Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / Para el estudio del componente proteico del líquido sinovial equino se propone la implementación de la tecnología de bibliotecas de ligandos combinatoriales, con el fin de disminuir la presencia de proteínas de alta abundancia, como la albúmina, que dificultan el acceso a proteínas de baja abundancia, expresado a su vez en el cambio del patrón electroforético de las proteínas del líquido sinovial. Se exponen los alcances que posee esta tecnología para su uso en líquido sinovial equino y la comparación de protocolos, con el fin de optimizar una metodología en el estudio electroforético de las proteínas del liquido sinovial. Los cambios metodológicos incluidos al protocolo inicial, como captura a diferentes pH, aumento de volumen de muestra y disminución de la fuerza iónica del medio, permiten un mejor resultado en el estudio electroforético del líquido sinovial equino. / For the study of the protein content of equine synovial fluid we propose the implementation of combinatorial peptide ligand libraries technology to deplete high abundant proteins, like albumin, which difficult the access to low abundant proteins, expressed in turn in changes in the equine synovial fluid electrophoretic patern. We exhibit the extents of this technology for equine synovial fluid use and protocol comparison, to optimize a methodology for the electrophoretic study of equine synovial fluid proteins. Methodology changes in the initial protocol, like different pH values capture, rise volume sample and decrease in media ion strength, allow better results in equine synovial fluid electrophoretic study.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se mide la actividad gelatinásica (MMP-2 y MMP-9) por medio de zimografía en el líquido sinovial de articulaciones metacarpo-falángicas normales y alteradas. Para ello se analizan 84 articulaciones, 37 de las cuales presentan el cartílago articular y membrana sinovial normal, 17 tienen su cartílago articular normal y su membrana sinovial alterada, 21 presentan sólo su cartílago articular alterado y 9 articulaciones presentan ambas estructuras alteradas. Los objetivos de esta memoria son cuantificar y comparar la actividad de la MMP-2 y MMP-9 mediante zimografía en el líquido sinovial de articulaciones normales y alteradas. En el 100% de las articulaciones analizadas (84) independiente de su condición, se encontró la presencia de una banda gelatinolítica de 70 kDa que corresponde a la pro MMP-2, que es constitutiva de las articulaciones diartrodiales normales en los equinos. En el 84% de las articulaciones con cartílago articular y membrana sinovial normal (NN) (31), se encontró una segunda banda gelatinolítica de 100 kDa que corresponde a la pro MMP-9. En el 25% del total de articulaciones analizadas (21) se encontró una banda tenue con baja actividad gelatinolítica de 240 kDa que correspondería a la forma dimérica de la pro MMP-9 unida a su TIMP-1. Con respecto al número total de bandas en las muestras NN se encontró que un 8% presentó solo 1 banda, el 27% presentó 2 bandas, el 41% presentó 3 bandas, el 16% presentó 4 bandas, el 5% presentó 5 bandas y finalmente el 3% presentó 1 banda. En ninguna de las zimografías realizadas se pudo detectar la forma activa de las gelatinasas. Las unidades relativas, obtenidas por densitometría, para ambas gelatinasas (pro MMP-2 y pro MMP-9) no mostraron diferencias significativas en los 4 grupos analizados

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Durante el proceso de daño oxidativo, en la célula se alteran una serie de biomoléculas como el ADN, proteínas y lípidos. El daño oxidativo de los lípidos se denomina lipoperoxidación (LP), que afecta principalmente a los lípidos de membrana. Durante la LP se liberan numerosas moléculas que pueden ser consideradas como marcadoras del proceso. El malondialdehído (MDA) es un aldehído producido durante la LP, que se ha utilizado comúnmente como marcador, a través de la metodología de las sustancias reactivas al ácido tiobartitúrico (TBARS). Esta metodología presenta problemas de especificidad principalmente cuando se utiliza en fluidos biológicos y muestras de tejidos, por lo que en este trabajo se evaluó la metodología del 3-metil-2-benzotiazolidon hidrazona (MBTH) como una alternativa al TBARS en la determinación de los productos de la LP. Esto debido a que para el MBTH se ha descrito la capacidad de reaccionar con aldehídos presentes en el líquido sinovial (LS), cuyo origen se ha asociado a la degradación del colágeno II. Además se determinó el grado de especificidad reactiva de ambas metodologías evaluándolas en sistemas con distintos aldehídos (acetaldehído, propionaldehído, glutaraldialdehído y benzaldehído) y con glucosa (a una concentración de 10-1M), ya que esta molécula presenta un grupo aldehído en su estructura. Finalmente, se evaluó el efecto antioxidante (AO) del LS con ambas metodologías. Todos estos ensayos se realizaron en un sistema biológico constituido por una fracción microsomal obtenida a partir de hígado de equino y se evaluaron espectrofotométricamente. Se aplicó la metodología del TBARS a la fracción microsomal de hígado equino y se logró estandarizar la metodología del MBTH para la determinación de los productos de la LP in vitro. Al evaluar la especificidad reactiva de ambas metodologías con los distintos aldehídos, se encontró que el MBTH reaccionaba con los aldehídos a una menor concentración de lo que lo hacía el TBARS. Con la glucosa 10-1M, ni la metodología del MBTH ni la del TBARS generaron reacción colorimétrica, descartando, que bajo estas condiciones experimentales, la glucosa se comporte como un interferente de la reacción. Finalmente, el LS no manifestó su capacidad AO con ninguna de las metodologías utilizadas, incluso con el MBTH, al agregarle LS a la fracción de membrana se generó una curva ascendente proporcional a los volúmenes de LS adicionados. Estos resultados sugieren la posibilidad de que el MBTH sea más sensible a los productos de la LP que el TBARS, y que el cambio en el sistema biológico utilizado (de hígado de rata a hígado de equino) pudiera afectar en la capacidad AO del LS

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La osteoartritis (OA) o enfermedad degenerativa articular (EDA) es la principal causa de invalidez en el equino. Es una afección multifactorial en la que participan diversos mediadores químicos, entre ellos las metaloproteinasas (MMPs), que actúan degradando los componentes de la matriz extracelular (MEC) del cartílago articular, generando una cadena de reacciones que llevan a la destrucción progresiva del mismo. Se ha demostrado que recuentos elevados de células nucleadas en el líquido sinovial están relacionados con un incremento en la actividad de las MMPs, especialmente la MMP-9, lo que incide en el establecimiento y posterior progreso de la OA. Como una forma de validar un modelo de normalidad articular en base a la observación macroscópica, en este estudio se obtuvo muestras de la articulación metacarpo falángica equina, realizando una clasificación entre articulaciones normales y patológicas según la apariencia macroscópica del cartílago articular, separando luego las articulaciones normales según su recuento celular en un grupo normal con recuento celular elevado (> 600 células nucleadas/µl) y en otro normal con bajo recuento celular (< 300 células nucleadas/µl). Además, se incorporó un grupo articular con daño crónico de la articulación como control positivo. A todas las muestras se les determinó la concentración de proteínas totales y la actividad gelatinolítica para las MMPs 2 y 9 mediante zimografía. Además, se realizaron cortes histológicos del cartílago articular con el fin de evaluar la pérdida de matriz extracelular, mediante la medición del grosor de la zona superficial del cartílago. También en estos cortes se realizó recuento de condrocitos y se evaluó la cantidad de grupos isógenos. La muerte celular se evaluó mediante el recuento de lagunas vacías en un área determinada de cartílago articular. En el grupo patológico se detectó una marcada disminución en el grosor de la zona superficial del cartílago articular y se encontró el mayor recuento de lagunas vacías. En ambos grupos normales a la inspección macroscópica no se detectó diferencias en el grosor de la zona superficial del cartílago ni en el recuento de condrocitos y de grupos isógenos. Sin embargo, se encontró diferencia significativa en la cantidad de lagunas vacías, siendo ésta mucho mayor en el grupo con un recuento celular elevado. También se encontró una relación entre la mayor actividad gelatinolítica de MMP-9 y un mayor recuento de células nucleadas en el líquido sinovial

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / El objetivo planteado para esta tesis fue investigar la presencia de la proteína Calreticulina en el líquido sinovial de la articulación radio carpal de equinos Fina Sangre Inglés, mediante métodos moleculares y de esta manera describir una proteína que hasta la fecha no se ha identificado en la especie equina. Para lo anterior, se utilizaron 5 equinos clínicamente sanos, desde los cuales se obtuvo una muestra de líquido sinovial para su posterior estudio. Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida que se analizó mediante inmuno electro transferencia (IWB) utilizando anticuerpos anti Calreticulina humana (HuCRT) y anti Calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), permitiendo un reconocimiento antigénico de la proteína. Se utilizó HuCRT y TcCRT como control (+). Adicionalmente, se estudió la capacidad in vitro de la Calreticulina presente en el líquido sinovial para unirse a C1q del sistema de complemento, lo cual fue estudiado mediante inmuno electro transferencia. También, se efectuaron ensayos con el objetivo de modificar el patrón electroforético de las proteínas del líquido sinovial equino para disminuir la concentración de las proteínas más abundantes, y con ello aumentar relativamente las proteínas que se encuentran en menor concentración. Finalmente, se realizó una espectrometría de masas (MALDI-TOF) y una espectroscopia de Raman con el objeto de identificar y confirmar que la proteína inmuno reactiva fuese CRT. En la IWB se evidenció una reacción positiva por la aparición de una banda de aproximadamente 50 kDa la cual fue evidenciada con el anticuerpo anti HuCRT. El desafío a C1q no generó una reacción positiva, no pudiendo evidenciarse la unión de CRT del líquido sinovial equino al componente C1q del complemento. La presencia de la proteína CRT en el líquido sinovial equino, utilizando el diseño experimental planteado, no pudo ser confirmada por espectrometría de masas como por espectroscopía de Raman, necesitándose diseñar otros experimentos para separar y aislar más específicamente la proteína en estudio. La Calreticulina equina (EqCRT) fue reconocida principalmente por el anticuerpo anti HuCRT y no así por el anticuerpo anti TcCRT, lo que se debe probablemente a una mayor homología entre ambas proteínas a diferencia de la proteína del equino con la proteína de Trypanosoma cruzi. Por otro lado, el que no hubiese reacción al realizar el desafío frente a C1q, no quiere decir que la “EqCRT” no se una a C1q y puede haber sido más que nada un problema de diseño experimental en donde se utilizaron concentraciones muy bajas de proteína, no logrando producir una reacción identificable mediante el IWB. Para lograr una correcta identificación de la CRT mediante espectrometría de masas, se requiere obtener una muestra más purificada y de esta manera evitar el reconocimiento de otras proteínas contaminantes. Por otro lado, la espectroscopía de Raman, con la longitud de onda utilizada (785 nm), no fue posible identificar un espectro específico que pudiese confirmar la presencia de CRT en el líquido sinovial equino de animales clínicamente sanos. Con la información obtenida en este estudio, es posible suponer que la CRT puede estar cumpliendo algún rol en la homeostasis articular, sin embargo, otros experimentos son necesarios para lograr su completa identificación. / The goal for this research was to investigate the presence of Calreticulin in the equine synovial fluid obtained from the radio carpal joint of Thoroughbred horses and thus describe a protein that has not been identified in this specie so far. Five clinically healthy horses were selected and a synovial fluid sample was obtained from each one. Synovial fluid samples obtained were analyzed by a polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting using anti Trypanosoma cruzi Calreticulin (TcCRT) and anti Human Calreticulin (HuCRT) antibodies, allowing an antigenic recognition of the protein. TcCRT and HuCRT served as positive controls. Additionally, challenge between the equine synovial fluid and C1q of the human complement system was studied by western blot. Also, a combinatorial peptide ligand library technology assay was performed to deplete high concentration proteins, like albumin, which can mask and difficult the access to low concentration proteins. The aforementioned assay changed the synovial fluid electrophoretic pattern. Finally, the immunoreactive protein was studied by MALDI-TOF mass spectrometry and Raman spectroscopy. The western blot demonstrated a positive reaction that allowed detection of a band of 50 kDa when anti HuCRT antibody was used. The challenge to C1q did not generate a positive reaction evidencing a failed binding between EqCRT from synovial fluid with human C1q. The presence of CRT in the equine synovial fluid could not be confirmed by both mass spectrometry and Raman spectroscopy using the experimental design proposed for this study thus further investigation is required to fully identify the protein in the equine synovial fluid. The EqCRT was only recognized by anti HuCRT antibody, which was probably due to higher homology between the human and equine proteins. On the other hand, no reaction was evidenced when the EqCRT was challenged against C1q, nevertheless, that is attributable to an experimental design problem in which very low concentrations of protein were used so the western blot was not able to generate a detectable signal. Due to experimental design, it was not possible to fully confirm the presence of the protein in the equine synovial fluid from clinically healthy animals using Mass spectrometry and Raman spectroscopy. However, the information gathered in this study imply that CRT may be present in the synovial fluid of horses and it might be a protein involved in the homeostasis of joints but further investigation is required.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad degenerativa articular (EDA) u osteoartritis (OA) afecta el rendimiento de los equinos con las consecuentes pérdidas económicas. El trauma articular puede provocar la liberación de mediadores químicos que incluyen citoquinas y enzimas denominadas metaloproteinasas (MMPs), que pueden degradar la matriz extracelular (MEC), componente importante del cartílago articular. Un mecanismo de regulación en la degradación de la MEC lo constituye la acción de los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMPs), que son inhibidores naturales de las MMPs encontrados en varios tejidos y fluidos corporales. El balance que existe entre MMPs y TIMPs está involucrado en eventos normales y patológicos entre los cuales se encuentran la cicatrización, la remodelación de tejidos, la angiogénesis, tumorogénesis y metástasis. En éste estudio se analizaron muestras de líquido sinovial equino (LS) para comparar la cantidad de TIMP-1 de las articulaciones metacarpofalángicas normales y alteradas. Se trabajó con cuatro grupos de LS clasificados según las características del cartílago articular (CA) y de la membrana sinovial (MS). En el primer grupo se consideraron las muestras de LS cuya articulación presentaba el CA y la MS normales (NN), en el segundo grupo el CA normal y la MS alterada (NA), en el tercer grupo el CA alterado y la MS normal (AN) y en el último grupo el CA y la MS alterados (AA). Se encontró que los niveles de TIMP-1 fueron significativamente más altos en los LS provenientes de las articulaciones de equinos normales, tanto en membrana sinovial como en cartílago articular (NN), que en aquellos que al menos presentaban una alteración (AN, NA y AA).

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El óxido nítrico ( NO), producido en grandes cantidades por los ˙ condrocitos y células inflamatorias en una articulación dañada puede generar activación de enzimas degradativas de la matriz del cartílago, disminución en la síntesis de sus biomoléculas y apoptosis de condrocitos. Parte del ˙NO producido se transforma en nitrito, el cual se puede medir por la reacción de Griess. El objetivo de este estudio fue comparar el promedio de nitrito en líquido sinovial y suero sanguíneo entre grupos de equinos Fina Sangre de Carrera con cuadros articulares inflamatorios agudos y crónicos con reagudización, para establecer si la menor cantidad de cartílago articular en el caso de los cuadros crónicos se traduce en una menor concentración de nitrito tanto en LS como en suero sanguíneo. Se tomaron muestras de líquido sinovial y suero sanguíneo de equinos que cursaran con un cuadro inflamatorio agudo de la articulación carpal (n=10), principalmente fractura en chip o sinovitis diagnosticadas clínica y/o radiológicamente al momento de la toma de muestra, se incluyen equinos con diagnóstico de cuadro crónico al momento de la toma de muestra (n=15), desde la misma articulación. Además se obtuvo muestras de suero sanguíneo desde equinos normales para usarlos como control (n=10). En todas las muestras se determinó la concentración de nitrito por reacción de Griess y además se midió la concentración de proteínas como indicador del estado del animal por el método colorimétrico de Lowry et al. No se encontraron diferencias significativas en la concentración de proteínas en LS entre los grupos agudos (26,1 ± 6,2 mg/mL) y crónicos con reagudización (25,2 ± 8,1 mg/mL). Tampoco se encontraron diferencias significativas en la concentración de nitrito tanto en el LS Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message. 4 entre los grupos agudo (95,1 ± 41,4 μmol/L) y crónico con reagudización (75,8 ± 21,2 μmol/L) como en el suero con valores de 471,4 ± 115,4 μmol/L para los cuadros agudos en comparación con los cuadros crónicos con reagudización (427,9 ± 101,9 μmol/L) y con los cuadros normales (455,9 ± 91,1 μmol/L). Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) en los valores de proteínas séricas entre los grupos agudo y normal, pero a favor del grupo normal, obteniendo el grupo agudo un promedio de 56,5 ± 11,2 mg/mL, los normales 67,0 ± 3,1 mg/mL, y finalmente el grupo de los crónicos reagudizados con 60,7 ± 7,5 mg/mL. La concentración de nitrito en el líquido sinovial en los grupos agudo y crónico reagudizado no muestra diferencia significativa, lo que podría deberse a que ambos grupos están cursando un cuadro inflamatorio, que genera infiltración con células que también producen ˙NO. La ausencia de diferencia en la concentración de nitrito en el suero sanguíneo entre los grupos agudo, crónico reagudizado y normal, sugiriere que la concentración de nitrito en el suero sanguíneo no es un buen reflejo de la producción de ˙NO a nivel articular.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las Metaloproteinasas (MMPs) son una familia de endopeptidasas involucradas tanto en los procesos de remodelación tisular, como en la degradación de los componentes de la matriz extracelular. Las MMP-2 y MMP–9, conocidas también como gelatinasas, son capaces de degradar elementos de la matriz extracelular. Estas enzimas están asociadas a procesos degradativos como el que ocurre en la enfermedad degenerativa articular (EDA). Las MMPs son secretadas en forma zimógenas, expresadas como proMMPs. Este trabajo tiene como objetivo determinar la actividad gelatinolítica de MMP-2 y MMP-9 en el líquido sinovial (LS) de articulación del carpo y en suero sanguíneo (S) de equinos Fina Sangre de Carrera (FSC), con procesos articulares agudos y crónicos reagudizados. Se detecta y cuantifica la actividad mediante zimografía, y se comparan las actividades detectadas en ambos grupos de estudio. Se utilizó LS proveniente de la articulación del carpo y S de equinos FSC del Hipódromo Chile de dos grupos de animales. El primer grupo correspondió a equinos con inflamación aguda (grupo A, n = 10). El segundo grupo correspondió a aquellos con patología articular crónica re-agudizada (grupo C, n = 15). Además se obtuvieron 5 muestras de S desde ejemplares sin patología articular, a modo de referencia, y no para consideraciones estadísticas. Se midió la concentración de proteínas totales (PT) de cada muestra. Se determinó la actividad gelatinolítica de cada muestra mediante zimografía en gel de poliacrilamida al 8% con gelatina 0,1%. Estos geles fueron digitalizados y densitometrados, cuantificando el número de pixeles asociados a cada banda con actividad gelatinolítica. La actividad gelatinásica se expresó en unidades relativas a la muestra control cargada en cada gel (u.r.), y a las u.r. en relación a los mg de PT. Los resultados se presentaron como promedio de u.r.  desviación estándar, comparándose los distintos grupos mediante análisis de varianza (andeva). No se detectaron diferencias significativas entre el grupo A y C, tanto en LS como en S. Se detectó actividad de proMMP-2 en todas las muestras, y la actividad de la proMMP-9 fue detectada en todas las muestras de S pero sólo en un 80,8% de las muestras de LS. Respecto a la proMMP-2, no se detectó diferencia significativa en su actividad sérica entre los grupoa A y C, incluso al dividir por las PT. En los grupos A y C no se evidenció diferencia para la actividad proMMP-2 entre S y LS, pero al considerar las PT como denominador, se encontró que en el grupo A la actividad de la proMMP-2 es significativamente mayor en el LS que en el S. Tanto en el grupo A como en el C, la actividad de la proMMP-2 en el LS fue significativamente mayor que la de MMP-9. Dentro de las muestras en las que se detectó la proMMP-9, no se encontraron diferencias significativas entre la actividad de la proMMP-9 del LS entre los grupos A y C. La forma dímera de la MMP-9 en LS se detectó sólo en S, en 16 de sus muestras (61.5% del total de muestras de S estudiadas) En las muestras de S del grupo de ejemplares normales, ambas enzimas presentaron valores de actividad significativamente menores al compararlos con la de los grupos A y C. Las gelatinasas no cambian de manera importante su actividad gelatinolítica al comparar grupos con patologías articulares agudas, con ejemplares con patologías crónicas reagudizadas, tanto en el LS como en el S. Así también podemos concluir que las gelatinasas no se comportan igual en los distintos medios, teniendo mayor actividad la MMP-9 en S y la MMP-2 en LS. Al tener el S de ejemplares normales una menor actividad gelatinolítica, queda como posibilidad el uso de gelatinasas en S como marcadores de daño articular

A atividade física, dependendo da intensidade e duração, provoca uma resposta inflamatória nos tecidos articulares dos eqüinos. Como ocorre nos cavalos de pólo que percorrem grandes distâncias em alta velocidade com paradas bruscas do movimento, submetendo suas articulações a esforços intensos e constantes. A finalidade deste trabalho foi avaliar os efeitos da atividade esportiva no metabolismo articular, por meio de exame físico, das dosagens de mediador inflamatório (PGE2) e citocinas (IL-1 e TNF-&alpha;), da concentração de glicose, proteína total e da análise quantitativa e qualitativa das células presentes no líquido sinovial de 20 eqüinos atletas em três estágios diferentes de treinamento, a cada 30 dias, durante o período de 360 dias: animais sem treinamento (grupo controle), animais em início de treinamento (G1) e animais com mais de 5 anos de treinamento (G2). Além disso, estabelecer uma relação entre os resultados laboratoriais com os exames radiográficos e ultra-sonográficos articulares. Numa segunda fase do experimento foi avaliado o líquido sinovial de oito eqüinos atletas antes do exercício e 3, 6 e 24 horas após o término deste. As principais alterações foram encontradas nos animais do G2, ou seja, aumento da circunferência articular (P<0,05), mudança da coloração do líquido sinovial (P<0,05), maior volume de líquido sinovial obtido das articulações metacarpofalangeanas (P<0,05), aumento nas concentrações de proteína (P<0,05), glicose (P<0,05) e PGE2 (P<0,05). Concomitantemente, estes animais apresentaram aumento de volume dos tecidos moles periarticulares, osteófitos, esclerose óssea e diminuição da flexão articular (P<0,05) nos exames radiográficos; além de maior espessura e menor homogeneidade da cápsula articular fibrosa, e maior quantidade de líquido articular visualizado nos exames ultra-sonográficos (P<0,05). Já a expressão dos receptores de TNF do tipo II foi maior nas células do líquido sinovial dos animais do G1. Os animais dos grupos 1 e 2 apresentaram maior porcentagem de macrófagos e sinoviócitos (P<0,05), do que os animais do grupo controle. Na segunda fase do experimento, foram observadas às 3 e 6 horas mudanças na coloração do líquido sinovial (P<0,05), diminuição no volume obtido (P<0,05), diminuição da concentração de glicose (P<0,05), aumento na concentração de proteína total (P<0,05), aumento na concentração de PGE2 (P<0,05). As células do líquido sinovial apresentaram intensidade acentuada de marcação para os receptores de TNF do tipo II também após 3 horas do término do exercício. Conclui-se que um processo inflamatório articular é desencadeado após o exercício intenso, e a resposta dos tecidos articulares frente a este insulto mecânico, com maior intensidade 3 horas após o término da atividade esportiva, e retornando aos valores basais 24 horas após, revela a excelente adaptação articular ao estresse físico. Esta adaptação também foi observada a longo prazo, em cavalos com maior tempo de carreira esportiva, ou seja, estes animais podem apresentar alterações articulares sem sinais de dor e claudicação. Contudo, isto não impede que cavalos com carreira atlética longa desenvolvam osteoartrite. / Physical activity causes an inflammatory response in joints depending on intensity and duration of the exercise. Polo ponies, for example, cross large distances at high speed, with abrupt stops of movement, subjecting the joints to intense and constant effort. The purpose of this study was to evaluate the effects of the sporting activity on joint metabolism, by means of physical examination, measurements of inflammatory mediator (PGE2) and cytokines (IL-1 and TNF-&alpha;), glucose and total protein concentrations, and quantitative and qualitative analyses of synovial fluid cells of 20 athletic horses on 3 different stages of training, every 30 days, during a period of 360 days: animals without training (control group), animals in the beginning to train (G1), and animals with more than five years of training (G2). Moreover, the study aimed to establish a relationship between laboratorial results and radiographic and ultrasonographic exams. In a second phase of the trial, synovial fluid analysis was done from samples of eight athletic horses before, and 3, 6 and 24 hours after exercise. Main alterations were found in horses of group 2, which were increase in joint circumference (P<0.05), alteration of the synovial fluid color (P<0.05), greater synovial fluid volume, obtained from metacarpophalangeal joints (P<0.05), greater protein (P<0.05), glucose (P<0.05), and PGE2 (P<0.05) concentrations. Concomitantly, these animals showed an increase of the periarticular soft tissues, ostephytes, subchondral bone sclerosis, and a diminished joint flexion in radiographic exams (P<0.05), and also a thick and less homogeneous articular capsule, and an increase of the joint fluid quantity in ultrasonographic exams (P<0.05). The TNF type II receptor expression was greater in synovial fluid cells of group 1 horses. Horses of the groups 1 and 2 showed greater percentage of macrophages and synoviocytes (P<0.05) than the animals of the control group. In the second phase of the study, it was observed a change of the synovial fluid color at 3 and 6 hours post-exercise (P<0.05), reduction of the obtained volume (P<0.05) and glucose concentration (P<0.05), and an increase of total protein (P<0.05) and PGE2 (P<0.05) concentrations. Also, the synovial fluid cells showed an accentuated intensity of markers for TNF type II receptor 3 hours after sports activity was finished. An inflammatory process of the joint is triggered after intense exercise, but the response of the articular tissue facing this mechanical insult, more intense within 3 hours after the end of the sports activity, and the return to basal values after 24 hours, reveal the excellent adaptation of the articular tissue to physical stress. This adaptation can also be observed in animals with more time of sports career, which can have articular changes without signs of pain or lameness. Nevertheless, this doesn\'t prevent horses with longer sports careers to develop osteoarthritis.

A ozonioterapia consiste na aplicação de ozônio medicinal, uma mistura de ozônio e oxigênio, que através das espécies reativas de oxigênio e produtos de lipoperoxidação exercem diversos efeitos no organismo como, melhora da oxigenação e metabolismo dos tecidos, angiogênese, aumento dos mecanismos antioxidantes, melhora do sistema imune, efeito anti-inflamatório, entre outros. Esta modalidade terapêutica já é amplamente estudada na medicina humana e vem sendo aplicada na medicina esportiva equina no tratamento de osteoartrite, porém sem estudos expressivos que comprovem sua segurança e eficácia. O objetivo do presente estudo é analisar os efeitos inflamatório e oxidante do ozônio medicinal em articulações sinoviais de equinos hígidos. Para tanto foram utilizadas 24 articulações tibiotársicas distribuídas aleatoriamente em três grupos. Nos grupos tratados foram realizadas três aplicações semanais de 15 ml de ozônio medicinal na concentração de 20 (GA) e 40 &micro;g/ml (GB), no total de 10 aplicações. Já no grupo controle, as articulações receberam três aplicações semanais de 15 ml de O2 (GC), também no total de dez aplicações. Foram realizados exames físico, de claudicação e ultrassonográfico, bem como análise do líquido sinovial, incluindo contagem total de células nucleadas e quantificação de proteína total, prostaglandina E2, Substância P, interleucina-1, interleucina-6, interleucina 10, fator de necrose tumoral-&#945;, ácido hialurônico (concentração e peso molecular) e condroitim sulfato. Para avaliação antioxidante no líquido sinovial foi determinada a atividade da superóxido desmutase e o burst oxidativo. Houve aumento da temperatura em GA e GB, os animais de GB apresentaram maior claudicação comparado aos demais grupos e observou-se aumento em todos os grupos dos escores ultrassonográficos. Na análise do líquido sinovial observou-se aumento nas contagens celulares de GA e GB, acompanhado de polimorfonucleares em GB, aumento da concentração de proteína no GA e GB, da atividade da superóxido desmutase e do índice de ativação em GA e diminuição da concentração de ácido hialurônico em todos os grupos e condroitim sulfato em GB e GC. Não houve diferença nas concentrações de PGE2, substância P, IL-1, IL-6, IL-10 e TNF-&#945;. A aplicação consecutiva do ozônio medicinal intra-articular provocou alterações ultrassonográficas e no exame de claudicação, mais perceptível na dose de 40 ug/mL. Estas alterações estão mais relacionadas à distensão articular causada pela infusão de gases do que aos efeitos inflamatórios provindos do O3, uma vez que as análises de líquido sinovial não mostraram relevante inflamação. Conclui-se que a aplicação intra-articular de ozônio medicinal em equinos é segura em ambas as doses, e que experimentos devem ser realizados utilizando-se animais com diferentes doenças articulares, para que os benefícios da ozonioterapia sejam evidenciados e compreendidos. / Ozone therapy consists of the application of medicinal ozone, a mixture of ozone and oxygen, which through reactive oxygen species and products of lipoperoxidation exert various effects on the body, such as improvement of tissue oxygenation and metabolism, angiogenesis, increase of antioxidant mechanisms, improvement of the immune system, anti-inflammatory effect, among others. This therapeutic modality is already widely studied in human medicine and has been applied in equine sports medicine in the treatment of osteoarthritis, but without expressive studies that prove its safety and efficacy. The objective of the present study is to analyze the inflammatory and oxidizing effects of medicinal ozone on synovial joints of healthy horses. Twenty-four tibiotarsic joints were randomly distributed in three groups. In the treated groups three weekly applications of 15 ml of medicinal ozone in the concentration of 20 (GA) and 40&micro;g / ml (GB) were carried out for a total of 10 applications. Already in the control group, the joints received three weekly applications of 15 ml of O2 (GC), also in the total of 10 applications. Physical, lameness and ultrasound examinations were performed, as well as synovial fluid analysis, including total nucleated cell count and quantification of total protein, prostaglandin E2, Substance P, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-10, tumor necrosis factor-&#945;, hyaluronic acid (concentration and molecular weight) and chondroitin sulfate. For the antioxidant evaluation in the synovial fluid, the activity of the superoxide dismutase and the oxidative burst was determined. There was an increase in temperature in GA and GB, GB animals presented greater lameness compared to the other groups and an increase was observed in all groups of ultrasound scores. In the synovial fluid analysis, GA and GB cell counts were observed, followed by polymorphonuclear cells in GB, increased protein concentration in GA and GB, superoxide desmutase activity and activation index in GA, and decrease in concentration of Hyaluronic acid in all groups and chondrocyte sulfate in GB and CG. There was no difference in the concentrations of PGE2, substance P, IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-&#945;. The consecutive application of intra-articular medicinal ozone caused ultrasonography changes and lameness, more noticeable at 40 ug / mL. These changes related more to joint distension caused by gas infusion than to inflammatory effects from O3, since synovial fluid analyzes did not show relevant inflammation. It is concluded that the intra-articular application of medical ozone in horses is safe in both doses, and that experiments must be performed using animals with different joint diseases, so that the benefits of ozonotherapy are evidenced and understood.