Plusieurs médicaments utilisés chez l'humain peuvent exercer des effets hépatotoxiques que l'on peut évaluer en système de culture primaire d'hépatocytes. On attribue aux hépatocytes des fonctions physiologiques essentielles. Ainsi, entre autres, ils sont impliqués dans le métabolisme des lipides, des glucides et des protéines. De plus, les hépatocytes constituent le principal site du métabolisme des médicaments, et c'est spécifiquement à leur niveau que se manifeste l'hépatotoxicité médicamenteuse. Celle-ci peut mener à de graves maladies hépatiques parmi lesquelles l'insuffisance hépatique aiguë, qui s'avère associée à une incidence de mortalité de 45 à 95% selon l'étiologie. Nous avons donc entrepris l'étude, en culture primaire d'hépatocytes de rat sur film de collagène, du Mintezol™(thiabendazole) et du Posicor™ (mibéfradil), deux médicaments dont les mécanismes d'hépatotoxicité ne sont pas bien connus. Le thiabendazole est un antihelminthique et fongicide, alors que le mibéfradil était autrefois employé pour le traitement de l'hypertension et de l'angine de poitrine. De plus, l'analgésique et antipyrétique Tylénol™ (acétaminophène ou APAP), dont les mécanismes d'hépatotoxicité sont connus, a servi de composé de référence. Nous avons évalué, pour chaque médicament, l'hépatotoxicité et le métabolisme de même que le type et le mécanisme de mort cellulaire induit. Les résultats obtenus montrent que c'est le mibefradil (5-20 µM, 24 et 48 h) qui mène aux changements morphologiques les plus importants et affecte le plus la viabilité et le niveau de synthèse d'albumine des hépatocytes. Nous avons de plus observé une augmentation de la mort cellulaire par nécrose avec la concentration et le temps (24 h, 48 h) pour le mibéfradil (5-20 µM) et l'APAP (10-40 mM). Toutefois, avec le thiabendazole (100-500 µM, 24h et 48h), peu de cytotoxicité ou d'effets sur la fonction métabolique des hépatocytes ont été détectés. Aussi, l'activité du 7-éthoxyresorufin-o-deethylase (EROD), un substrat du CYP1A1, a été induite par le thiabendazole (100-500 µM) et l'APAP (10-40 mM), après 24 h et 48 h, alors que le mibéfradil (5-20 µM, 24 h et 48 h) n'a exercé aucun effet. Toutefois, l'activité du 7-pentoxyresorufin-o-dealkylase (PROD), un substrat du CYP2B, a été induite par les 3 médicaments, dans les mêmes conditions que pour la mesure de EROD. Nous avons par ailleurs mesuré une induction globale de la mort cellulaire par apoptose, détectée par la condensation de la chromatine, avec les médicaments. Cette induction s'est manifestée par une activation des caspases-3, -8 et -9 par le thiabendazole (200 µM) et l'APAP (5 mM) après 1 h d'exposition, et par le mibéfradil (5 µM) après 3 h (caspase-2) et 12 h (caspases-3 et -8). Aux mêmes concentrations, ces médicaments ont de plus induit une baisse du potentiel membranaire mitochondrial et une libération de cytochrome c dans le cytosol (1 h thiabendazole et APAP; 3 h mibéfradil), et la translocation de la protéine «Fas-associated death domain» (FADO) du cytosol aux membranes (1 h thiabendazole et APAP; 12 h mibéfradil). Ainsi, d'une part, le mibéfradil serait plus hépatotoxique que l'APAP et le thiabendazole. D'autre part, l'étude de la signalisation apoptotique suggère que les médicaments étudiés activent tous la voie mitochondriale de l'apoptose de même que celle des récepteurs de mort. Cette étude contribue à l'avancement des connaissances sur l'hépatotoxicité du mibéfradil et du thiabendazole, en apportant une meilleure compréhension de l'hépatotoxicité de ces médicaments. Ceci permettra d'explorer des moyens de diminuer la toxicité du thiabendazole, et de diriger la recherche sur le développement de médicaments similaires au mibéfradil démontrant moins d'hépatotoxicité. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Mibéfradil, Thiabendazole, Acétaminophène, Apoptose, Nécrose, Hépatocytes, Hépatotoxicité, Caspases, Albumine.

L’objectif principal de l’étude était d’identifier les principaux médicaments associés aux hépatites aiguës (HA) associé aux médicaments (HAM) en France. Trois approches méthodologiques ont été définies. L’approche méthodologique principale est l’analyse cas-population. Les autres approches sont cas-propre témoin et cas témoins.Les cas ont été identifiés parmi les patients adultes présents dans le SNIIRAM, ayant une première hospitalisation entre 01/01/2010-31/12/2014 dont le diagnostic principal est une atteinte hépatique toxique (Classification Internationale des Maladies (CIM-10) K71.1, K71.2, K71.6, K71.9) ou une insuffisance hépatique(CIM-10 K72.0). La population de référence a été définie à partir de l’EGB. La date index (DI) considérée est la date de première hospitalisation pour HA. Les délivrances de l’ensemble des traitements précédant la DI ont été étudiées en considérant une exposition variant de 7 à 60 jours avant la DI. Les produits les plus fréquemment retrouvés sont classiques: antalgiques et en premier lieu le paracétamol, puis les produits à visée digestive symptomatique (inhibiteur de la pompe à protons, prokinétique, antispasmodique). Les suivants sont l’amoxicilline seule ou associée à l’acide clavulanique, l’ibuprofène, la codéine associée et le furosémide. L’ensemble de ces résultats pourra informer les autorités sanitaires, les praticiens et les patients sur le risque associé à chacune de ces molécules tant au plan individuel (risque absolu, risque attribuable), qu’au sein d’une famille de produits(risque relatif) ainsi que plus globalement pour la population et le système de santé(nombre absolu de cas attribuables). / The main objective of EPIHAM study is to identify the main drugs associated with drug induced liver injury leading to hospital admission (DILIH) in France and the event rates associated with DILIH. Three methodological approaches were defined. Principal approach is case-population. The others are case-crossover and case control analyses. Cases were identified among adult patients present in SNIIRAM database having a first hospitalization between 01/01/2010-2010/31/12/1204, the main diagnosis of which is toxic liver disease (diagnostic codes according to the International Classification of Diseases (ICD-10) K71.1, K71.2, K71.6, K71.9) orK72.0. Reference population was defined from the EGB. Index date (ID) was considered as the date of hospital admission for DILI. The dispensations of all treatments preceding the ID were studied by considering an exposure windowvarying from 7 to 60 days before ID. The most frequently found are classical: analgesics and firstly paracetamol, followed by drugs acting on digestive system (proton pump inhibitors, prokinetics, antispasmodics). The following were amoxicillinalone or combined with clavulanic acid, ibuprofen, codeine combinations, and furosemide. These results can inform health authorities, practitioners and patients about the acute hepatitis risk leading to hospitalisation associated with each of these molecules, both individually (absolute risk, attributable risk) and within a therapeutic drug family (relative risk) as well as more generally for the population and the health system (absolute number of attributable cases).

Les hépatopathies médicamenteuses survenant sur un mode idiosyncrasique représentent un obstacle majeur au développement de médicaments et sont à l’origine du retrait du marché de nombreux d’entre eux. Un des mécanismes mis en cause est lié à la survenue d’un épisode inflammatoire aigu qui, lors d’un traitement médicamenteux, sensibiliserait le foie pour les effets indésirables des médicaments, mettant en évidence leur toxicité idiosyncrasique. A l’heure actuelle, la détection précoce de médicaments potentiellement hépatotoxiques dans un contexte inflammatoire avant leur mise sur le marché, reste encore difficile et leurs mécanismes sous-jacents ne sont pas clairement élucidés. Dans ce contexte, notre travail s’articule sur 3 axes : 1) Développer un nouveau modèle cellulaire in vitro humain, adaptable au criblage à haut débit prédictif d'hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire, basé sur l’exposition synergique des cellules HepG2 cultivées dans des conditions particulières exposées à des médicaments potentiellement idiosyncrasiques et des médiateurs pro-inflammatoires(LPS et TNF- ).2) Elucider les mécanismes sous jacents de la toxicité de 4 médicaments idiosyncrasiques connus (trovafloxacine, nimésulide, télithromycine et néfazodone), en mettant l'accent sur le stress oxydatif, la stéatose et la cholestase 3) Etudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la mort cellulaire observée lors d’une hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire. Ainsi, nous avons développé un modèle cellulaire humain prédictif d’hépatotoxicité idiosyncrasique liée à un stress inflammatoire sensible, spécifique et applicable au criblage en haut débit d’un grand nombre de médicaments. Pour cela, nous avons étudié dans ce modèle, les effets toxiques de quatre médicaments testés et élucidé leurs mécanismes. La trovafloxacine exerce un effet cholestatique par diminution de l’expression et de l’activité de MDR1 et MRP2. Le nimésulide favorise l'accumulation intracellulaire de radicaux superoxydes en plus de son potentiel cholestatique par inhibition de l’activité MRP2. La télithromycine favorise une hépatotoxicité principalement via un mécanisme cholestatique impliquant l’inhibition de MDR1. La néfazodone favorise l'accumulation des radicaux superoxydes en plus de son potentiel stéatosique important et de son effet inhibiteur sur les deux transporteurs MDR1 et MRP2. Bien que chaque médicament idiosyncrasique testé présente un mécanisme de toxicité différent, ils ont tous entraîné une mort hépatocellulaire amplifiée en présence de LPS et TNF- , via la voie apoptotique intrinsèque pour la trovafloxacine, extrinsèque pour la néfazodone et les deux voies de l'apoptose pour le nimésulide et la télithromycine. Le potentiel apoptotique amplifié des quatre médicaments s'est avéré être médié par la surexpression de Bax et de caspase 8 via un mécanisme dépendant de ERK ½. Nos résultats indiquent que notre modèle peut être utilisé non seulement comme un outil préclinique pour l'identification de nouveaux médicaments qui pourraient être potentiellement hépatotoxiques lors d’un stress inflammatoire, mais aussi pour l'élucidation de leurs mécanismes. / Idiosyncratic adverse drug reactions (IADRs) are considered as an important subset of ADRs, accounting for approximately 13% ofall acute liver failure cases and representing one of the leading causes for post-marketing drug withdrawal (Shaw et al. 2010). The lack of effective in vitro or in vivo models able to predict the hepatotoxic potential of idiosyncratic drugs before being approved formarketing on one hand, and the ambiguity of the mechanisms underlying their hepatic pathogenesis on the other hand render IADRs a perplexing human health problem (Shaw et al. 2010). Accordingly, the work presented in this thesis was based on three main objectives: 1) Development of a high throughput human-based cellular model for the prediction of inflammation associated idiosyncratic drug-induced hepatotoxicity; based on the synergistic exposure of HepG2 cells to potentially hepatotoxic drugs and proinflammatory mediators (LPS and TNF- ). 2) Elucidation of the hepatotoxic mechanisms underlying four known idiosyncratic drugs (trovafloxacin, nimesulide, telithromycin and nefazodone) with emphasis on oxidative stress, steatosis and cholestasis.3) Investigation of the molecular mechanisms underlying drug-inflammation synergistic induction of hepatocellular death Firstly, the results attained in this thesis demonstrated that the developed model is sensitive, specific and applicable to high throughputtoxicity screening of different categories of drugs. Secondly, our results demonstrated that the inflammation associated hepatotoxicpotentials of the four tested idiosyncratic drugs are mediated as follows: trovafloxacin exerts a cholestatic potential that involves thedown-regulation of both MDR1 and MRP2. Nimesulide promotes the intracellular accumulation of superoxide anions in addition topotently inhibiting MRP2. Telithromycin promotes hepatotoxicity predominately via a cholestatic mechanism that involves the downregulation of MDR1. Nefazodone favors the accumulation of superoxide anions in addition to its prominent steatotic potential and inhibitory effect on both MDR1 and MRP2. Although each of the idiosyncratic drugs exhibited a different mechanism of toxicity they all induced amplified hepatocellular death in presence of LPS and TNF- , which proved to be mediated via the intrinsic apoptotic pathway for trovafloxacin, the extrinsic for nefazodone and both apoptotic pathways for nimesulide and telithromycin. The amplified apoptotic potential of the four drugs proved to be based on the up-regulation of Bax and caspase 8 via an ERK½-dependent mechanism. These results indicate that the presented drug-inflammation model constitute an effective pre-clinical tool not only for the detection of inflammation-associated hepatotoxic drugs but also for the elucidation of their underlying mechanisms.

La maladie d'Alzheimer est la pathologie neurodégénérative la plus courante affectant les personnes âgées. Cette neuropathologie se caractérise par une étiologie complexe dont le déficit en acétylcholine, les plaques amyloïdes, les dégénérescences neurofibrillaires ou le stress oxydant en sont les principaux acteurs.Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l'application des réactions multicomposants de Ugi et de Passerini, pour la synthèse de nouveaux adduits multi-cibles basées sur différents motifs antioxydants et anticholinestérasiques. Ces réactions permettent d'accéder à une vaste diversité chimique en une étape, ce qui les rend adaptées pour la synthèse rapide de molécules ayant plusieurs pharmacophores d'intérêt et ciblant ainsi différentes cause étiologiques de la maladie d'Alzheimer.Au total, 56 composés finaux, répartis dans cinq séries, ont été synthétisés :les alpha-acylaminocarboxamides prototypes (série A)les hybrides tacrine-acide férulique (série B)les hétérotrimères tacrine-mélatonine-acides antioxydant (série C)> les hybrides donépézil-acide férulique (série D)^ les dérivés chromone (série E)Toutes les séries ont été évaluées pour leur capacité à inhiber les enzymes cholinestérases et leur pouvoir antioxydant. L'hépatotoxicité des séries B et C. portant un motif tacrine, a été évaluée sur les cellules HepG2. Par ailleurs, l'étude de la série B a été complétée par d'autres tests pharmacologiques, physico-chimiques et toxicologiques.Ces différents travaux démontrent et valident l'utilisation des réactions de Ugi et de Passerini dans le développement de molécules multi-cibles pour le traitement potentiel de la maladie d'Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is thé most common type of dementia affecting elderly people. This neuropathology is characterized by a highiy complex and intricated etiology including cholinergic déficit, amyloid deposits, neurofibrillary tangles and oxidative stress.During this thesis, we sought to apply Ugi and Passerini multicomponent reactions for thé synthesis of new multi-target adducts based on différent antioxidant and anticholinergic scaffolds.Thèse réactions provides access to a broad range of chemical diversity in a one-pot fashion, which makes them suitable for thé expeditious synthesis of molécules having several pharmacophores of interest and hitting différent targets related to thé multifaceted etiology of Alzheimer's disease.A total of 56 final compounds, spread over 5 séries, hâve been synthesized:alpha-acylaminocarboxamides prototypes (A séries)tacrine-ferulic acid hybrids (B séries)tacrine-melatonin-antioxydant acids heterotrimers (C séries)donepezil-ferulic acid hybrids (D séries)Chromone derivatives (E séries)Ail thé séries were tested for their ability to inhibit thé cholinesterases enzymes and for their antioxidant power. Hepatotoxicity of thé B and C séries, bearing a tacrine fragment, was evaluated on HepG2 cells. Moreover, thé study of thé B séries was supplemented by further pharmacological, physicochemical and toxicological tests (NMR conformational study, neuroprotection on SH-SY5Y cells. self-induced Abetai.42 peptide aggregation inhibition, docking ADMET).Such work demonstrated and validated thé use of Ugi and Passerini reactions for thé development of new multi-target directed molécules for thé potential treatment of AD.

Les cancers du foie et du pancréas sont classés parmi les cancers les plus fréquents et agressifs à travers le monde et présentent une résistance à la chimiothérapie. L'efficacité des médicaments anticancéreux est affectée par les activités des enzymes métaboliques, transporteurs membranaires et par l’environnement tumoral. Le but de notre thèse est 1) de développer un modèle cellulaire hépatique et caractériser les mécanismes sous-jacents de la modulation de l’expression et de la fonctionnalité des transporteurs membranaires et des enzymes clés qui régissent le métabolisme des médicaments et 2) d’évaluer in vitro, dans différents modèles cellulaires (hépatique et pancréatique) en 2D et 3D, l’effet apoptotique de médicaments anticancéreux associés à des polyphénols en vue d’optimiser leur activité. Dans une première partie, nous avons mis en place une nouvelle lignée cellulaire hépatique humaine dérivée des HepG2, stable, exprimant suffisamment et significativement les enzymes CYP450 et les transporteurs hépatiques (MRP2, MDR1 et OATP1B1). Ce modèle pourrait être un outil de choix pour des études précliniques de métabolisme et de prédiction d’hépatotoxicité. Dans une deuxième partie, nous avons pu voir que les cellules pancréatiques et hépatiques dans un environnement 3D sont plus prédictives d’une tumeur in vivo et peuvent être un modèle de choix pour des études pharmacologiques de criblage de nouveaux médicaments anticancéreux ou des stratégies de combinaisons de molécules (avec des PP). Ainsi, nous avons montré que la quercétine, dans les cellules 3D, était capable d’augmenter l’activité de la gemcitabine et de la doxorubicine, en augmentant le taux des cellules mortes jusqu’à 60 %, par modulation des protéines MDR1 et par diminution significative du facteur HIF-1 alpha dans les cellules cancéreuses. En conclusion, les polyphénols peuvent être des molécules d’intérêt en combinaison avec des médicaments anticancéreux pour diminuer la résistance à ces traitements et servir d’outil pharmacologique pour mieux comprendre les mécanismes de résistance des cellules tumorales. / Liver and pancreatic cancers are among the most common and aggressive cancers worldwide that are resistant to chemotherapy. The efficacy of anticancer drugs is affected by the activities of metabolic enzymes, transporters and the tumor environment. The aim of my thesis was based on to main objectives: 1) developement of a hepatic cellular model and characterize the underlying mechanisms of modulation of the expression and functionality of transporters and key enzymes involved in the regulation of drug metabolism 2) study the effect of new strategies in vitro by combining anti-cancer drugs with polyphenols in these processes in order to optimize their activities on different cellular models (hepatic and pancreatic) in 2D and 3D cultures. Our results showed that we have developed a new human hepatic cell line derived from HepG2 cells. The novel cell line is a good in vitro model with a capacity of predicting hepatotoxicity of novel drugs with significant differences for chromosomes 5, 17 and 20 and high expression level of CYP450 and transporters (MRP2, MDR1 and OATP1B1). Secondly, our results indicate that the combination of anticancer drugs and polyphenols increased the rate of apoptosis in cancer cells by up regulation of the expression levels of cleaved caspase-3 and the regulator of apoptosis p53. Moreover, our results demonstrated that polyphenols inhibit the efflux activity of MDR1. In addition, our results indicate that the combination of anti-cancer drugs and quercetin down regulated the expression of HIF-1α and increased the expression levels of the cleaved caspase-3 and p53 on human pancreatic and liver cell line cultured in 3D culture. In conclusion, polyphenols may be promising agents for novel combination therapy since they potentialize the cytotoxic activity of anticancer drugs to eradicate cancer and therefore the cellular resistance.

Malgré de nombreux progrès thérapeutiques, la seule réelle option thérapeutique des malades atteints d’une cirrhose terminale ou d’hépatite aiguë fulminante est la transplantation hépatique, cependant limitée par la pénurie d’organes. De même, la prise en charge des pathologies pancréatiques aigues et chroniques consiste essentiellement en traitements supportifs et des complications.<p>La réaction inflammatoire au cours des maladies hépatiques et pancréatiques joue un rôle majeur dans l’évolution de ces maladies car elle influence la sévérité de l’affection aiguë et se complique fréquemment de fibrose et de cirrhose. <p>Les chimiokines constituent une famille de peptides possédant des propriétés chimiotactiques et activatrices sur les leucocytes, et de ce fait jouent un rôle primordial dans la réaction inflammatoire en recrutant des cellules inflammatoires vers un site lésé. Les chimiokines exercent leurs activités en se liant à une famille de récepteurs à 7 hélices transmembranaires situés sur les leucocytes. <p>Le CCR5 est un récepteur pour les chimiokines CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL5 (RANTES) et CCL8 (MCP-2). Le CCR5 joue un rôle important de corécepteur dans l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine. Chez l’humain, il existe une mutation relativement fréquente du CCR5, appelée CCR5Δ32, qui confère chez les patients homozygotes pour la mutation une protection presque complète contre l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine. Plus récemment, la mutation CCR5Δ32 a été rapportée comme étant associée à certaines maladies hépatiques et des traitements expérimentaux chez l’homme par inhibiteurs du CCR5 ont entraînés des cas d’hépatotoxicité sévère. De même, il a été rapporté que l’expression pancréatique de CCR5 était augmentée chez les patients atteints de pancréatite chronique. Cependant, le rôle du récepteur CCR5 et de ses ligands dans la pathogénie des maladies hépatiques et pancréatiques n’est pas connu.<p>Dans un premier temps, nous avons démontré dans un modèle expérimental d’hépatite médiée par les lymphocytes T qu’il existe une production hépatique de CCL3, CCL4 et CCL5 au cours de la maladie et que le foie des souris malades est caractérisé par une infiltration accrue de cellules CCR5+. En utilisant des souris CCR5-déficientes, nous avons ensuite montré que l’absence de CCR5 est associée à une maladie plus sévère, à une production accrue de cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines liant le CCR5 (CCL3, CCL4 et CCL5), ainsi que par un recrutement plus important de cellules inflammatoires, particulièrement des cellules CCR1+. Nous avons ensuite montré que la production accrue des ligands du CCR5 joue un rôle important dans l’exacerbation de la maladie observée chez les souris CCR5-déficientes, puisque leur neutralisation réduit fortement la sévérité de la maladie ainsi que le recrutement hépatique de cellules inflammatoires.<p>Dans un second temps, nous avons étudié l’expression et le rôle du CCR5 et de ses ligands dans un modèle murin de pancréatite aiguë sécrétagogue, induite par des injections répétées d’un analogue de la cholécystokinine. Précocément après l’induction de la maladie, nous avons observé une augmentation de l’expression de CCL2 (MCP-1), CCL3 et CCL4 alors que l’augmentation d’expression de CCL5 est observée plus tardivement au cours de la maladie. Nous avons ensuite montré que les souris CCR5-déficientes développent une pancréatite plus sévère, ainsi qu’une production accrue de CCL2, CCL3 et CCL4, et un infiltrat inflammatoire plus marqué que les souris ‘’wild-type’’. Nous avons également montré que la production accrue de ces chimiokines joue un rôle dans l’exacerbation de la pancréatite aiguë chez les souris CCR5-déficientes. En effet, la neutralisation simultanée de ces chimiokines par des anticorps monoclonaux réduit significativement la sévérité de la maladie pancréatique chez ces souris. De même, la neutralisation simultanée des ligands du CCR5 chez des souris wild-type réduit également la sévérité de la pancréatite aiguë, suggérant un rôle de ces molécules dans la pathogénie de la pancréatite aiguë.<p>En conclusion, nous avons montré que l’absence du récepteur CCR5 augmente la susceptibilité aux maladies inflammatoires hépatiques et pancréatiques expérimentales. Le développement d’inhibiteurs du CCR5 dans l’arsenal thérapeutique contre le virus de l’immunodéficience humaine devra tenir compte de ces données, d’autant plus que des cas d’hépatotoxicité sévère ont été récemment rapportés avec certains inhibiteurs en développement et que l’association du virus de l’immunodéficience humaine avec la présence de maladies hépatiques est fréquente. Enfin, ces travaux ouvrent de nouveaux champs d’investigation au niveau de l’étude d’association du CCR5Δ32 avec les maladies inflammatoires pancréatiques et hépatiques, et des perspectives thérapeutiques ciblant CCL3, CCL4 et CCL5. <p><p><p> / Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La cholestase intrahépatique est une manifestation fréquente des lésions hépatiques induites par les médicaments; Cependant, les mécanismes impliqués sont peu connus. Nous avons cherché à étudier les mécanismes de la cholestase induite par les médicaments afin d’améliorer sa détection précoce en utilisant les cellules HepaRG humaines. Tout d'abord, nous avons prouvé que les canalicules biliaires (BC) subissaient des contractions spontanées, essentielles pour l'efflux d’acides biliaires et nécessitaient des séries d’alternance dans la phosphorylation/déphosphorylation de la chaîne légère de myosine (MLC2). La courte exposition à des composés cholestatiques a révélé que la modulation des BC était associée à des perturbations de la voie de signalisation ROCK/MLCK. Afin de confirmer notre étude, 12 médicaments cholestatiques et six non cholestatiques ont été analysés et nous avons démontré que tous les médicaments cholestatiques classés sur la base de résultats cliniques provoquaient des perturbations dans la dynamique des BC (dilatation ou constriction), et altéraient la voie de signalisation ROCK/MLCK, tandis que les composés non cholestatiques n'avaient pas d'effet. Nous avons également prouvé que ces changements étaient plus spécifiques que la mesure de l'inhibition de l’efflux comme marqueurs prédictifs non cliniques de la cholestase induite par les médicaments. Afin de confirmer et d’étendre ces conclusions, nous avons analysé les mécanismes impliqués dans les effets cytotoxiques et cholestatiques induits par 4 médicaments de la famille des antagonistes des récepteurs de l'endothéline: deux ayant un lien avec des cas cliniques d'hépatotoxicité (sitaxentan) et/ou cholestase (bosentan), et deux n’ayant pas été impliqués dans l’élévation de transaminases hépatiques ou de bilirubine (ambrisentan et macitentan). Les résultats montrent que le macitentan récemment commercialisé et ayant une structure chimique similaire à celle du bosentan, était capable de causer, comme ce dernier, des altérations in vitro des BC. En revanche, l'ambrisentan n’était pas hépatotoxique et le sitaxentan qui a été retiré du marché pour des cas d’hépatotoxicité, n’affectait pas la dynamique canaliculaire. / Intrahepatic cholestasis represents a frequent manifestation of drug-induced liver injuries; however, the mechanisms involved in such injuries are poorly understood. We aimed to investigate mechanisms underlying drug-induced cholestasis and improve its early detection using human HepaRG cells. First, we proved that bile canaliculi (BC) underwent spontaneous contractions, which are essential for bile acid efflux and required alternations in myosin light chain (MLC2) phosphorylation/dephosphorylation. A short exposure to cholestatic compounds revealed that BC dynamics was altered and associated with impairment of the ROCK/MLCK pathway. Then, in order to confirm our study, 12 cholestatic drugs and six noncholestatic drugs were analyzed and we demonstrated that all cholestatic drugs classified on the basis of reported clinical findings caused disturbances of both BC dynamics (dilatation or constriction), and alteration of the ROCK/MLCK signaling pathway, whereas noncholestatic compounds had no effect. We also proved that these changes were more specific than efflux inhibition measurements alone as predictive nonclinical markers of drug-induced cholestasis. To confirm and extend these conclusions, we analyzed the mechanisms involved in cytotoxic and cholestatic effects induced by the 4 main drugs from the endothelin receptor antagonists family: two related to clinical cases of hepatotoxicity (sitaxentan) and/or cholestasis (bosentan), and two that have not been reported to cause elevation of liver transaminases or bilirubin (ambrisentan and macitentan). The results showed that like bosentan, the structurally similar recently marketed drug, macitentan, could cause in vitro major BC alterations. By contrast, ambrisentan appeared as a safe drug and sitaxentan that has been withdrawn from the market for hepatotoxic cases, did not impair BC dynamics.

Il est estimé aujourd’hui que plus de 350 médicaments peuvent induire des lésions hépatiques entraînant différentes manifestations cliniques telles qu’une hépatite cytolytique, une stéatose voire une cirrhose. Bon nombre de médicaments hépatotoxiques induisent un dysfonctionnement mitochondrial. Cependant, les mécanismes induisant de tels effets délétères ne sont pas tous élucidés, en particulier ceux concernant l’ADN mitochondrial (ADNmt) et son homéostasie, qui ne sont pas souvent explorés. De plus, il existe peu d’informations concernant l’hépatotoxicité médicamenteuse dans un contexte de stéatose induite par l’obésité. Ainsi, l’objectif de ce travail a été tout d’abord de mettre au point un modèle de stéatose dans les cellules de la lignée hépatocytaire humaine HepaRG afin d’étudier ensuite, les effets de neuf médicaments hépatotoxiques et vraisemblablement mitochondriotoxiques – l’amiodarone, l’atorvastatine, la carbamazépine, l’imipramine, la lovastatine, la perhexiline, le ritonavir, la terbinafine et la troglitazone – sur l’homéostasie de l’ADNmt dans un contexte ou non de stéatose. En utilisant des concentrations peu ou non cytotoxiques, nous avons trouvé que parmi les neuf médicaments étudiés, le ritonavir et l’imipramine ont induit des effets mitochondriaux suggérant une altération de la traduction mitochondriale. De façon notable, la toxicité du ritonavir était plus importante dans les cellules non-stéatosées. De plus, aucun des neuf médicaments n’a induit de diminution des quantités d’ADNmt. Cependant, les quantités accrues d’ADNmt ont été retrouvées avec six des neuf médicaments, et notamment dans les cellules non-stéatosées. Cela était par ailleurs accompagné d’une modulation de l’expression des différents facteurs impliqués dans la biogenèse mitochondriale (PGC-1α, PGC-1β, AMPK, etc.). Ainsi, ces données laissent supposer qu’une altération de la traduction mitochondriale peut ne pas être une événement rare et que l’augmentation des quantités d’ADNmt et la modulation de la biogenèse mitochondriale pourraient être une réponse adaptative fréquente à des altérations mitochondriales pouvant être amoindrie par la stéatose. / It is currently estimated that more than 350 drugs can induce liver injury with different clinical presentations such as hepatic cytolysis, steatosis, even cirrhosis. Many hepatotoxic drugs can induce mitochondrial damage and dysfunction. However, not all mechanisms that lead to such deleterious effects are clarified, especially those concerning mitochondrial DNA (mtDNA) and its homeostasis, which are not often investigated. Moreover, there is little information regarding the impact of non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) on drug-induced liver injury. Thus, the aim of this work was, first of all, to develop a model of NAFLD in the hepatic cell line HepaRG in order to study further effects of nine hepatotoxic and presumably mitochondriotoxic drugs – amiodarone, atorvastatin, carbamazepine, imipramine, lovastatin, perhexiline, ritonavir, terbinafine and troglitazone –, on mtDNA homeostasis in the context of NAFLD or not. By using drug concentrations that did not induce major cytotoxicity, we found that, among the nine drugs, studied, ritonavir and imipramine induced mitochondrial effects suggesting alteration of mtDNA translation. Notably, ritonavir toxicity was stronger in non-steatotic cells. Furthermore, none of the nine drugs decreased mtDNA levels. However, increased mtDNA was observed with six drugs, especially in non-steatotic cells. This result was also accompanied by a modulation of the expression of various factors involved in mitochondrial biogenesis (e.g. PGC-1α, PGC-1β, AMPK).Therefore, this data suggests that drug-induced impairment of mtDNA translation may not be a rare event and increased mtDNA levels and modulation of mitochondrial biogenesis could be a frequent adaptive response to mitochondrial impairments, which could be dampened by steatosis.

Les valeurs toxicologiques de référence pour les contaminants de l’environnement sont généralement basées sur les résultats d’études animales dont la pertinence pour l’humain est remise en question. L’objectif de mon projet était d’évaluer une approche combinant les études in vitro sur des cellules humaines et la modélisation pharmacocinétique pour établir des valeurs toxicologiques de référence. Nous avons mené une étude de cas sur l’hépatotoxicité de l’acide perfluorooctanoïque (APFO). Un point de départ (POD) a été déterminé sur la base des concentrations sans effet néfaste observable (NOAEL) d’études in vitro. Ce POD a été traduit en équivalents de surveillance biologique, qui ont été comparés aux concentrations mesurées dans les études épidémiologiques sur l’exposition à l’APFO et l’hépatotoxicité. Des apports quotidiens tolérables (AQT) ont été estimés par dosimétrie inverse à l’aide d’un modèle pharmacocinétique. Nous avons utilisé un POD de 1 μM des études in vitro, qui a été traduit en une concentration plasmatique de 414 ng/mL. Pour atteindre cette concentration chez l’enfant exposé prénatalement et par l’allaitement, nous avons estimé que la concentration plasmatique chez la mère au début de la grossesse doit être de 155 ng/mL. Ces concentrations ont été traduites en équivalents de biosurveillance de 4,14 ng/mL (adulte) et 1,55 ng/mL (femme enceinte) (facteurs d’incertitude combinés : 100 à partir du POD), des valeurs se situant dans l’intervalle des concentrations médianes dans les études épidémiologiques (0,49 à 16 ng/mL). Des AQT de 0,121 (hépatoxicité chez l’adulte) et 0,047 ng/kg/jour (hépatotoxicité développementale) ont également été obtenus (facteurs d’incertitude combinés : 300) à partir du même POD. En conclusion, les résultats laissent croire que l’approche évaluée offre une alternative adéquate et prudente pour l’établissement de valeurs toxicologiques de référence. / Acceptable exposure levels for environmental contaminants are generally calculated based on animal studies, but the scientific community is currently questioning their relevance to humans. The objective of this project was to evaluate a new approach combining in vitro studies on human cells and pharmacokinetic modeling to derive acceptable exposure levels. We conducted a case study on the hepatotoxicity of perfluorooctanoic acid (PFOA). We determined a point of departure (POD) based on no observable adverse effect levels (NOAELs) from in vitro studies using human cells. We then translated this POD into a biomonitoring equivalent and compared it to concentrations measured in epidemiological studies on PFOA exposure and hepatotoxicity. A Tolerable Daily Intake (TDI) was estimated using a pharmacokinetic model. We used a POD of 1 μM from in vitro studies and translated it into a 414 ng/mL plasma concentration. To reach this concentration in children exposed prenatally and by breastfeeding, we estimated that the plasma concentration in the mother during pregnancy must be 155 ng/mL. We translated these concentrations into biomonitoring equivalents of 4.14 ng/mL (adult) and 1.55 ng/mL (pregnant women) when using a composite uncertainty factor of 100. These biomonitoring equivalents are within the range of median concentrations in epidemiologic studies (0.49 to 16 ng/mL). TDIs of 0.121 and 0.047 ng/kg/day for adult hepatoxicity and developmental hepatotoxicity, respectively, were estimated using a composite uncertainty factor of 300. In conclusion, the results suggest that the evaluated approach offers an adequate and conservative alternative to derive acceptable exposure levels.