable material modification. The researched material concept is characterized in detail in vitro and the material selection for the first in vivo application within the Transregio 79 in the osteoporotic rat model is discussed. The final summary brings together the partial findings and provides an outlook for further material development based on biomimetically mineralized organic macromolecules.:Danksagung Eigenständigkeitserklärung Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Stand des Wissens 2.1 Biomineralisation und Selbstorganisation: Der Knochen 2.1.1 Organische Knochenbestandteile: Kollagen und Osteocalcin 2.1.2 Anorganik des Knochens 2.1.3 Hierarchischer Aufbau des Knochens 2.1.4 Knochenzellen und die Knochenremodellierung 2.1.5 Physiologische Bedeutung von Calcium und Strontium 2.2 Materialien und Werkstoffe für den Knochenersatz 2.2.1 Synthetische Calciumphosphate 2.2.2 In vitro Mineralisation von organischen Makromolekülen 2.2.3 Bioaktivität von Knochenersatzmaterialien 2.2.4 Natürliche Knochenersatzmaterialien 2.2.5 Artifizielle Knochenersatzmaterialien 2.3 Zusammenfassung 3 Materialien und Methoden 3.1 Dual-Membran-Migrationsmethode und Doppelmigrationsmethode 3.1.1 Kollagenaufreinigung 3.1.2 Resuspendierung und Fibrillogenese des Tropokollagens 3.1.3 Dual-Membran-Migrationsmethode 3.1.4 Doppelmigrationsmethode 3.2 Fällungsreaktion im Batch-Prozess 3.2.1 Mineralpräzipitation – Mineralisation und Reifung 3.2.2 Mineralverarbeitung zur Probekörperherstellung 3.3 Charakterisierung und Analysemethoden 3.3.1 Strukturanalytik 3.3.2 Morphologische Untersuchungen 3.3.3 Mechanische Charakterisierung 3.3.4 Glühverlust 3.3.5 Optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP OES) 3.3.6 Dichte und Porosität 3.3.7 Degradation in physiologische Lösungen: Bioaktivität, pH Wertmessung und Masseänderung 3.3.8 Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und humanen Monozyten 3.3.9 Biochemische Untersuchungsmethoden 3.4 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Analytik humanen Knochens 4.1.1 Transmissionselektronenmikroskopische Analyse 4.1.2 Hypothese der Kollagenmineralisation 4.2 Dual-Membran-Migrationsmethode: (Tropo-)Kollagen mit poly Asparaginsäure und Osteocalcin 4.2.1 Mineralisation von Kollagenscaffolds, suspendiertem fibrillärem Kollagen und Tropokollagen 4.2.2 Erkenntnisse aus der in vitro Mineralisation mittels DM3 4.3 Zusammenfassung zur Hypothese der in vivo Kollagenmineralisation mit in vitro Vergleich 4.4 Doppelmigrationsmethode: Mineralisation von Gelatine 4.4.1 Struktur der gebildeten Calciumphosphatphasen 4.4.2 Degradation der mineralisierten Gelatine 4.4.3 Untersuchung des Zellverhaltens in der Osteoblasten/Osteoklasten-Co-Kultivierung 4.4.4 Diskussion des ormoHAp-Aufbaus und der Einflussnahme auf die hMSC/Monozyten-Co-Kultur 4.5 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine durch Calciumphosphate 4.5.1 Kristallstruktur und Materialcharakterisierung 4.5.2 Analyse der mechanischen Eigenschaften, des Degradationsverhaltens und der Bioaktivität 4.5.3 In vitro Biokompatibilität von verpresstem gelatinemodifizierten Calciumphosphat 4.5.4 Zusammenfassung der Analytik des gelatinemodifizierten Calciumphosphats 4.6 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine in Gegenwart von Calcium- und Strontiumionen 4.6.1 Charakterisierung der gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphate 4.6.2 Probekörperherstellung 4.6.3 Eigenschaften des Biomaterials: Degradation und in vitro Biokompatibilität 4.6.4 Untersuchung der in vitro Biokompatibilität von gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphaten 4.6.5 Erste Resultate der in vivo Implantation im Femurdefekt osteoporotischer Ratten 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Quellenverzeichnis Anhang A1 Aufbereitungs- und Testchemikalien A2 Zellkulturmaterialien A3 Puffer und Lösungen A4 Technische Geräte, Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien Eigene Publikationen und Mitautorschaften

Ziel der vorliegenden Arbeit war die biologische Charakterisierung neuartiger nanostrukturierter und für die Knochenregeneration geeigneter Calciumphosphatzemente (CPC). Hierzu wurde ein aus α-Tricalciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, gefälltem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat bestehender CPC verwendet, der mit den Biomolekülen Cocarboxylase, Glucuronsäure, Weinsäure, Glucose-1-phosphat, Arginin, Lysin und Asparaginsäure-Natriumsalz modifiziert wurde. Ermittelt wurde dabei der Einfluss der Modifikationen auf die Proteinadsorption und die Biokompatibilität. In Vorversuchen wurden die Zementmodifikationen hinsichtlich ihrer Bindungskapazität für humane Serumproteine und für das knochenspezifische Protein Osteocalcin (OC) sowie hinsichtlich ihrer Eignung für die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen fötalen Osteoblasten (hFOB 1.19) und humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dabei erwiesen sich die Modifikationen mit Cocarboxylase, Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz als besonders günstig. Mit diesen „Favoriten“ erfolgte eine detailliertere Analyse der Adsorption humaner und boviner Serumproteine sowie der knochen-spezifischen Proteine Osteocalcin, BMP-2 und VEGF. Dabei führte sowohl der Zusatz von Cocarboxylase, als auch der von Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz zu einer erhöhten Adsorption von Serumproteinen. Die Bindungsaffinität des Basiszements gegenüber Osteocalcin, BMP-2 und VEGF konnte durch Funktionalisierung mit Arginin gesteigert werden. Während die Modifizierung mit Cocarboxylase nur die VEGF-Adsorption förderte, bewirkte der Zusatz von Asparaginsäure-Natriumsalz eine Erhöhung der Osteocalcin- und BMP-2-Adsorption. Bedingt durch die größere spezifische Oberfläche der noch nicht abgebundenen Zemente, war die Menge adsorbierter Proteine auf frisch hergestellten Zementproben im Vergleich zu abgebundenen und ausgehärteten Zementen signifikant höher. Die Eignung der ausgewählten Zementvarianten als Knochenersatzmaterialien wurde mithilfe humaner mesenchymaler Stammzellen zweier verschiedener Spender getestet. Bei Verwendung abgebundener und ausgehärteter Zemente waren die hMSC in der Lage, auf allen Modifikationen zu adhärieren, zu proliferieren und in die osteogene Richtung zu differenzieren. Eine vorherige Inkubation der Zementproben mit humanem Serum förderte dabei vor allem die Zelladhäsion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass hMSC im Gegensatz zu anderen Studien auch auf frisch hergestellten Zementproben adhärieren, proliferieren und differenzieren können. Die Modifizierung des Basiszements mit Cocarboxylase führte hierbei zu einer gegenüber den anderen Modifikationen signifikant erhöhten Zelladhäsion und -vitalität. Neben den verschieden modifizierten Pulver/Flüssigkeitszementen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige ready-to-use Zementpasten untersucht. Diese zeigten allerdings im Vergleich zu den herkömmlichen Zementen eine geringere Proteinbindungsaffinität. HMSC, die auf den Pastenzementen kultiviert wurden, war es wiederum möglich zu adhärieren, zu proliferieren und den osteoblastenspezifischen Marker Alkalische Phosphatase zu exprimieren. Hinsichtlich ihrer Biokompatibilität sind sie damit vergleichbar zu den herkömmlichen Pulver/Flüssigkeitszementen.

Mammals cannot re-form heavily damaged bones as in large fracture gaps, whereas zebrafish efficiently regenerate bones even after amputation of appendages. However, the source of osteoblasts that mediate appendage regeneration is controversial. Several studies in zebrafish have shown that osteoblasts are generated by dedifferentiation of existing osteoblasts at injured sites, but other observations suggest that de novo production of osteoblasts also occurs. In this study, we found from cell-lineage tracing and ablation experiments that a group of cells reserved in niches serves as osteoblast progenitor cells (OPCs) and has a significant role in fin ray regeneration. Besides regeneration, OPCs also supply osteoblasts for normal bone maintenance. We further showed that OPCs are derived from embryonic somites, as is the case with embryonic osteoblasts, and are replenished from mesenchymal precursors in adult zebrafish. Our findings reveal that reserved progenitors are a significant and complementary source of osteoblasts for zebrafish bone regeneration.

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