京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(工学) / 乙第13581号 / 論工博第4212号 / 新制||工||1990(附属図書館) / (主査)教授 松原 誠二郎, 教授 中尾 佳亮, 教授 浦山 健治 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DFAM

Objetivos: Avaliar a adequabilidade do modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) (NOLTING et al., 1996b) para modelar o efeito bactericida da piperacilina (PIP) em ratos Wistar infectados experimentalmente com Escherichia coli ATCC 25922. Metodologia: Experimentos de Farmacocinética: Determinou-se as concentrações plasmáticas totais e livres teciduais de PIP, através de microdiálise (MD), após administração de 240 mg/kg i.v. bolus a ratos Wistar granulocitopênicos (ciclofosfamida) infectados no músculo esquelético (105 UFC/mL) com E. coli. As amostras de plasma e de MD foram analisadas por CLAE. As sondas de MD foram calibradas por retrodiálise. Experimentos de Farmacodinâmica: Os animais imunodeprimidos e infectados foram tratados com PIP nas doses de 120 ou 240 mg/kg, em intervalos de 4/4, 6/6 e 8/8 horas por 24 h. Em tempos pré-determinados, os animais foram sacrificados (n = 3/tempo), o músculo infectado foi retirado, homogeneizado e o número de UFC/mL foi determinado em placas de ágar-sangue, após diluições sucessivas. Um grupo não tratado foi utilizado como controle. Modelagem PK-PD: A partir dos dados farmacocinéticos e farmacodinâmicos obtidos, avaliou-se efeito de morte bacteriana em função do tempo com o auxílio do programa de regressão não-linear SCIENTIST® v.2.0. Resultados e Discussão: Os parâmetros farmacocinéticos após a administração de PIP (240 mg/kg) foram t½ de 40 ± 8 min; CL de 0,46 ± 0,021 (L/h/kg) e um Vdss de 0,30 ± 0,06 L/kg. O perfil de PIP livre tecidual foi previsto a partir dos parâmetros plasmáticos utilizando ajuste simultâneo dos dados de plasma e tecido e um fator de proporcionalidade de 0,342 ± 0,101. Os parâmetros do modelo PK-PD obtidos foram: EC50 de 1,31 ± 0,27 μg/mL e kmax 1,39 ± 0,20 h-1. Os valores dos parâmetros da modelagem PK-PD obtidos in vivo diferiram dos descritos na literatura para o mesmo antibiótico e bactéria quando simulados in vitro. Conclusões: O modelo Emax-modificado descreveu os perfis de crescimento e morte bacteriana em função do tempo obtidos nas diferentes posologias testadas sendo adequado para modelagem PK-PD da piperacilina nas condições experimentais investigadas. / Purpose: The objective of this study was to model the killing effect of a β-lactam antibiotic, piperacillin (PIP), in neutropenic and E. coli ATCC 25922 infected rats after different dosing regimens using a modified Emax PK-PD model. Methodology: Pharmacokinetic studies: Total plasma and free tissue concentrations of PIP, determined by microdialysis, were investigated after i.v. bolus of 240 mg/kg of the drug to immunecompromised (cyclophosphamide) and E. coli infected (107 CFU) Wistar rats. Microdialysis probes recoveries were determined by retrodialysis. Plasma and tissue samples were analyzed by HPLC. Pharmacodynamic studies: The infected rats were treated with iv bolus PIP 120 mg/kg or 240 mg/kg q8h, q6h, q4h. Three animals were sacrificed at predetermined times up to 24 hours. The infected muscle was removed, homogenized and the number of CFU/mL was determined by plate counting after 24 hours of incubation at 37ºC. A control group without treatment was used. PK-PD modeling: PIP killing effect as a function of time was fitted using the Emax-modified model with the aid of a non-linear regression computer program SCIENTIST® v.2.0. Results and Discussion: The pharmacokinetic parameters determined for PIP 240 mg/kg iv bolus were: t½ of 40 ± 8 min; CL of 0.46 ± 0.021 (L/h/kg) and Vdss of 0.30 ± 0.06 L/kg. Piperacillin free tissue levels were predicted using plasma data ina a simultaneous fitting with a proportionality factor of 0.342 ± 0.101. The parameters derived from PK-PD modeling were: bacterial killing rate (kmax) of 1.39 ± 0.20 h-1 concentration to produce 50% of de maximum effect (EC50) of 1.31 ± 0.27 μg/mL. The PK-PD parameters determined in vivo were different from those reported for the same bacteria and drug in vitro. Conclusions: The Emax model adequately described PIP antibacterial effect in animals for the different dosing regimens investigated.

Objetivos: Avaliar a adequabilidade do modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) (NOLTING et al., 1996b) para modelar o efeito bactericida da piperacilina (PIP) em ratos Wistar infectados experimentalmente com Escherichia coli ATCC 25922. Metodologia: Experimentos de Farmacocinética: Determinou-se as concentrações plasmáticas totais e livres teciduais de PIP, através de microdiálise (MD), após administração de 240 mg/kg i.v. bolus a ratos Wistar granulocitopênicos (ciclofosfamida) infectados no músculo esquelético (105 UFC/mL) com E. coli. As amostras de plasma e de MD foram analisadas por CLAE. As sondas de MD foram calibradas por retrodiálise. Experimentos de Farmacodinâmica: Os animais imunodeprimidos e infectados foram tratados com PIP nas doses de 120 ou 240 mg/kg, em intervalos de 4/4, 6/6 e 8/8 horas por 24 h. Em tempos pré-determinados, os animais foram sacrificados (n = 3/tempo), o músculo infectado foi retirado, homogeneizado e o número de UFC/mL foi determinado em placas de ágar-sangue, após diluições sucessivas. Um grupo não tratado foi utilizado como controle. Modelagem PK-PD: A partir dos dados farmacocinéticos e farmacodinâmicos obtidos, avaliou-se efeito de morte bacteriana em função do tempo com o auxílio do programa de regressão não-linear SCIENTIST® v.2.0. Resultados e Discussão: Os parâmetros farmacocinéticos após a administração de PIP (240 mg/kg) foram t½ de 40 ± 8 min; CL de 0,46 ± 0,021 (L/h/kg) e um Vdss de 0,30 ± 0,06 L/kg. O perfil de PIP livre tecidual foi previsto a partir dos parâmetros plasmáticos utilizando ajuste simultâneo dos dados de plasma e tecido e um fator de proporcionalidade de 0,342 ± 0,101. Os parâmetros do modelo PK-PD obtidos foram: EC50 de 1,31 ± 0,27 μg/mL e kmax 1,39 ± 0,20 h-1. Os valores dos parâmetros da modelagem PK-PD obtidos in vivo diferiram dos descritos na literatura para o mesmo antibiótico e bactéria quando simulados in vitro. Conclusões: O modelo Emax-modificado descreveu os perfis de crescimento e morte bacteriana em função do tempo obtidos nas diferentes posologias testadas sendo adequado para modelagem PK-PD da piperacilina nas condições experimentais investigadas. / Purpose: The objective of this study was to model the killing effect of a β-lactam antibiotic, piperacillin (PIP), in neutropenic and E. coli ATCC 25922 infected rats after different dosing regimens using a modified Emax PK-PD model. Methodology: Pharmacokinetic studies: Total plasma and free tissue concentrations of PIP, determined by microdialysis, were investigated after i.v. bolus of 240 mg/kg of the drug to immunecompromised (cyclophosphamide) and E. coli infected (107 CFU) Wistar rats. Microdialysis probes recoveries were determined by retrodialysis. Plasma and tissue samples were analyzed by HPLC. Pharmacodynamic studies: The infected rats were treated with iv bolus PIP 120 mg/kg or 240 mg/kg q8h, q6h, q4h. Three animals were sacrificed at predetermined times up to 24 hours. The infected muscle was removed, homogenized and the number of CFU/mL was determined by plate counting after 24 hours of incubation at 37ºC. A control group without treatment was used. PK-PD modeling: PIP killing effect as a function of time was fitted using the Emax-modified model with the aid of a non-linear regression computer program SCIENTIST® v.2.0. Results and Discussion: The pharmacokinetic parameters determined for PIP 240 mg/kg iv bolus were: t½ of 40 ± 8 min; CL of 0.46 ± 0.021 (L/h/kg) and Vdss of 0.30 ± 0.06 L/kg. Piperacillin free tissue levels were predicted using plasma data ina a simultaneous fitting with a proportionality factor of 0.342 ± 0.101. The parameters derived from PK-PD modeling were: bacterial killing rate (kmax) of 1.39 ± 0.20 h-1 concentration to produce 50% of de maximum effect (EC50) of 1.31 ± 0.27 μg/mL. The PK-PD parameters determined in vivo were different from those reported for the same bacteria and drug in vitro. Conclusions: The Emax model adequately described PIP antibacterial effect in animals for the different dosing regimens investigated.

Objetivos: Avaliar a adequabilidade do modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) (NOLTING et al., 1996b) para modelar o efeito bactericida da piperacilina (PIP) em ratos Wistar infectados experimentalmente com Escherichia coli ATCC 25922. Metodologia: Experimentos de Farmacocinética: Determinou-se as concentrações plasmáticas totais e livres teciduais de PIP, através de microdiálise (MD), após administração de 240 mg/kg i.v. bolus a ratos Wistar granulocitopênicos (ciclofosfamida) infectados no músculo esquelético (105 UFC/mL) com E. coli. As amostras de plasma e de MD foram analisadas por CLAE. As sondas de MD foram calibradas por retrodiálise. Experimentos de Farmacodinâmica: Os animais imunodeprimidos e infectados foram tratados com PIP nas doses de 120 ou 240 mg/kg, em intervalos de 4/4, 6/6 e 8/8 horas por 24 h. Em tempos pré-determinados, os animais foram sacrificados (n = 3/tempo), o músculo infectado foi retirado, homogeneizado e o número de UFC/mL foi determinado em placas de ágar-sangue, após diluições sucessivas. Um grupo não tratado foi utilizado como controle. Modelagem PK-PD: A partir dos dados farmacocinéticos e farmacodinâmicos obtidos, avaliou-se efeito de morte bacteriana em função do tempo com o auxílio do programa de regressão não-linear SCIENTIST® v.2.0. Resultados e Discussão: Os parâmetros farmacocinéticos após a administração de PIP (240 mg/kg) foram t½ de 40 ± 8 min; CL de 0,46 ± 0,021 (L/h/kg) e um Vdss de 0,30 ± 0,06 L/kg. O perfil de PIP livre tecidual foi previsto a partir dos parâmetros plasmáticos utilizando ajuste simultâneo dos dados de plasma e tecido e um fator de proporcionalidade de 0,342 ± 0,101. Os parâmetros do modelo PK-PD obtidos foram: EC50 de 1,31 ± 0,27 μg/mL e kmax 1,39 ± 0,20 h-1. Os valores dos parâmetros da modelagem PK-PD obtidos in vivo diferiram dos descritos na literatura para o mesmo antibiótico e bactéria quando simulados in vitro. Conclusões: O modelo Emax-modificado descreveu os perfis de crescimento e morte bacteriana em função do tempo obtidos nas diferentes posologias testadas sendo adequado para modelagem PK-PD da piperacilina nas condições experimentais investigadas. / Purpose: The objective of this study was to model the killing effect of a β-lactam antibiotic, piperacillin (PIP), in neutropenic and E. coli ATCC 25922 infected rats after different dosing regimens using a modified Emax PK-PD model. Methodology: Pharmacokinetic studies: Total plasma and free tissue concentrations of PIP, determined by microdialysis, were investigated after i.v. bolus of 240 mg/kg of the drug to immunecompromised (cyclophosphamide) and E. coli infected (107 CFU) Wistar rats. Microdialysis probes recoveries were determined by retrodialysis. Plasma and tissue samples were analyzed by HPLC. Pharmacodynamic studies: The infected rats were treated with iv bolus PIP 120 mg/kg or 240 mg/kg q8h, q6h, q4h. Three animals were sacrificed at predetermined times up to 24 hours. The infected muscle was removed, homogenized and the number of CFU/mL was determined by plate counting after 24 hours of incubation at 37ºC. A control group without treatment was used. PK-PD modeling: PIP killing effect as a function of time was fitted using the Emax-modified model with the aid of a non-linear regression computer program SCIENTIST® v.2.0. Results and Discussion: The pharmacokinetic parameters determined for PIP 240 mg/kg iv bolus were: t½ of 40 ± 8 min; CL of 0.46 ± 0.021 (L/h/kg) and Vdss of 0.30 ± 0.06 L/kg. Piperacillin free tissue levels were predicted using plasma data ina a simultaneous fitting with a proportionality factor of 0.342 ± 0.101. The parameters derived from PK-PD modeling were: bacterial killing rate (kmax) of 1.39 ± 0.20 h-1 concentration to produce 50% of de maximum effect (EC50) of 1.31 ± 0.27 μg/mL. The PK-PD parameters determined in vivo were different from those reported for the same bacteria and drug in vitro. Conclusions: The Emax model adequately described PIP antibacterial effect in animals for the different dosing regimens investigated.

On the chromosomal DNA of the microorganism Achromobacter sp. CCM 4824, which was gained in the Laboratory of enzyme technology MBU AVCR v.v.i., there was identified a gene coding an enzyme capable of hydrolyzation of semi-synthetic β-lactam antibiotics ampicillin and cephalosporin with a D-phenylglycine as a side chain. This enzyme belongs to a group of α-amino acid esterases, which are interesting because of a potential use in kinetically controled synthesis of β-lactam antibiotics. In several aspects α-amino acid esterases might be better than actually used penicillin acylases and that is why these enzymes are subjects of a big interest. The gene for α-amino acid esterase coded by chromosomal DNA was cloned, characterized and heterologously expressed in constructed highly-producing bacterial system Escherichia coli BL21(DE3)JM5. Produced enzyme was purified and its properties important for possible use in the production of semi-synthetic β-lactam antibiotics were determined. Key words: alpha-amino acid ester hydrolase, Achromobacter sp., recombinant expression system, β-lactam antibiotics

Tesis por compendio / [ES] El diagnóstico de alergias a antibióticos ß-lactámicos incluye el uso de pruebas in vivo no satisfactorias ya que consumen mucho tiempo y conllevan el riesgo de provocar una nueva reacción alérgica. Por otro lado, los métodos in vitro basados en la inmunodetección de IgE alérgeno-específica generan una información muy valiosa, confirmando o descartando la alergia y postulándose como una alternativa de diagnóstico segura. A pesar de ello, las pruebas in vitro actuales carecen de sensibilidad y exactitud, con un 81% de falsos negativos, lo que limita su uso diagnóstico. Esto ha desencadenado una creciente demanda de nuevas pruebas in vitro basadas en la inmunodetección de IgE, el biomarcador presente en suero más estudiado en alergia. Sin embargo, la falta de estándares de referencia de IgE alérgeno-específica ha imposibilitado la validación y estandarización de los métodos, lo que hace que los resultados de las distintas pruebas no sean comparables. Además, dicha falta de estándares de referencia hace que las concentraciones de IgE específica se calculen a partir de una curva de calibración de IgE total mediante una interpolación heteróloga, lo que ha demostrado no ser totalmente correcto. Por los motivos mencionados, en esta tesis doctoral se plantea como objetivo principal el diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes con reactividad frente a antibióticos ß-lactámicos. Esta investigación comienza con la puesta a punto de un inmunoensayo en placa ELISA con detección quimioluminiscente para la cuantificación de IgE específica. El ensayo desarrollado permitió determinar IgE específica por debajo de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), permitiendo así la identificación de pacientes alérgicos con una mayor sensibilidad, utilizando solo 25 ¿L de muestra (suero). El inmunoensayo mostró una buena sensibilidad (64.6%), así como una excelente especificidad (100%), que mejoran significativamente el carácter predictivo de las pruebas in vitro existentes. A continuación, se abordó la obtención y caracterización de proteínas recombinantes similares a las IgE específicas de los ß-lactámicos utilizando la metodología Phage Display. La primera aproximación se trata de una proteína formada por dos nanoanticuerpos que mimetiza el comportamiento de una IgE específica. De esta manera, se obtuvieron proteínas recombinantes en las que uno de los nanoanticuerpos reconoce selectivamente un determinante antigénico de un antibiótico ß-lactámico, mientras que el otro reconoce específicamente al parátopo de un anticuerpo detector anti-IgE. Estas construcciones resultaron ser estables y funcionales. El papel de estas proteínas recombinantes como calibrador homólogo se estudió determinando la concentración de IgE específica a penicilina G presente en suero mediante un ensayo quimioluminiscente. El método desarrollado duplicaba la sensibilidad clínica (66%) frente al método de referencia (28%), mientras que mantenía una especificidad clínica del 100%. Alcanzado este punto, la tesis se centró en la producción de IgE específica recombinante utilizando como material de partida el ADN de un paciente alérgico a amoxicilina y penicilina G. A partir del material genético aislado, mediante Phage Display, ingeniería de anticuerpos y métodos de expresión en células de insecto se consiguió producir una IgE específica recombinante. De esta manera, se obtuvo un producto biológico que cumple con los requisitos para su adopción como material de referencia en ensayos in vitro. Igualmente, se utilizó como calibrador homólogo para la determinación de IgE específica a amoxicilina. Se alcanzó un límite de detección de 0.05 IU/mL con el que se conseguía un aumento de la sensibilidad clínica (73%) que cuadruplicaba al método de referencia (16%), manteniendo la especificidad clínica en el 100%. / [CA] El diagnòstic d'al·lèrgies a antibiòtics ß-lactàmics inclou l'ús de proves in vivo no satisfactòries, ja que consumeixen molt de temps i comporten el risc de provocar una nova reacció al·lèrgica. D'altra banda, els mètodes in vitro basats en la immunodetecció d'IgE al·lergen-específica generen una informació molt valuosa, confirmant o descartant l'al·lèrgia i postulant-se com una alternativa de diagnòstic segura. Tanmateix, a les proves in vitro actuals hi ha una manca de sensibilitat i exactitud, amb un 81% de falsos negatius, cosa que en limita l'ús diagnòstic. Tot això ha desembocat en una demanda creixent de noves proves in vitro basades en la immunodetecció d'IgE, el biomarcador present en sèrum més estudiat en al·lèrgia. No obstant això, la manca d'estàndards de referència d'IgE al·lergen-específica ha impossibilitat la validació i estandardització dels mètodes, cosa que fa que els resultats de les diferents proves no siguen comparables. A més, aquesta manca d'estàndards de referència fa que les concentracions d'IgE específica es calculen a partir d'una corba de calibratge d'IgE total mitjançant una interpolació heteròloga, un mètode que ha demostrat no ser totalment correcte ja que no es pren en consideració la interacció entre el determinant antigènic i la IgE específica. Pels motius mencionats, en aquesta tesi doctoral es planteja com a objectiu principal el disseny, l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants amb reactivitat davant dels antibiòtics ß-lactàmics. Aquesta investigació comença amb la posada a punt d'un immunoassaig en placa ELISA amb detecció quimioluminiscent per a la quantificació d'IgE específica. L'assaig desenvolupat va permetre determinar IgE específica per baix de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), el que permet la identificació de pacients al·lèrgics amb més sensibilitat, utilitzant només 25 ¿L de mostra (sèrum). L'immunoassaig mostra una bona sensibilitat (64.6%), així com una excel·lent especificitat (100%), que milloren significativament el caràcter predictiu de les proves in vitro existents. A continuació, es va abordar l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants similars a les IgE específiques dels ß-lactàmics utilitzant la metodologia Phage Display. La primera aproximació és una proteïna formada per dos nanoanticossos que mimetitza el comportament d'una IgE específica. D'aquesta manera, es van obtenir proteïnes recombinants en què un dels nanoanticossos reconeix selectivament un determinant antigènic d'un antibiòtic ß-lactàmic, mentre que l'altre reconeix específicament el paràtop d'un anticòs detector anti-IgE (Omalizumab). Aquestes construccions van resultar estables i funcionals. El paper d'aquestes proteïnes recombinants com a calibrador homòleg es va estudiar determinant la concentració d'IgE específica a penicil·lina G present en sèrum mitjançant un assaig quimioluminiscent. El mètode desenvolupat duplicava la sensibilitat clínica (66%) respecte del mètode de referència (28%), mentre que mantenia una especificitat clínica del 100%. Assolit aquest punt, la tesi es va centrar en la producció d'IgE específica recombinant utilitzant com a material de partida l'ADN d'un pacient al·lèrgic a amoxicil·lina i penicil·lina G. En combinació amb la metodologia Phage Display, enginyeria d'anticossos i mètodes d'expressió en cèl·lules d'insecte, es va aconseguir produir una IgE específica recombinant. D'aquesta manera, es va obtenir un producte biològic que compleix els requisits per ser adoptat com a material de referència en assajos in vitro. Igualment, es va utilitzar com a calibrador homòleg per a la determinació d'IgE específica a amoxicil·lina. Es va assolir un límit de detecció de 0.05 IU/mL amb què s'aconseguia un augment de la sensibilitat clínica (73%) que quadriplicava al mètode de referència (16%), mantenint l'especificitat clínica al 100%. / [EN] The diagnosis of ß-lactam antibiotics allergy involves using unsatisfactory in vivo tests that are time-consuming and carry the risk of triggering a new allergic reaction. On the other hand, in vitro methods based on allergen-specific IgE immunodetection generate precious information, confirming or ruling out allergies and postulating themselves as a safe diagnostic alternative. Despite this, current in vitro tests lack sensitivity and accuracy, with 81% false negatives limiting their diagnostic use. This has led to a growing demand for new in vitro tests based on the immunodetection of IgE, the most studied biomarker in serum allergy. However, the lack of reference standards for allergen-specific IgE has made it impossible to validate and standardize methods, which means that the results of the different tests are not comparable. Furthermore, this lack of reference standards means that specific IgE concentrations are calculated from a total IgE calibration curve by heterologous interpolation, which has been shown not to be entirely correct. For the reasons mentioned above, the main objective of this doctoral thesis is to design, obtain and characterize recombinant proteins with reactivity against ß-lactam antibiotics. This research begins with developing an ELISA immunoassay with chemiluminescent detection for quantifying specific IgE. The assay developed allowed the determination of specific IgE below 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), thus allowing the identification of allergic patients with greater sensitivity, using only 25 µL of sample (serum). The immunoassay showed good sensitivity (64.6%) and excellent specificity (100%), significantly improving the predictive character of existing in vitro tests. Next, the obtaining and characterizing recombinant proteins similar to ß-lactam-specific IgE was approached using the Phage Display methodology. The first approach deals with a protein consisting of two single-domain antibodies that mimics the behavior of a specific IgE. In this way, recombinant proteins were obtained in which one of the nanobodies selectively recognizes an antigenic determinant of a ß-lactam antibiotic, while the other specifically recognizes the paratope of an anti-IgE detector antibody. These constructs were found to be stable and functional. The role of these recombinant proteins as a homologous calibrator was studied by determining the concentration of penicillin G-specific IgE present in serum by employing a chemiluminescent assay. The developed method doubled the clinical sensitivity (66%) compared to the reference method (28%), while maintaining a clinical specificity of 100%. At this point, the thesis focused on the production of recombinant specific IgE using as starting material the DNA of a patient allergic to amoxicillin and penicillin G. in combination with the Phage Display, antibody engineering and expression methods in insect cells, a recombinant-specific IgE was produced. In this way, a biological product was obtained that meets the requirements for its adoption as reference material in in vitro assays. Likewise, it was used as a homologous calibrator for the determination of specific IgE to amoxicillin. A detection limit of 0.05 IU/mL was achieved, which increased clinical sensitivity (73%) fourfold compared to the reference method (16%), while maintaining clinical specificity at 100%. / This work was supported by CSIC 2007-348, ANII FMV 2019_156321, and ANII FMV 2018_148245. P.Q.-C. acknowledges financial support from Generalitat Valenciana through the research staff training program (GVA ACIF/2018/173). This research was also funded by Agencia Estatal de Investigación (PID2019-110713RB-I00, FEDER), program UPV-La FE 2019 (P105 VALBIOAL), and PROMETEO/ 2020/094 / Quintero Campos, P. (2022). Diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes a partir de determinantes antigénicos asociadas a reacciones alérgicas a ß-lactámicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191429 / Compendio

Antibiotika sind für die Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten in der Human- und Veterinärmedizin von immenser Bedeutung. Angesichts der Korrelation zwischen Antibiotika-Einsatzmengen und der Häufigkeit resistenter Organismen ist eine unsachgemäße bzw. übermäßige Verwendung dieser antibakteriellen Wirkstoffe sowie deren Eintrag über die Kläranlagen in die Umwelt äußerst problematisch. Neben Vermeidungs- und Verminderungsstrategien besteht ein Ansatz zur Problemlösung in der Entwicklung innovativer Technologien zur Entfernung von Antibiotikarückständen aus Wässern, da konventionelle Kläranlagen dieser Anforderung nicht vollständig genügen. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und charakterisierte biologische Verfahren basiert auf genetisch modifizierten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, welche spezielle Enzyme sezernieren, die zur Umsetzung von Antibiotika herangezogen werden können. Als Modellsystem diente die enzymatische Hydrolyse des β-Lactam-Antibiotikums Ampicillin mit der β-Lactamase TEM-1. Unter Verwendung von enzymhaltigen Hefe-Kulturüberständen gelang es, die grundsätzliche Eignung des Systems zur Entfernung dieses Antibiotikums nachzuweisen. Untersuchungen mit weiteren β-Lactam-Antibiotika zeigten in Übereinstimmung mit der Literatur, dass TEM-1 Penicilline und Cephalosporine der 1. Generation hydrolysieren kann. Am Beispiel der TEM-8 wurde die Übertragbarkeit des Expressionssystems auf andere Lactamase-Varianten erfolgreich demonstriert. Das erweiterte Wirkspektrum dieses Enzyms, welches neben Penicillinen auch Monobactame und Cephalosporine bis zur 4. Generation umfasst, konnte bestätigt werden. Eine mittels Histidin-tag gereinigte TEM-1-His wurde eingesetzt, um systematisch den Einfluss verschiedener Faktoren, wie Temperatur, Substratkonzentration oder pH-Wert, unbeeinflusst von der Matrix der Hefe-Kulturüberstände untersuchen zu können. In diesem Zusammenhang wurde auch die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Modell- auf Realwässer, wie Kläranlagenzu- und -ablauf, untersucht, mit dem Ergebnis, dass zumindest die TEM-1 temporär in allen getesteten Matrices aktiv ist. Mit dem Ziel, auch weitere Antibiotikaklassen transformieren zu können, wurden Esterase Ere-A-produzierende Zellen zur Umsetzung von Makrolid-Antibiotika, wie Erythromycin, herangezogen. Die Analyse der gebildeten Transformationsprodukte ergab, dass die antibakterielle Wirkung jeweils durch hydrolytische Spaltung des β-Lactam- bzw. des Makrolid-Ringes irreversibel verloren geht. Somit kann dieses biologische Verfahren prinzipiell zur gezielten Inaktivierung von Antibiotika eingesetzt werden, wobei der größte Vorteil in der erheblichen Beschleunigung der natürlicherweise ablaufenden Umsetzungsprozesse besteht. Diese Methode kann als ergänzende Technologie bei der Aufbereitung von Konzentraten und Wässern aus Spezialanwendungen angewendet werden.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung / Antibiotics play an important role in human and veterinary medicine for the treatment of bacterial infectious diseases. However, regarding the known correlation between the quantities of antibiotics applied and the frequency of resistant organisms, the improper and excessive use of these antibacterial agents leads to serious problems. Their presence in the environment is largely caused by sewage systems due to their incomplete removal in conventional wastewater treatment plants. Therefore, besides avoidance and reduction strategies, one approach to address this issue is to develop innovative technologies for the removal of antibiotic residues from water. The biological method developed and characterized within this work is based on genetically modified Saccharomyces cerevisiae cells, which secrete special enzymes that can be used for the transformation of antibiotics. The enzymatic hydrolysis of the β-lactam-antibiotic ampicillin by the β-lactamase TEM-1 was employed as a model system. By using enzyme-containing yeast culture supernatants, it was possible to prove the suitability of the developed system for the removal of the mentioned antibiotic. The obtained results with other β-lactam-antibiotics showed in accordance with the literature, that TEM-1 was able to hydrolyse penicillins and the cephalosporins of the first-generation. Taking TEM-8 as an example, the transferability of this expression system to alternative lactamase was successfully demonstrated. The activity of this enzyme toward an extended substrate spectrum, which includes not only penicillins but also monobactams and cephalosporins up to the fourth-generation, could be confirmed. The histidine-tagged purified TEM-1-His was used to systematically investigate the influence of various factors, such as temperature, substrate concentration or pH value, independently from the matrix of the yeast culture supernatants. Furthermore, the transferability of the results from model to real water (e. g. influent and effluent from a sewage treatment plant) was investigated with the result that TEM-1 was at least temporarily active in all tested matrices. In order to be able to transform other classes of antibiotics, esterase Ere-A-producing cells were employed to transform macrolide antibiotics, such as erythromycin. The analysis of the formed transformation products revealed that the antibacterial activity is irreversibly lost by the hydrolytic cleavage of the β-lactam or macrolide ring. Therefore, the biological process can be generally used for the selective inactivation of antibiotics, affording a considerable acceleration of the naturally occurring transformation process as its greatest advantage. This method is considered to be a complementary technology for the treatment of concentrates and water from special applications.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung