Immer mehr Berichte deuten darauf hin, dass nicht-kodierende RNAs an der Regulation des Immunsystems beteiligt sind. In dieser Arbeit wurden nicht-kodierende RNAs identifiziert, die durch zwei unterschiedliche immunologische Prozesse in zwei verschiedenen Zelltypen reguliert wurden. Zum einen wurde das Transkriptom von Multiplen Myelom-Zellen in Abhängigkeit von der Interleukin 6-Stimulation untersucht. Dabei wurden einige sehr lange, IL 6-regulierte macroRNAs identifiziert, die STAIRs (STAT3-induced RNAs). Bei den STAIRs handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle, kontinuierliche, nicht-kodierende macroRNAs, die im Zellkern angereichert sind. Einige STAIRs dienen eventuell zusätzlich oder ausschließlich als Primärtranskript für gespleißte, lange ncRNAs (lncRNAs), die weitere Funktionen in der Zelle ausüben können. Die STAIRs weisen eine große Bandbreite an Gewebsspezifität auf und bei den Untersuchungen in dieser Arbeit zeigten sich Hinweise, dass sie sich für verschiedene Krebserkrankungen als Biomarker eignen könnten. Die zweite Transkriptomanalyse wurde bei der Aktivierung naiver T Zellen durchgeführt. Dabei offenbarte sich, dass die Zellen bei diesem Prozess einen dramatischen Wechsel ihres Transkriptionsprogrammes vollziehen und eine Vielzahl nicht Protein-kodierender Gene reguliert werden. Es wurde die Regulation von ncRNAs, die bisher noch nicht im Zusammenhang mit T Zellen beschrieben wurden, beobachtet und erneut unbekannte, differentiell exprimierte Bereiche identifiziert. Im Anschluss wurde STAIR18, eine nicht-kodierende RNA, die durch die beiden untersuchten Signalwege reguliert wird, eingehender untersucht. Es zeigte sich, dass STAIR18 im menschlichen Genom dupliziert ist und beide Loci die gespleißte, lange ncRNA152 in diversen Varianten transkribieren. ncRNA152 ist hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert und befindet sich dort anscheinend in perinukleären Aggregaten. Die verschiedenen ncRNA152-Isoformen scheinen unter-schiedliche Funktionen auszuführen. Einerseits ist eine Wirkung als competing endogenous RNA wahrscheinlich. Eine weitere Aufgabe der ncRNA152 scheint darin zu bestehen, das STAT3-Primärtranskript zu stabilisieren oder dessen Prozessierung zu fördern.

Das Leben auf der Erde wird maßgeblich durch die Kraft der oxygenen Photosythese bestimmt, die Sonnen- in chemische Energie umwandelt. Cyanobakterien wie Prochloro- und Synechococcus zählen zu den wichtigsten primären Produzenten der Ozeane und werden zunehmend als Modelle für photosynthetische Organismen genutzt. Um die Regulationsmechanismen dieser Picocyanobakterien besser zu verstehen, wurde hier die Information von vier Genomen hochgradig verwandter aber dennoch ökologisch unterschiedlich angepasster mariner Stämme genutzt in einer Kombination aus computer-gestützten und experimentellen Untersuchungen. Sequenzsignale und RNA-kodierende Gene wurden als neuartige Regulationselemente identifiziert und entlang des phylogenetischen Gradienten verglichen. Mittels ''phylogenetic footprinting'' konnte ein minimales, konserviertes Set möglicher Transkriptionsfaktoren, deren Bindestellen und Regulons aufgedeckt werden. NtcA-, LexA- und ArsR-ähnliche Motive wurden ebenso gefunden wie neue regulatorische Elemente. Mit Hilfe von RACE Experimenten wurden einige der vorhergesagten Bindestellen Promotorregionen zugeordnet. Eine Suche nach konservierten Sekundärstrukturen detektierte mehrere nicht-kodierende RNAs, benannt Yfr für cYanobacterial Functional RNA. Eine vergleichende Analyse von Yfr7 innerhalb der cyanobakteriellen Linie ergab, dass diese RNA wahrscheinlich ein Homolog der E. coli 6S RNA ist. Zwei verschiedene Yfr7 Transkripte mit einem zirkadianen aber zeitversetzten Akkumulationsmuster lassen eine Verknüpfung ihrer Expression mit dem zirkadianen Rhythmus oder der Lichtintensität vermuten. Experimente in Synechocystis deckten einen neuartigen Regulationsmechanismus durch eine antisense RNA auf, welche die Menge der isiA mRNA kontrolliert und die Assemblierung von IsiA-Superkomplexen beeinflusst. Die funktionelle Zuordnung dieser neuen Elemente wird zu einem besseren Verständnis regulatorischer Netzwerke in marinen Cyanobakterien und darüber hinaus führen. / Life on Earth is driven by the power of oxygenic photosynthesis transforming solar into chemical energy. Cyanobacteria such as Prochlorococcus and Synechococcus belong to the most important primary producers within the oceans and increasingly serve as models for photosynthetic organisms. To better understand the regulatory mechanisms in these picocyanobacteria, here the information from four genomes of closely related and even so ecologically divergent marine strains was used in a combined computational and experimental approach. Sequence signals and RNA-coding genes as novel elements in the regulation of gene expression were identified and their distribution along the phylogenetic gradient compared. Phylogenetic footprinting revealed a minimal conserved set of putative transcription factors, their binding sites and regulons. Sites for NtcA, LexA and ArsR-like regulators were found as well as new cis elements. RACE experiments verified several of these predicted sites belonging to the promoter region. A search, focussing on conserved secondary structures, detected several non-coding RNAs named Yfr for cYanobacterial Functional RNA. A comparative analysis of Yfr7 structures, transcript types and accumulation throughout the cyanobacterial radiation indicated this RNA as the likely homologue of the E. coli 6S RNA. Two distinct Yfr7 transcripts with a circadian but time-shifted expression pattern suggested a coupling of their expression to the circadian rhythm or light intensity. Experiments in Synechocystis discovered a novel antisense RNA-mediated regulatory mechanism that controls isiA mRNA abundance and assembly of IsiA-photosystem I supercomplexes. Functional assignments of these new elements in the future will contribute to a deeper understanding of the regulatory network of marine cyanobacteria and promote new studies on bacterial ncRNAs.

Major progress has been made during the last twenty years towards a better understanding of the evolution of angiosperms. Early molecular-phylogenetic analyses revealed three major groups, with eudicots as well as monocots being monophyletic, arisen from a paraphyletic group of dicotyledonous angiosperms (= basal angiosperms). Consistently, numerous phylogenetic studies based on sequence data have recovered the eudicot-clade and increased confidence in its existence. Furthermore this clade, which contains about 75% of angiosperm species diversity, is characterized by the possession of tricolpate and tricolpate-derived pollen and has thus also been called the tricolpate clade. Based on molecular-phylogenetic investigations several lineages, such as Ranunculales, Proteales (= Proteaceae, Nelumbonaceae, Platanaceae), Sabiaceae, Buxaceae plus Didymelaceae, and Trochodendraceae plus Tetracentraceae were shown as belonging to a early-diverging grade (early-diverging or “basal” eudicots), while larger groups like asterids, Caryophyllales, rosids, Santalales, and Saxifragales were identified as being members of a highly supported core clade, the so called “core eudicots”. Nevertheless, phylogenetic relationships among several lineages of the eudicots remained difficult to resolve. This thesis is mainly concentrated on fully resolving the branching order among the different clades of the early-diverging eudicots as well as on clarifying phylogenetic and systematic conditions within several lineages, based on phylogenetic reconstructions using sequence data of rapidly-evolving and non-coding molecular regions, such as spacers and introns. Commonly, fast-evolving and non-coding DNA was used to infer relationships among species and genera, as practised in chapter 3, due to the assumption of being inapplicable caused by putative high levels of homoplasy through multiple substitutions and frequent microstructural changes resulting in non-alignability. However, during the last few years numerous molecular-phylogenetic studies were able to present well resolved angiosperm trees on the basis of rapidly-evolving and non-coding regions from the large single copy region of the chloroplast genome comparable to multi-gene analyses concerning topology and statistical support. Mutational dynamics in spacers and introns was revealed to follow complex patterns related to structural constraints like the introns secondary structure. Therefore extreme sequence variability was always confirmed to mutational hotspots that could be excluded from calculations. Moreover it became clear that combining these non-coding regions with the fast-evolving matK gene can lead to further resolved and statistical supported trees. Chapter 1 deals with the placement of Sabiales inside the early-diverging eudicot grade, while investigating mutational dynamics as well as the utility of different kinds of non-coding and rapidly-evolving DNA within deep-level phylogenetics. It was done by analyzing a combination of nine regions from the large single copy region of the chloroplast genome, including spacers, the sole group I intron, three group II introns and the coding matK for a sampling of 56 taxa. The presented topology is in mainly congruence with the hypothesis on phylogenetic relationships among early-branching eudicots that was gained through the application of a reduced set of five non-coding and fast-evolving molecular markers, including the plastid petD (petB-petD spacer, petD group II intron) plus the trnL-F (trnL group I intron, trnL-F spacer) region and the matK gene. It showed a grade of Ranunculales, Sabiales, Proteales, Trochodendrales and Buxales. The current study differs in showing Sabiales as sister to Proteales in all phylogenetic analyses, in contrast to a second-branching inside early-diverging eudicots and a Bayesian tree displaying Sabiales branching after Proteales. All three hypotheses were tested concerning their likelihood. None of them was shown as being significantly declinable. Thus, albeit the number of characters and informative sites was doubled in comparision to the five-region investigation, the exact position of the Sabiales remained to be resolved with confidence. However, the advanced analyses of the phylogenetic structure of the three different non-coding partitions in comparison to coding genes resulted in the recognition of a significantly higher mean phylogenetic signal per informative character within spacers and introns than in the frequently applied slowly-evolving rbcL gene. The fast-evolving and well performing matK gene is shown to be nested within the non-coding partitions in this respect. Interestingly, the least constrained spacers displayed considerably less phylogenetic structure than both, the group I intron and the group II introns. Molecular evolution is again shown to follow certain patterns in angiosperms, as indicated by the occurrence of mutational hotspots and their connection to structural and functional constraints. This is especially shown for the group II introns studied where highly dynamic sequence parts were rather found in loops than stems. The aim of chapter 2 was to present a comprehensive reconstruction of the phylogenetic relationships inside the order of Ranunculales, the first-branching clade of the early-diverging eudicots, with an emphasis on the evolution of growth forms within the group. Currently, the order comprises seven families (Ranunculaceae, Berberidaceae, Menispermaceae, Lardizabalaceae, Circaeasteraceae – not included due to lacking plant material, Eupteleaceae, Papaveraceae) containing predominantly herbaceous groups as well as trees and lianescent/shrubby forms. A surprising result that emerged due to the increased use of molecular data within systematics during the last twenty years is the inclusion of the woody Eupteleaceae into Ranunculales. Because of its adaptation to wind pollination it was previously placed next to Hamamelididea. Although phylogenetic hypotheses agreed in the exclusion of Eupteleaceae and the predominantly herbaceous Papaveraceae from a core clade the branching order within early-diverging Ranunculales remained a question to be answered. Thus phylogenetic reconstructions based on molecular data of 50 taxa (including outgroup), applying the well-performing non-coding petD and trnL-F as well as the trnK/matK-psbA region including the coding matK, were carried out. The comprehensive sampling resulted in fully resolved and highly supported phylogenies in both, maximum parsimony and model based approaches, with family relations within the core clade being identical and Euptelea appearing as first branching lineage. However, the relationships among the early-diverging Ranunculales could not be resolved with confidence, a result in line with the finding made in chapter 1. The topology was further resolved as Lardizabalaceae being sister to the remaining members of the order, followed by Menispermaceae, Berberidaceae and Ranunculaceae, the latter sharing a sistergroup relationship. Inside the mainly lianescent Lardizabalaceae the shrubby Decaisnea was clearly depicted as first-branching. The systematic controversial Glaucidium and Hydrastis are shown to be early-diverging members of the Ranunculaceae. A central goal of chapter 3 was to test phylogenetic relationships among the members of the ranunculaceous tribe Anemoneae. Currently it consists of the subtribes Anemoninae including Anemone, Hepatica, Pulsatilla and Knowltonia, and Clematidinae, consisting of Archiclematis, Clematis and Naravelia. Furthermore the position and taxonomic rank of several lineages inside the subtribe Anemoninae were examined. Since recent comprehensive molecular-phylogenetic investigations have been carried out for the members of Clematidinae or Anemoninae, 63 species representing all major lineages of the two subtribes were included into analyses. Calculations were carried out on the basis of molecular data of the nuclear ribosomal ITS1&2 and the plastid atpB-rbcL intergenic spacer region. Phylogenetic reconstructions resulted in the recognition of two distinct clades within the tribe, thus corroborating the formation of the two subtribes. Within the subtribe Anemoninae the traditional genera Knowltonia, Pulsatilla and Hepatica are confidently shown to be nested within the genus Anemone. The preliminary classification of the genus, currently consisting of the two subgenera Anemone and Anemonidium, is complemented by the subgenus Hepatica.

Eukaryotic cells exhibit an extensive transcriptional diversity. Only about a quarter of the total RNA in the human cell can be accounted for by messenger RNA (mRNA), which convey genetic code for protein generation. The remaining part of the transcriptome consists of rather heterogenous molecules. While some classes are well defined and have been shown to carry out distinct functions, ranging from housekeeping to complex regulatory tasks, a big fraction of the transcriptional output is categorized solely based on the lack of protein-coding capacity and transcript length. Several studies have shown, that as a group, mRNA-like long non-coding RNAs (lncRNAs), are under stabilizing selection, however at much weaker levels than mRNAs. The conservation at the level of primary sequence is even lower, blurring the contrast between exonic and intronics parts, which impedes traditional methods of genome-wide homology search. As a consequence their evolutionary history is a fairly unexplored field and apart from a few experimentally studied cases, the vast majority of them is reported to be poorly conserved. However, the pervasive transcription and the highly spatio-temporal specific expression patterns of lncRNAs suggests their functional importance and makes their evolutionary age and conservation patterns a topic of interest. By employing diverse computational methods, recent studies shed light on the common conservation of lncRNA’s secondary and gene structures, highlighting the significance of structural features on functionality. Splice sites, in particular, are frequently retained over very large evolutionary time scales, as they maintain the intron-exon-structure of the transcript. Consequently, the conservation of splice sites can be utilized in a comparative genomics approach to establish homology and predict evolutionarily well-conserved transcripts, regardless of their coding capacity. Since splice site conservation cannot be directly inferred from experimental evidence, in the course of this thesis a computational pipeline was established to generate comparative maps of splice sites based on multiple sequence alignments together with transcriptomics data. Scoring schemes for splice site motifs are employed to assess the conservation of orthologs. This resource can then be used to systemically study the conservation patterns of RNAs and their gene structures. This thesis will demonstrate the versatility of this method by showcasing biological applications of three distinct studies. First, a comprehensive annotation of the human transcriptome, from RefSeq, ESTs and GENCODE, was used to trace the evolution of human lncRNAs. A large majority of human lncRNAs is found to be conserved across Eutheria, and many hundreds originated before the divergence of marsupials and placental mammals. However, they exhibit a rapid turnover of their transcript structures, indicating that they are actual ancient components of the vertebrate genome with outstanding evolutionary plasticity. Additionally, a public web server was setup, which allows the user to retrieve sets of orthologous splice sites from pre-computed comparative splice site maps and inspect visualizations of their conservation in the respective species. Second, a more specific data set of non-colinearly spliced latimerian RNAs is studied to fathom the origins of atypical transcripts. RNA-seq data from two coelacanth species are analyzed, yielding thousands of circular and trans-spliced products, with a surprising exclusivity of the majority of their splice junctions to atypically spliced forms, that is they are not used in linear isoforms. The conservation analysis with comparative splice site maps yielded high conservation levels for both cir- cularizing and trans-connecting splice sites. This fact in combination with their abundance strongly suggests that atypical RNAs are evolutionarily old and of functional importance. Lastly, comparative splice site maps are used to investigate the role of lncRNAs in the evolution of the Alzheimer’s disease (AD). The human specificity of AD clearly points out a phylogenetic aspect of the disease, which makes the evolutionary analysis a very promising field of research. Protein- coding and non-protein-coding regions, that have been identified to be differentially expressed in AD patients, are analyzed for conservation of their splice site and evolution of their exon-intron-structure. Both non-coding and protein-coding AD-associated genes are shown to have evolved more rapidly in their gene structure than the genome at large. This supports the view of AD as a consequence of the recent rapid adaptive evolution of the human brain. This phylogenetic trait might have far reaching consequences with respect to the appropriateness of animal models and the development of disease-modifying strategies. / Eukaryotische Zellen legen eine umfangreiche transkriptionelle Vielfalt an den Tag. Nur etwa ein Viertel der in der menschlichen Zelle enthaltenen RNA ist messenger RNA (mRNA), welche den genetischen Code für die Proteingenerierung übermittelt. Der verbleibende Anteil des Transkriptoms besteht aus eher heterogenen Molekülen. Während einigen wohldefinierten Klassen spezifische Funktionen zugeordnet werden können, welche von Zellhaushalt bis zu komplexen regulatorischen Aufgaben reichen, wird ein großer Teil der transkriptionellen Produktion ausschließlich auf Grundlage der fehlenden Kodierungskapazität und der Transkriptlänge kategorisiert. Einige Studien zeigten, dass mRNA-ähnliche lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) als Gruppe unter stabilisierender Selektion stehen, wenn auch in einem weitaus geringeren Ausmaß als mRNAs. Die Konservierung auf Ebene der primären Sequenz ist sogar noch niedriger, wodurch der Kontrast zwischen exonischen und intronischen Elementen verschwimmt und Methoden der traditionellen Homologiesuche erschwert werden. Infolgedessen ist die evolutionäre Geschichte der lncRNAs ein recht unerforschtes Gebiet und abgesehen von ein paar vereinzelten Fallstudien wird die große Mehrheit als schwach konserviert vermeldet. Die tiefgreifende Transkription und die in Raum und Zeit hochspezifischen Expressionsmuster von lncRNA deuten jedoch auf deren funktionelle Bedeutung hin und machen ihr evolutionäres Alter und ihre Konservierungsmuster zu einem Thema von Interesse. Durch die Verwendung von computergestützten Methoden konnten jüngste Studien die verbreitete Konservierung von Sekundär- und Genstruktur von lncRNAs aufzeigen, was die Signifikanz von strukturellen Merkmalen in Bezug auf deren Funktionalität unterstreicht. Spleißstellen im besonderen werden oft über lange evolutionäre Zeitspannen erhalten, da sie die Intron-Exon-Struktur des Transkripts bewahren. Folglich, kann die Konservierung von Spleißstellen durch einen Ansatz der vergleichenden Genomik benutzt werden, um Homologie herzuleiten und evolutionär gut konservierte Transkripte unabhängig von deren Kodierungskapazität zu prognostizieren. Da es nicht möglich ist die Spleißstellenkonservierung direkt anhand von experimentellen Indikatoren abzulesen, wurde im Zuge dieser These eine computergestützte Methode entwickelt, welche, basierend auf multiplen Sequenzalignments und Transkriptomikdaten, “Vergleichskarten” von Spleißstellen erstellt. Ein Punktebewertungssystem für Spleißstellenmotive wird benutzt um die Konservierung der Orthologen zu beurteilen. Diese Resource kann anschließend verwendet werden um systematisch die Konservierungsmuster von RNAs und deren Genstrukturen zu untersuchen. Diese Arbeit wird die Vielseitigkeit dieser Methode demonstrieren, indem die biologische Anwendung in drei verschiedenen Studien präsentiert wird. Zuerst wird eine umfassende Annotation des menschlichen Transkriptoms, basierend auf RefSeq, EST und GENCODE, benutzt, um die Evolution von humanen lncRNAs nachzuvollziehen. Es konnte festgestellt werden, dass eine große Mehrheit der menschlichen lncRNAs innerhalb der Eutheria konserviert ist und mehrere hundert bereits vor der Auseinanderentwicklung von Beuteltieren und höheren Säugetieren entstanden. Dennoch zeigen sie eine rasante Veränderung in ihren Transkriptstrukturen, welche darauf hindeutet, dass sie tatsächlich alte Bestandteile von Vertebratengenomen mit bemerkenswerter evolutionärer Formbarkeit sind. Zusätzlich wurde ein öffentlicher Webserver aufgesetzt, der dem Nutzer ermöglicht Datensätze orthologer Spleißstellen aus vorgenerierten Vergleichskarten zu extrahieren und Visualisierungen der Konservierung in den jeweiligen Spezies zu betrachten. Als zweites wird ein spezifischerer Datensatz von nicht-linear gespleißten Latimeria-RNA untersucht um die Ursprünge untypischer Transkripte zu ergründen. Die Analyse der RNA-seq Daten zweier Exemplare des Quastenflossers ergab tausende zirkulärer und Transspleiß-Produkte, wobei die Mehrheit der Spleißverbindungen eine überraschende Exklusivität für untypisch gespleißte Formen aufzeigt, d.h. diese werden nicht für lineare Isoformen genutzt. Die Konservierungsanalyse mit Spleißstellen-Vergleichskarten ergibt hohe Konservierungsniveaus sowohl für zirkulärisierende als auch für trans-verbindende Spleißstellen. Diese Tatsache in Kombination mit ihrem häufigen Vorkommen, deutet stark darauf hin, dass untypische RNAs evolutionär alt und von funktioneller Bedeutung sind. Zuletzt werden Spleißstellen-Vergleichskarten benutzt um die Rolle von lncRNAs in der Evolution der Alzheimer-Krankheit (AK) zu untersuchen. Die Spezifität der AK auf den Menschen weist klar auf einen phylogenetischen Aspekt der Krankheit hin, was deren evolutionäre Analyse zu einem vielversprechenden Forschungsgebiet macht. Proteinkodierende und nicht-proteinkodierende Regionen, bei denen eine differentielle Expression in AK-Patienten erkannt wurde, werden auf die Konservierung ihrer Spleißstellen und Evolution ihrer Exon-Intron-Strukturen hin analysiert. Es kann nachgewiesen werden, dass sich die Genstruktur von sowohl nicht-kodierenden als auch von proteinkodierenden AK-assoziierten Genen schneller entwickelt als das Genom im Allgemeinen. Das unterstützt die Auffassung, dass AK die Folge einer kürzlichen rasanten adaptiven Evolution des menschlichen Gehirns ist. Diese phylogenetische Eigenschaft könnte weitreichende Konsequenzen in Bezug auf die Angemessenheit von Tiermodellen und die Entwicklung von krankheitsmodifizierenden Strategien haben.

Major progress has been made during the last twenty years towards a better understanding of the evolution of angiosperms. Early molecular-phylogenetic analyses revealed three major groups, with eudicots as well as monocots being monophyletic, arisen from a paraphyletic group of dicotyledonous angiosperms (= basal angiosperms). Consistently, numerous phylogenetic studies based on sequence data have recovered the eudicot-clade and increased confidence in its existence. Furthermore this clade, which contains about 75% of angiosperm species diversity, is characterized by the possession of tricolpate and tricolpate-derived pollen and has thus also been called the tricolpate clade. Based on molecular-phylogenetic investigations several lineages, such as Ranunculales, Proteales (= Proteaceae, Nelumbonaceae, Platanaceae), Sabiaceae, Buxaceae plus Didymelaceae, and Trochodendraceae plus Tetracentraceae were shown as belonging to a early-diverging grade (early-diverging or “basal” eudicots), while larger groups like asterids, Caryophyllales, rosids, Santalales, and Saxifragales were identified as being members of a highly supported core clade, the so called “core eudicots”. Nevertheless, phylogenetic relationships among several lineages of the eudicots remained difficult to resolve. This thesis is mainly concentrated on fully resolving the branching order among the different clades of the early-diverging eudicots as well as on clarifying phylogenetic and systematic conditions within several lineages, based on phylogenetic reconstructions using sequence data of rapidly-evolving and non-coding molecular regions, such as spacers and introns. Commonly, fast-evolving and non-coding DNA was used to infer relationships among species and genera, as practised in chapter 3, due to the assumption of being inapplicable caused by putative high levels of homoplasy through multiple substitutions and frequent microstructural changes resulting in non-alignability. However, during the last few years numerous molecular-phylogenetic studies were able to present well resolved angiosperm trees on the basis of rapidly-evolving and non-coding regions from the large single copy region of the chloroplast genome comparable to multi-gene analyses concerning topology and statistical support. Mutational dynamics in spacers and introns was revealed to follow complex patterns related to structural constraints like the introns secondary structure. Therefore extreme sequence variability was always confirmed to mutational hotspots that could be excluded from calculations. Moreover it became clear that combining these non-coding regions with the fast-evolving matK gene can lead to further resolved and statistical supported trees. Chapter 1 deals with the placement of Sabiales inside the early-diverging eudicot grade, while investigating mutational dynamics as well as the utility of different kinds of non-coding and rapidly-evolving DNA within deep-level phylogenetics. It was done by analyzing a combination of nine regions from the large single copy region of the chloroplast genome, including spacers, the sole group I intron, three group II introns and the coding matK for a sampling of 56 taxa. The presented topology is in mainly congruence with the hypothesis on phylogenetic relationships among early-branching eudicots that was gained through the application of a reduced set of five non-coding and fast-evolving molecular markers, including the plastid petD (petB-petD spacer, petD group II intron) plus the trnL-F (trnL group I intron, trnL-F spacer) region and the matK gene. It showed a grade of Ranunculales, Sabiales, Proteales, Trochodendrales and Buxales. The current study differs in showing Sabiales as sister to Proteales in all phylogenetic analyses, in contrast to a second-branching inside early-diverging eudicots and a Bayesian tree displaying Sabiales branching after Proteales. All three hypotheses were tested concerning their likelihood. None of them was shown as being significantly declinable. Thus, albeit the number of characters and informative sites was doubled in comparision to the five-region investigation, the exact position of the Sabiales remained to be resolved with confidence. However, the advanced analyses of the phylogenetic structure of the three different non-coding partitions in comparison to coding genes resulted in the recognition of a significantly higher mean phylogenetic signal per informative character within spacers and introns than in the frequently applied slowly-evolving rbcL gene. The fast-evolving and well performing matK gene is shown to be nested within the non-coding partitions in this respect. Interestingly, the least constrained spacers displayed considerably less phylogenetic structure than both, the group I intron and the group II introns. Molecular evolution is again shown to follow certain patterns in angiosperms, as indicated by the occurrence of mutational hotspots and their connection to structural and functional constraints. This is especially shown for the group II introns studied where highly dynamic sequence parts were rather found in loops than stems. The aim of chapter 2 was to present a comprehensive reconstruction of the phylogenetic relationships inside the order of Ranunculales, the first-branching clade of the early-diverging eudicots, with an emphasis on the evolution of growth forms within the group. Currently, the order comprises seven families (Ranunculaceae, Berberidaceae, Menispermaceae, Lardizabalaceae, Circaeasteraceae – not included due to lacking plant material, Eupteleaceae, Papaveraceae) containing predominantly herbaceous groups as well as trees and lianescent/shrubby forms. A surprising result that emerged due to the increased use of molecular data within systematics during the last twenty years is the inclusion of the woody Eupteleaceae into Ranunculales. Because of its adaptation to wind pollination it was previously placed next to Hamamelididea. Although phylogenetic hypotheses agreed in the exclusion of Eupteleaceae and the predominantly herbaceous Papaveraceae from a core clade the branching order within early-diverging Ranunculales remained a question to be answered. Thus phylogenetic reconstructions based on molecular data of 50 taxa (including outgroup), applying the well-performing non-coding petD and trnL-F as well as the trnK/matK-psbA region including the coding matK, were carried out. The comprehensive sampling resulted in fully resolved and highly supported phylogenies in both, maximum parsimony and model based approaches, with family relations within the core clade being identical and Euptelea appearing as first branching lineage. However, the relationships among the early-diverging Ranunculales could not be resolved with confidence, a result in line with the finding made in chapter 1. The topology was further resolved as Lardizabalaceae being sister to the remaining members of the order, followed by Menispermaceae, Berberidaceae and Ranunculaceae, the latter sharing a sistergroup relationship. Inside the mainly lianescent Lardizabalaceae the shrubby Decaisnea was clearly depicted as first-branching. The systematic controversial Glaucidium and Hydrastis are shown to be early-diverging members of the Ranunculaceae. A central goal of chapter 3 was to test phylogenetic relationships among the members of the ranunculaceous tribe Anemoneae. Currently it consists of the subtribes Anemoninae including Anemone, Hepatica, Pulsatilla and Knowltonia, and Clematidinae, consisting of Archiclematis, Clematis and Naravelia. Furthermore the position and taxonomic rank of several lineages inside the subtribe Anemoninae were examined. Since recent comprehensive molecular-phylogenetic investigations have been carried out for the members of Clematidinae or Anemoninae, 63 species representing all major lineages of the two subtribes were included into analyses. Calculations were carried out on the basis of molecular data of the nuclear ribosomal ITS1&2 and the plastid atpB-rbcL intergenic spacer region. Phylogenetic reconstructions resulted in the recognition of two distinct clades within the tribe, thus corroborating the formation of the two subtribes. Within the subtribe Anemoninae the traditional genera Knowltonia, Pulsatilla and Hepatica are confidently shown to be nested within the genus Anemone. The preliminary classification of the genus, currently consisting of the two subgenera Anemone and Anemonidium, is complemented by the subgenus Hepatica.

Immer mehr Berichte deuten darauf hin, dass nicht-kodierende RNAs an der Regulation des Immunsystems beteiligt sind. In dieser Arbeit wurden nicht-kodierende RNAs identifiziert, die durch zwei unterschiedliche immunologische Prozesse in zwei verschiedenen Zelltypen reguliert wurden. Zum einen wurde das Transkriptom von Multiplen Myelom-Zellen in Abhängigkeit von der Interleukin 6-Stimulation untersucht. Dabei wurden einige sehr lange, IL 6-regulierte macroRNAs identifiziert, die STAIRs (STAT3-induced RNAs). Bei den STAIRs handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle, kontinuierliche, nicht-kodierende macroRNAs, die im Zellkern angereichert sind. Einige STAIRs dienen eventuell zusätzlich oder ausschließlich als Primärtranskript für gespleißte, lange ncRNAs (lncRNAs), die weitere Funktionen in der Zelle ausüben können. Die STAIRs weisen eine große Bandbreite an Gewebsspezifität auf und bei den Untersuchungen in dieser Arbeit zeigten sich Hinweise, dass sie sich für verschiedene Krebserkrankungen als Biomarker eignen könnten. Die zweite Transkriptomanalyse wurde bei der Aktivierung naiver T Zellen durchgeführt. Dabei offenbarte sich, dass die Zellen bei diesem Prozess einen dramatischen Wechsel ihres Transkriptionsprogrammes vollziehen und eine Vielzahl nicht Protein-kodierender Gene reguliert werden. Es wurde die Regulation von ncRNAs, die bisher noch nicht im Zusammenhang mit T Zellen beschrieben wurden, beobachtet und erneut unbekannte, differentiell exprimierte Bereiche identifiziert. Im Anschluss wurde STAIR18, eine nicht-kodierende RNA, die durch die beiden untersuchten Signalwege reguliert wird, eingehender untersucht. Es zeigte sich, dass STAIR18 im menschlichen Genom dupliziert ist und beide Loci die gespleißte, lange ncRNA152 in diversen Varianten transkribieren. ncRNA152 ist hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert und befindet sich dort anscheinend in perinukleären Aggregaten. Die verschiedenen ncRNA152-Isoformen scheinen unter-schiedliche Funktionen auszuführen. Einerseits ist eine Wirkung als competing endogenous RNA wahrscheinlich. Eine weitere Aufgabe der ncRNA152 scheint darin zu bestehen, das STAT3-Primärtranskript zu stabilisieren oder dessen Prozessierung zu fördern.:1 Einleitung 1 1.1 Nicht-kodierende RNAs 1 1.1.1 Funktionen langer nicht-kodierender RNAs 2 1.1.2 Lange nicht-kodierende RNAs in Krebserkrankungen 4 1.2 Die Signaltransduktion von IL-6 und STAT3 5 1.2.1 Die IL-6/STAT3-Signalkaskade 5 1.2.2 Der Transkriptionsfaktor STAT3 7 1.2.3 Interleukin 6 und STAT3 in Krebserkrankungen 9 1.2.4 STAT3-regulierete nicht-kodierende RNAs 12 1.3 T-Zellen 13 1.3.1 T Zellaktivierung 14 1.3.2 Lange nicht-kodierende RNAs in T Zellen 16 1.4 Zielstellung 18 2 Material und Methoden 20 2.1 Bioinformatische Methoden 20 2.1.1 Evaluierung von Tiling Array-Daten 20 2.1.2 Evaluierung von Hochdurchsatz-Sequenzierungen 21 2.1.3 Auswertung von Mikroarray-Daten 21 2.1.4 DNA-Sequenzanalysen 22 2.1.5 Design von Oligonukleotiden 23 2.1.6 Statistische Auswertung 24 2.2 Molekularbiologische Methoden 25 2.2.1 Zellfraktionierung 25 2.2.2 Isolation von RNA 25 2.2.3 Reverse Transkription 26 2.2.4 Quantitative real-time PCR 27 2.2.5 Klonierung 29 2.3 Zellbiologische Methoden 36 2.3.1 Präparation primärer T-Helferzellen 36 2.3.2 Zellkultur und Stimulation eukaryontischer Zellen 38 2.3.3 Durchflusszytometrie 40 2.3.4 Transiente Transfektion eukaryontischer Zellen 42 2.3.5 Reportergenanalysen 44 2.3.6 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 45 2.3.7 Gewebe- und Patientenproben 48 3 Ergebnisse 50 3.1 Identifizierung und Charakterisierung neuer STAT3-regulierter ncRNA-Gene 50 3.1.1 Genomweite Untersuchung STAT3-regulierter ncRNAs 50 3.1.2 Validierung der IL-6-Tiling Array-Daten 65 3.1.3 Intrazelluläre Lokalisation der STAIRs 67 3.1.4 Expressionsprofile der STAIRs 68 3.2 Identifizierung regulierter ncRNA-Gene während der T Zellaktivierung 72 3.2.1 Etablierung der in vitro Aktivierung primärer T Zellen 72 3.2.2 Genomweite Untersuchung regulierter RNAs während der T-Zellaktivierung 74 3.2.3 Validierung der T-Zellaktivierungs-Genomdaten 83 3.3 Untersuchung der nicht-kodierenden RNA STAIR18 / ncRNA152 83 3.3.1 STAIR18 ist im humanen Genom dupliziert 84 3.3.2 Von beiden STAIR18-Loci werden gespleißte Transkripte generiert 86 3.3.3 Regulation der ncRNA152 90 3.3.4 Untersuchung des STAIR18/ncRNA152-Promotors 96 3.3.5 Intrazelluläre Lokalisation von STAIR18 und ncRNA152 101 3.3.6 Überexpression der ncRNA152 in XG-1-Zellen 106 3.3.7 Knockdown der ncRNA152 in XG-1-Zellen 107 3.3.8 Identifizierung putativer Zielgene der ncRNA152 109 4 Diskussion 111 4.1 IL 6/STAT3 regulierte macroRNAs 111 4.1.1 Charakterisierung der STAIRs 114 4.1.2 STAIRS als potentielle Biomarker 121 4.2 Regulation von lncRNAs während der T Zellaktivierung 122 4.3 Untersuchung von STAIR18/ncRNA152 128 4.3.1 Regulation von STAIR18 und der ncRNA152 129 4.3.2 Lokalisation von STAIR18 und der ncRNA152 130 4.3.3 Manipulation der ncRNA152-Expression 131 4.3.4 Bedeutung der ncRNA152 133 5 Zusammenfassung 135 6 Summary 138 7 Literaturverzeichnis 141 8 Anhang 153 Danksagung 168 Publikationen 16969 Selbstständigkeitserklärung 170

Die gegenwärtige Vorstellung von Genexpression in Plastiden leitet sich von der Analyse weniger, individueller Gene ab und ist deshalb noch relativ lückenhaft. In dieser Arbeit sollte daher differenzierende RNA Sequenzierung- eine neue Methode, die zwischen prozessierten und Primärtranskripten unterscheiden kann, verwendet werden, um ein vollständigeres Bild des Transkriptionsprozesses und der RNA Prozessierung von Hordeum vulgare L. (Gerste) Chloroplasten zu erhalten. Plastidengene in höheren Pflanzen können sowohl von einer plastidenkodierten, bakterienähnlichen RNA-Polymerase (PEP), als auch von einer kernkodierten, phagenähnlichen RNA-Polymerase (NEP), die beide unterschiedliche Promotoren erkennen, abgelesen werden. In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Transkriptionsstartstellen innerhalb des Plastidengenoms von grünen (reife Chloroplasten; Transkriptionsaktivität von PEP und NEP) und weißen Plastiden (Transkriptionsaktivität von NEP) der Gerstenmutantenlinie albostrians analysiert. Dies führte zu neuen Erkenntnissen bezüglich polymerasenspezifischer Genexpression in Plastiden. Auf Grundlage neuerer Arbeiten wird angenommen, daß nicht kodierende RNAs (ncRNAs) in Chloroplasten vorkommen. Die bisher verwendeten Methoden waren jedoch nicht geeignet, ncRNAs als Primärtranskripte zu identifizieren, die zumindest in Prokaryoten die häufigste Klasse von ncRNAs darstellen. In dieser Arbeit konnte durch dRNA-seq gezeigt werden, daß auch in Plastiden zahlreiche ncRNAs als Primärtranskripte generiert werden. Die wichtigsten Schritte im Prozess der mRNA Reifung in Plastiden sind 5´und 3´ Endformation und intercistronische Prozessierung. Vor Kurzem wurde gezeigt, daß ein PPR (Pentatricopeptide repeat) Protein zur Bildung der Ende von einigen prozessierten Plastiden mRNAs beiträgt, indem es als Hindernis für Exonukleasen wirkt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß dies ein genereller Mechanismus zur Bildung prozessierter mRNA-Enden in Chloroplasten ist. / The current view on plastid gene expression is mainly based on the analysis of a few individual genes, and thus it is lacking in comprehensiveness. Here, a novel differential RNA-seq approach, designed to discriminate between primary and processed transcripts, was used to obtain a deeper insight into the plastid transcription and RNA maturation of mature barley (Hordeum vulgare L.) chloroplasts. Transcription in plastids of higher plants is dependent on two different transcription machineries, a plastid-encoded bacterial-type RNA polymerase (PEP) and a nuclear-encoded phage-type RNA polymerase (NEP), which recognize distinct types of promoters. This study provided a thorough investigation into the distribution of transcription start sites within the plastid genome of green (mature chloroplasts; transcription by both PEP and NEP) and white (PEP-deficient plastids; transcription by NEP) plastids of the barley line albostrians. This analysis led to new insights on polymerase specific gene expression in plastids. Recent studies have suggested that non-coding RNAs (ncRNAs) are common in chloroplasts. However, they did not directly detect ncRNAs generated via transcription, the so far most abundant class of known regulatory ncRNAs in bacteria. Here, dRNA-seq analysis of the transcriptome of barley chloroplasts demonstrated the existence of numerous ncRNA generated via transcription of free-standing genes. Major events in plastid mRNA maturation include 5’ and 3’ processed end formation and intercistronic processing. Recently, a PPR (pentatricopeptide repeat) protein was shown to participate in the generation of several plastid mRNA processed ends by serving as a barrier to exonucleases. This study provided evidence for the global impact of this mechanism on processed termini formation in chloroplasts.