Les récepteurs de type B de l'endothéline (ETB) sont présents sur l'enveloppe nucléaire des cardiomyocytes ventriculaires adultes (MVCAs). Il a été démontré que dans les MVCAs et les cellules endothéliales de rat, l’endocytose de l’endothéline marqué à la rhodamine colocalise avec le Lysotracker, un marqueur des lysosomes, mais n'est pas observée sur l’enveloppe nucléaire. Dans cette étude, nous avons caractérisé la localisation subcellulaire et la régulation de la biosynthèse de l’endothéline 1 dans les MVCAs et les fibroblastes cardiaques adultes de rat. Dans les deux types cellulaires les expériences d’immunocytofluorescence ont révélé une immunoréactivité de l’endothéline 1 correspondant à tous les stades de maturation du peptide, et détectable sur ou à proximité de la membrane nucléaire. L'enzyme de conversion d'endothéline 1(ECE1) est une métalloprotéase qui convertit la ̏ big˝ endothéline 1 en un peptide de 21 acides aminés biologiquement actif. L’immunoréactivité de l’ECE1 a été associée avec les tubules-T et les membranes nucléaires ou périnucléaires dans les MVCAs. Par contre, nous avons observé une immunoréactivité de l’ECE1 à la fois dans le noyau et le cytoplasme, mais pas sur la membrane plasmatique, dans les fibroblastes cardiaques à passage 3. L'ARNm de l’ET-1 a été détecté dans les deux types cellulaires. La régulation de la production de l'endothéline est principalement transcriptionnelle. L’application du facteur de croissance transformant ß1 (TGFß1) a augmenté l’ARNm de l’ET-1 dans les MVCAs et l'angiotensine II a stimulé l'augmentation de l’ARNm de l'ET-1 dans les fibroblastes. Dans les MVCAs, l'augmentation de l'ARNm ET-1 a été associée à une élévation du peptide intracellulaire ET-1 et du calcium nucléaire. Ces données suggèrent que l'endothéline endogène est disponible et serait capable d’activer le récepteur ETB nucléaire dans les MVCAs en réponse à des stimuli extracellulaires. / Type B endothelin receptors (ETB) are located in the nuclear envelope of adult ventricular cardiomyocytes (ACVMs). In both ACVMs and endothelial cells, endocytosed rhodamine endothelin colocalized with Lysotracker but was not observed at the nuclear membrane. In this study we have characterized the regulation and subcellular localization of endothelin biosynthesis in ACVMs and adult cardiac fibroblasts. In both cell types immunocytofluorescence experiments revealed endothelin-1 immunoreactivity, comprising all stages of peptide maturation, either on or near the nuclear membrane. Endothelin converting enzyme 1 (ECE1) is a metalloprotease that converts big endothelin to the biologically active 21-amino acid peptide. ECE1 immunoreactivity was associated with the T-tubules and nuclear or perinuclear membranes in ACVMs. In contrast, ECE1 immunoreactivity was observed both in the nucleus and the cytosol, but not at the plasma membrane, in passage 3 cardiac fibroblasts. Endothelin-1 mRNA was detected in both cell types. Regulation of endothelin production is primarily at the level of transcription. Application of TGFβ1 increased ET-1 mRNA in ACVMs whereas angiotensin II was effective in increasing ET-1 mRNA in fibroblasts. In AVCMs, the increase in ET-1 mRNA was associated with an increase of intracellular ET-1 peptide and nuclear calcium. These data suggest that endogenous endothelin is available and may activate nuclear ETB in ACVMs in response to extracellular stimuli.

Les inhibiteurs mixtes de l'ECE et de l'ECA constituent une classe thérapeutique originale qui intervient dans la régulation de l'hémodynamique, en bloquant en amont la production de puissants vasoconstricteurs tels que l'angiotensine II et l'endothéline-1. Ces deux peptides sont générés, respectivement, grâce à l'enzyme de conversion de l'angiotensine II et de l'endothéline-1. En inhibant leur action, les agents thérapeutiques mixtes récents (1970) prennent ainsi une part importante dans le traitement de l'hypertension. Le premier type d'inhibiteurs porte un groupement phosphoré qui se lie au zinc présent dans le site actif de l'enzyme. Ces composés peptidiques, qui possèdent une certaine stéréochimie, ont été synthétisés via des réactions de substitution, de couplage peptidique et d'hydrogénolyse. Les premiers résultats pharmacologiques montrent que seule une activité vis à vis de l'enzyme de conversion de l'angiotensine est décelée. La seconde partie de ce travail présente la synthèse de dérivés cycliques, constitués de cinq ou six chaînons, et qui assurent une chélation au zinc grâce aux groupements carbonyles. Ces molécules sont obtenues en fonctionnalisant l'acide barbiturique ainsi que l'hydantoïne. Grâce à des réactions d'acylation et d'alkylation notamment, un premier composé final a pu être généré mais son inhibition, testée sur l'ECA, est encore faible et nécessite des modulations pour converger vers une activité mixte.

La cholestase intrahépatique est une manifestation fréquente des lésions hépatiques induites par les médicaments; Cependant, les mécanismes impliqués sont peu connus. Nous avons cherché à étudier les mécanismes de la cholestase induite par les médicaments afin d’améliorer sa détection précoce en utilisant les cellules HepaRG humaines. Tout d'abord, nous avons prouvé que les canalicules biliaires (BC) subissaient des contractions spontanées, essentielles pour l'efflux d’acides biliaires et nécessitaient des séries d’alternance dans la phosphorylation/déphosphorylation de la chaîne légère de myosine (MLC2). La courte exposition à des composés cholestatiques a révélé que la modulation des BC était associée à des perturbations de la voie de signalisation ROCK/MLCK. Afin de confirmer notre étude, 12 médicaments cholestatiques et six non cholestatiques ont été analysés et nous avons démontré que tous les médicaments cholestatiques classés sur la base de résultats cliniques provoquaient des perturbations dans la dynamique des BC (dilatation ou constriction), et altéraient la voie de signalisation ROCK/MLCK, tandis que les composés non cholestatiques n'avaient pas d'effet. Nous avons également prouvé que ces changements étaient plus spécifiques que la mesure de l'inhibition de l’efflux comme marqueurs prédictifs non cliniques de la cholestase induite par les médicaments. Afin de confirmer et d’étendre ces conclusions, nous avons analysé les mécanismes impliqués dans les effets cytotoxiques et cholestatiques induits par 4 médicaments de la famille des antagonistes des récepteurs de l'endothéline: deux ayant un lien avec des cas cliniques d'hépatotoxicité (sitaxentan) et/ou cholestase (bosentan), et deux n’ayant pas été impliqués dans l’élévation de transaminases hépatiques ou de bilirubine (ambrisentan et macitentan). Les résultats montrent que le macitentan récemment commercialisé et ayant une structure chimique similaire à celle du bosentan, était capable de causer, comme ce dernier, des altérations in vitro des BC. En revanche, l'ambrisentan n’était pas hépatotoxique et le sitaxentan qui a été retiré du marché pour des cas d’hépatotoxicité, n’affectait pas la dynamique canaliculaire. / Intrahepatic cholestasis represents a frequent manifestation of drug-induced liver injuries; however, the mechanisms involved in such injuries are poorly understood. We aimed to investigate mechanisms underlying drug-induced cholestasis and improve its early detection using human HepaRG cells. First, we proved that bile canaliculi (BC) underwent spontaneous contractions, which are essential for bile acid efflux and required alternations in myosin light chain (MLC2) phosphorylation/dephosphorylation. A short exposure to cholestatic compounds revealed that BC dynamics was altered and associated with impairment of the ROCK/MLCK pathway. Then, in order to confirm our study, 12 cholestatic drugs and six noncholestatic drugs were analyzed and we demonstrated that all cholestatic drugs classified on the basis of reported clinical findings caused disturbances of both BC dynamics (dilatation or constriction), and alteration of the ROCK/MLCK signaling pathway, whereas noncholestatic compounds had no effect. We also proved that these changes were more specific than efflux inhibition measurements alone as predictive nonclinical markers of drug-induced cholestasis. To confirm and extend these conclusions, we analyzed the mechanisms involved in cytotoxic and cholestatic effects induced by the 4 main drugs from the endothelin receptor antagonists family: two related to clinical cases of hepatotoxicity (sitaxentan) and/or cholestasis (bosentan), and two that have not been reported to cause elevation of liver transaminases or bilirubin (ambrisentan and macitentan). The results showed that like bosentan, the structurally similar recently marketed drug, macitentan, could cause in vitro major BC alterations. By contrast, ambrisentan appeared as a safe drug and sitaxentan that has been withdrawn from the market for hepatotoxic cases, did not impair BC dynamics.