Früher bedeutete eine maligne hämatologische Erkrankung immer den sicheren Tod. Heutzutage haben viele Patienten mit einer entsprechenden Erkrankung eine realistische Chance auf ein Leben, dank der Stammzelltransplantation. Doch die Stammzelltransplantation birgt auch Risiken. Viele der Patienten kämpfen mit der Graft-versus-Host Erkrankung. Bei dieser Erkrankung erkennen die übertragenen Lymphozyten des Spenders das Gewebe des Empfängers als fremd und es kommt zur Abstoßung des transplantierten Organs bzw. zu Entzündungen und pathologischen Veränderungen an Haut, Leber und im Magen-Darm-Trakt. Die Spenderlymphozyten sind jedoch auch in der Lage, die noch verbliebenen malignen Tumorzellen des Empfängers zu erkennen und zu eliminieren. Dieser Effekt wird als Graft-versus-Leukämie Reaktion bezeichnet. Neben den Abstoßungsreaktionen spielen Infektionen nach einer Stammzelltransplantation eine große Rolle, da das Immunsystem supprimiert ist. Eine sehr häufige Infektionserkrankung bei stammzelltransplantierten Patienten ist die Cytomegalovirus Infektion. Die weltweite Durchseuchung bei gesunden Menschen liegt bei 40-90 %. Auch wenn die CMV Infektion bei den meisten immunkompetenten Menschen asymptomatisch verläuft, kann sie bei Patienten mit Immundefekten schwerwiegende Folgen haben. Neben den vielen negativen Folgen, die dieses Virus mit sich bringt, zeigen neuere Studien, dass stammzelltransplantierte Patienten mit einer Cytomegalovirus Reaktivierung eine längere Überlebenszeit, aufgrund der Senkung der Rezidivrate, haben. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt könnte eine virusinduzierte Graft-versus-Leukämie Reaktion sein, bei der die CMV-spezifischen Lymphozyten die Tumorantigene erkennen und eliminieren. In dieser Arbeit wurde die Kreuzreaktivität von den CMV IE-1 VLEETSVML spezifischen T-Zellen mit verschiedenen Tumor assoziierten Antigenen (PRAME, NY-ESO, bcl-2, Proteinase 3, MUC-1 und WT1) analysiert. Hierfür wurden gesunde, CMV seropositive Spender herangezogen, die IE-1 VLEETSVML T-Zellen hatten, und mit dem IE-1-A2 VLEETSVML Peptid expandiert werden konnten. Nach Anreicherung der spezifischen Lymphozyten über mehrere Wochen, erfolgte ein Funktionalitätstest, mit dem Nachweis von IFNγ und CD107a, als Zeichen der spezifischen Aktivierung der IE-1 VLEETSVML HLA-A*0201 T-Lymphozyten durch die Tumor assoziierten Antigene. Bei keinem der eingesetzten Tumor assoziierten Antigene fand eine Aktivierung des T-Zell-Rezeptors der CMV IE-1 spezifischen T-Lymphozyten statt. / The detection of a malignant hematologic disease was in former times a death sentence. Today, stem cell transplantation make such a disease treatable, with a real chance of survival. A major risk of stem cell transplantation is the graft-versus-host reaction. This reaction is specified by inflammation of the recipients tissue induced by donor lymphocytes. This may lead to rejection of the transplant or to pathologic changes in skin, liver or the gatrointestinal tract. However, the donor lymphocytes are capable to track and eliminate the remaining malignant tumor cells of the recipient. This is called graft-versus-leukemia reaction. The main problems after a stem cell transplantation are graft rejection, GvHD and infections. An increased rate of infections occur because of the suppression of hots immune system. A major cause of infection upon the group of stem cell transplanted patients is cytomegalovirus (CMV). The global infection rate in healthy subjects is between 40 and 90%. The infection is in the most immunocompetent humans asymptomatic, but in immunodeficient humans CMV may cause fatal complications. On the other hand new studies showed that stem cell transplanted patients with a cytomegalovirus reactivation have a longer survival, because of a reduced relapse rate. A possible explantation could be a virus inducted graft-versus-leukemia reaction: The CMV-specific lymphocytes recognize and eliminate the tumor antigens. In this thesis I tested the cross-reaction of CMV IE-1 VLEETSVML specific T-cells with different tumor associated antigens (PRAME, NY-ESO, bcl-2, proteinase 3, MUC-1 and WT-1). For this purpose healthy donors, which were CMV seropositive and have IE-1 VLEETSVML T-cells were analyzed. The IE-1 specific T-cells were expanded with the IE-1 VLEETSMVL HLA-A*0201 peptide. After enrichment, the T-cells, were analyzed for the presence of IFNγ and CD107a after stimulation with the relevant peptides. To none of the investigated tumor antigens an activation of the IE-1 VLEETSVML specific T-cells could be proved. In conclusion, crossreactivity at least of IE-1 VLEETSVML specific T-cells does not contribute to graft versus leukemia effect.

In dieser Promotionsarbeit wird der Quad-Color FluoroSpot (QCF) vorgestellt, welcher die Bestimmung der Frequenz von DENV-Serotyp-spezifischen und DENV- Serotyp-kreuzreaktiven B-Zellen auf Einzelzellbasis ermöglicht. Das vorgestellte Verfahren erlaubt die umfassende Analyse der spezifischen B-Zellantwort, so wie sie sich während einer primären oder sekundären DENV-Infektion bzw. nach einer Dengueimpfung entwickelt. Außerdem ermöglicht der QCF die Beurteilung, ob die DENV-Serotypspezifität bzw. -kreuzreaktivität von B-Zellen als Surrogatmarker für Immunschutz bei DENV-Infizierten bzw. in Studien, welche Dengueimpfstoff- kandidaten testen, relevant ist. Außerdem kann das Verfahren durch die Anpassung des verwendeten Antigens auch zur Beurteilung der B-Zellantwort, so wie sie sich nach einer Infektion mit anderen Erregern wie HIV oder Influenzavirus entwickelt, Anwendung finden. / Dengue is a major public health problem globally. It is caused by four antigenically distinct serotypes of dengue virus (DENV1-4), and although serotype-specific and strongly neutralizing cross-reactive immune responses against the four DENV serotypes are thought to be protective, subneutralizing Abs can contribute to increased disease severity upon secondary infection with a different DENV serotype. Understanding the breadth of the immune response in natural DENV infections and in vaccinees is crucial for determining the correlates of protection or disease severity. Transformation of B cell populations to generate mAbs and ELISPOT assays have been used to determine B cell and Ab specificity to DENV; however, both methods have technical limitations. We therefore modified the conventional ELISPOT to develop a Quad-Color FluoroSpot to provide a means of examining B cell/Ab serotype specificity and cross-reactivity on a single-cell basis. Abs secreted by B cells are captured by an Fc-specific Ab on a filter plate. Subsequently, standardized concentrations of all four DENV serotypes are added to allow equal stoichiometry for Ag binding. After washing, the spots, representing individual B cells, are visualized using four fluorescently labeled DENV serotype-specific detection mAbs. This method can be used to better understand the breadth and magnitude of B cell responses following primary and secondary DENV infection or vaccination and their role as immune correlates of protection from subsequent DENV infections. Furthermore, the Quad-Color FluoroSpot assay can be applied to other diseases caused by multiple pathogen serotypes in which determining the serotype or subtype-specific B cell response is important.

Immunoassays basieren auf der Anwendung von Antikörpern, welche selektiv den zu messenden Analyten binden. Die Richtigkeit der erhaltenen Ergebnisse hängt maßgeblich von der Selektivität der Antikörper ab und kann durch Interferenzen gestört werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der die Probe mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (LC) in Fraktionen aufgetrennt wird und diese Fraktionen anschließend mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) vermessen werden. Dieses Verfahren wurde als LC-ELISA bezeichnet. Das erhaltene Profil aus im ELISA gemessener Analytkonzentration in Abhängigkeit von der Elutionszeit wurde als LC-ELISAgramm bezeichnet und bietet die Möglichkeit, Interferenzen zu erkennen, welche beim ELISA unentdeckt bleiben. Als Modellanalyten für die zu untersuchenden ELISAs dienten Sulfamethoxazol (SMX), Carbamazepin (CBZ) und Estron (E1). Dabei wurden verschiedene Umweltmatrices wie Oberflächenwasser und Abwässer mit dem jeweiligen ELISA vermessen. Es wurde ein Ansatz zur Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Interferenzen in Umweltproben aufgezeigt. Durch diesen Ansatz und Anwendung der sauren Hydrolyse der Probe war es möglich, einen bisher unbekannten SMX-Metaboliten zu detektieren und dessen wahrscheinliche Kreuzreaktivität mit 460 ± 150 % abzuschätzen. Es wurde zudem ein neuer Tracer in einer linearen 13-Stufen-Synthese entwickelt, wobei neuartig die Konjugation der Peroxidase an der N1-Position des SMX erfolgte. / Immunoassays are based on the use of antibodies that selectively bind the analyte. The trueness of the results obtained depends to a great extent on the selectivity of the antibodies and can be affected by interferences. In this study, a method was developed in which the sample is separated into fractions by using high-performance liquid chromatography (LC) and these fractions are measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This method was referred to as LC-ELISA. The profile obtained from the measured analyte concentration by ELISA as a function of the elution time was referred to as LC-ELISAgram and offers the possibility to detect interferences which otherwise remain undetected during the ELISA. Sulfamethoxazole (SMX), carbamazepine (CBZ) and estrone (E1) were used as model analytes for the ELISA and LC-ELISA measurements. Various environmental matrices such as surface water and wastewater were examined for their interference in the respective ELISA. The good quantification properties of the validated LC-ELISA have been used to demonstrate an approach to distinguish between specific and non-specific interferences from environmental samples. By this approach and application of acidic hydrolysis of the sample, it was possible to detect a previously unknown metabolite of SMX and estimate its cross-reactivity to probably 460 ± 150%. Furthermore, a new tracer was developed in a linear 13-step synthesis, which resulted in the novel conjugation of the peroxidase at the N1-position of SMX. The new hapten was also used for the synthesis of a novel immunogen.

Klinische, epidemiologische und experimentelle Daten deuten darauf hin, dass Autoimmunkrankheiten wie z.B. rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose oder Typ I Diabetes durch Infektionen ausgelöst oder verschlimmert werden können. Bis heute ist jedoch nicht bekannt, welche molekularen und zellulären Mechanismen den Zusammenhang zwischen Infektion und Autoimmunität vermitteln. Eine Hypothese, die diesen Zusammenhang zu erklären versucht, ist die Hypothese der molekularen Mimikry. Dieser Hypothese zufolge sind kreuzreaktive Lymphozyten, die sowohl Selbst- als auch Fremdantigene erkennen, für die Induktion von Autoimmunität verantwortlich. Die Hypothese der molekularen Mimikry erklärt die Kreuzreaktivität von Lymphozyten durch Sequenzhomologie oder Identität von Selbst- und Fremdantigenen. Wir haben diese Hypothese an zwei Modellen, der chronischen Lyme Arthritis und einem Maus Modell der multiplen Sklerose, getestet und dabei festgestellt, dass Kreuzreaktivität von Lymphozyten weitaus häufiger ist als bis vor kurzem noch vermutet wurde. Wir konnten weiterhin zeigen, dass nicht die Primärstruktur sondern definierbare strukturelle Motive die Ursache für die Kreuzerkennung von Selbst- und Fremdpeptiden sind, und das Kreuzreaktivität in den seltensten Fällen von pathogenetischer Relevanz ist. Die Vorstellung, immunologische Kreuzreaktivität zwischen einem definierten mikrobiellen Antigen und einem definierten Selbstantigen sei für die Pathogenese von Autoimmunkrankheiten verantwortlich, ist also zu einfach. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit ist die immunologische Analyse eines von uns charakterisierten Th2-spezifisch exprimierten Moleküls, T1/ST2. Wir konnten zeigen, dass T1/ST2 auf Th2, nicht jedoch Th1-Zellen exprimiert wird; dass die Expression von T1/ST2 ex vivo die Lokalisation aktueller Th2-Antworten widerspiegelt; und dass T1/ST2 von funktioneller Bedeutung für die Th2 Zellen ist: Kreuzvernetzung des T1/ST2 Moleküls durch einen T1/ST2-spezifischen monoklonalen Antikörper induziert Proliferation und die Produktion von Typ 2 Zytokinen. In vivo läßt sich durch Applikation des löslichen Antikörpers gegen T1/ST2 die pathogene Th2-Immunantwort im Mausmodell von Asthma modulieren. T1/ST2 ist also ein Kandidat für die gezielte immunmodulatorische Therapie Th2-dominierter Erkrankungen wie Asthma und Allergie. / Clinical, epidemiological, and experimental data suggest that infections can sometimes trigger or exacerbate autoimmune diseases such as multiple sclerosis, type I diabetes, or rheumatoid arthritis. To date, the molecular and cellular mechanisms leading from infection to autoimmunity have not been defined. The molecular mimicry hypothesis proposes that crossreactive lymphocytes that recognize both self- and microbial antigens are key factors in the pathogenesis of autoimmunity. According to the molecular mimicry hypothesis, sequence identity or marked sequence similarity between self- and microbial antigens is the cause of such crossreactivity. We have examined the molecular mimicry hypothesis systematically in two different models: treatment-resistant Lyme arthritis and experimental autoimmune encephalitis (EAE). The major findings were: i) crossreactivity at the level of peptide recognition by T cells is far more frequent than previously expected; ii) structural criteria rather than sequence similarity determine cross-recognition; iii) immunoregulatory mechanisms normally prevent pathogenic effects mediated by crossreactive lymphocytes. Thus, the idea that crossrecognition of a defined microbial peptide and a particular self-peptide would explain autoimmunity is most likely too simple. The other major topic of this work was the immunological analysis of T1/ST2, a Th2-specific molecule that we characterized. Here, we could show that T1/ST2 is expressed on Th2 but not Th1 cells. Furthermore, T1/ST2 expression can be used to identify sites of ongoing Th2 reactions directly ex vivo. Most importantly, T1/ST2 is important for Th2 effector functions: crosslinking of T1/ST2 via a T1/ST2-specific monoclonal antibody induces proliferation and type 2-cytokine production. In vivo, administration of the soluble antibody against T1/ST2 ameliorates the immunological parameters of bronchial hyperreactivity in a murine model of asthma. Thus, T1/ST2 is a candidate target for therapeutic immunomodulation of diseases such as allergy and asthma.

In der Arbeit wurde die Rolle von Bakterien für das Entstehen von Autoimmunität untersucht. Insbesondere wurde untersucht, inwieweit Bakterien entweder spezifisch (über "Kreuzreaktivität") oder antigenunabhängig (über "Bystander-Aktivierung") eine Aktivierung von autoreaktiven CD4+- T-Zellen induzieren können. Es konnte gezeigt werden, dass es bei dem untersuchten, MBP-spezifischen T-Zellrezeptor multiple, natürlich vorkommende, kreuzreaktive Peptide mikrobiellen Ursprungs gibt, die eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen und in vivo experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) induzieren können. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit Lipopolysaccharid (LPS) als unspezifischer Aktivator des Immunsystems eine Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen in vitro hervorrufen kann und inwieweit in vivo EAE durch LPS hervorgerufen werden kann. Es wurde gezeigt, dass LPS in vitro einen kleinen Anteil der CD4+ - T-Zellen aktiviert. Wurden den transgenen T+alpha- -Mäusen LPS appliziert, erkrankten diese an EAE. Somit gibt es sowohl in vitro als auch in vivo in den T+alpha- -Mäusen Hinweise für eine Relevanz von "Bystander-Aktivierung". Abschließend wurde diskutiert, inwieweit entweder "Kreuzreaktivität" oder "Bystander-Aktivierung" als Auslöser für Autoimmunität unter physiologischen Bedingungen in Frage kommt. Aufgrund der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse wurde postuliert, dass keine der beiden Mechanismen alleiniger Auslöser sei, da es aufgrund der Häufigkeit von Infektionen, kreuzreaktiven Peptiden und des Vorkommens von autoreaktiven T-Zellen auch in gesunden Individuen ansonsten sehr viel häufiger zu Autoimmunität kommen müsste. Unter bestimmten Bedingungen könnte die Aktivierung von T-Zellen über Kreuzreaktivität oder über "Bystander-Aktivierung" Autoimmunität auslösen oder verstärken, wenn bereits andere Mechanismen des Immubnsystems, die Autoimmunität verhindern, versagt haben. / In this thesis the role of bacteria for the induction of autoimmunity was investigated. In detail, it was examined whether bacteria are able to activate autoreactive CD4+-T-cells antigen-specific ("cross-reactivity") or antigen-unspecific ("bystander-activation"). It was shown that the examined transgenic MBP-peptide specific T-cell-receptor recognized many natural occurring cross-reactive peptides of microbial origin, which induced an activation of the T-cells in vitro and which could induce autoimmune encephalomyelitis (EAE) in the T-cell-receptor transgenic mice in vivo. Furthermore, it was examined, whether lipopolysaccharide (LPS) as activator of the innate immune system could induce an unspecific activation of the autoreactive T-cells in vitro and whether administration of LPS in the transgenic mice could induce EAE in vivo. It was shown that LPS activates a small percentage of CD4+ - T-cells. Application of LPS to the transgenic T+alpha- mice induced EAE. Therefore, the role of bystander-activation was indicated in vitro and in vivo. Finally, it was discussed, whether either cross-reactivity or bystander-activation could be sufficient for inducing autoimmunity under physiologic conditions. Due to the results presented in this work, it is postulated that none of the both mechanisms could be inductor of autoimmunity alone. If one of these mechanisms was sufficient, autoimmunity in humans should be a frequent event, because infections and autoreactive T cells are both findings which occur in healthy humans very often. However, under certain conditions either cross-reactivity or bystander-activation could trigger or exacerbate autoimmunity, when other mechanisms which inhibit autoimmunity have failed.

Ein kompetitiver ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) für den Nachweis von Carbamazepin (CBZ) mit einer Bestimmungsgrenze von ca. 30 ng/L wurde entwickelt und validiert. Dieser in Gewässern häufig auftretende anthropogene Marker wurde anschließend in einer Vielzahl an Proben aus Abwässern, Oberflächengewässern und Trinkwässern nachgewiesen. Der ELISA zeigte eine exzellente Präzision und erbrachte in allen Matrizes geringfügig höhere Analysenergebnisse als die Referenzmethode HPLC-MS/MS. Die beständige Überbestimmung der CBZ-Konzentration in Höhe von ca. 7 % konnte auf die Präsenz von Cetirizin und geringen Mengen des persistenten Metaboliten 10,11 Epoxy¬carbamazepin (EP-CBZ) zurückgeführt werden. Die Bindungseigenschaften des verwendeten Antikörpers wurden anhand der Kreuz¬reaktivi¬täten von 37 Substanzen eingehend untersucht. Nach Kopplung von Flüssig¬chromato¬graphie und ELISA konnte das strukturell nicht mit CBZ verwandte Anti¬histaminikum Cetirizin als Kreuzreaktand identifiziert werden. Der störende Einfluss dieses Kreuz¬reaktanden auf den CBZ-ELISA konnte nach einer Änderung des pH-Wertes im Proben¬puffer minimiert werden. Die pH-abhängige Selektivitätssteuerung ermöglichte überdies die Entwicklung eines Dual-Analyt-Immunoassays für die parallele Bestimmung von CBZ und Cetirizin. Darüber hinaus wurden die Metaboliten EP-CBZ, DiOH-CBZ, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ und 10 OH-CBZ in Abwasser, Oberflächenwasser und Trinkwasser quantifiziert. DiOH-CBZ erwies sich als ähnlich persistent wie CBZ und wurde in besonders hohen Konzentrationen gefunden. Außerdem wurden mehrere weitere bislang nicht identifizierte Abbauprodukte von CBZ gefunden. Da weder Probenvorbereitung noch Probenanreicherung erforderlich sind, ist der Test schnell und kostengünstig durchführbar. Die für den Test nötigen Probenvolumen sind mit weniger als 1 mL sehr gering. Diese Eigenschaften erlauben ein Hochdurchsatzscreening und machen die Methode interessant für den Einsatz im Gewässermonitoring. / A competitive ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for the quantitation of carbamazepine (CBZ) was developed and validated. A limit of quantitation (LOQ) of ca. 30 ng/L allowed for the quantitation of CBZ in many samples from wastewater, surface water and drinking water. The method was found to be excellently precise, but it displayed slightly higher results than obtained by the reference method liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The nearly constant overestimation of 7 % could be attributed to the presence of small amounts of cetirizine and the persistent metabolite 10,11 epoxy¬carbamazepine (EP-CBZ). The binding properties of the antibody were studied by determining the cross-reactivities of 37 compounds. Hyphenating liquid chromatography to ELISA led to the discovery of the cross-reactive antihistamine cetirizine that shares no obvious structural similarity with CBZ. The bias caused by cetirizine was eliminated by changing the pH value of the sample buffer. Moreover, the antibody’s pH-dependent selectivity enabled a dual-analyte immunoassay for the parallel determination of CBZ and cetirizine. Furthermore, the metabolites EP-CBZ, DiOH-CBZ, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ and 10-OH-CBZ were quantified in wastewater, surface water and drinking water. DiOH-CBZ showed the highest concentrations of all analaytes investigated and was found to be equally persistent as CBZ. In addition, several further degradation products of CBZ were found that could not be identified. The ELISA allowed the detection of diurnal and seasonal fluctuations of analyte concentrations in wastewater and surface water. The anthropogenic marker CBZ enabled to trace wastewater from the source to the receiving waters. Since neither sample pretreatment nor enrichment is necessary, the method is very fast and cost-effective. Only a small sample volume (less than 1 mL) is needed making this ELISA an appropriate high-throughput screening tool for environmental monitoring.