As doenças alérgicas representam um problema de saúde pública mundial, sendo a rinite e a asma as doenças mais comuns. Essas doenças exigem o uso contínuo de medicamentos cujos efeitos colaterais comprometem a qualidade de vida dos alérgicos e justifica a busca por novos fármacos, ou formulações, relevantes no tratamento das alergias. Neste contexto, destaca-se a planta medicinal Mangifera indica L. cujo extrato aquoso, o Vimang®, tem sido utilizado para o tratamento de diversas patologias. O estudo fitoquímico deste extrato levou ao isolamento de vários compostos fenólicos, dentre os quais a mangiferina (Mgf) é a majoritária (~46 %) e responsável por propriedades farmacológicas importantes tal como a antialérgica. Esta molécula é metabolizada no intestino e transformada na sua aglicona, o noratiriol (Nrt), que é encontrada no plasma em maior concentração que a Mgf. Como a relação estrutura-atividade destas substâncias ainda é pouco explorada, este estudo propôs a síntese de novas moléculas, a partir do esqueleto da Mgf, com modificações estruturais em seus substituintes para avaliação, in vitro, do potencial antialérgico. Foram sintetizadas moléculas análogas da Mgf (compostos 4, 5 (Nrt) e 6), através de modificações pontuais de hidroxilas do anel xantônico, por meio de uma estratégia sintética que proporcionou maior rendimento reacional. O Nrt apresentou maior potencial antialérgico que a Mgf sugerindo que o açúcar, de fato, interfere na biodisponibilidade. A presença de hidroxilas nas posições 6 e 7 do anel xantônico (grupo catecol) é crucial para a bioatividade, pois estes substituintes influenciam consideravelmente a solubilidade da molécula. Os grupos hidroxila nas posições 1 e 3 do anel xantônico também são importantes, uma vez que a substituição da hidroxila, apenas na posição 3, inibiu totalmente a bioatividade. Como a Mgf e o Nrt (os mais bioativos) são pouco solúveis em água e susceptíveis à oxidação química, ou degradação enzimática, foi planejada a incorporação em nanocarreadores lipossomais, a fim de melhorar a biodisponibilidade. O estudo da melhor formulação foi desenvolvido para a Mgf pela maior quantidade disponível e por seu merecido destaque nas mais diversas aplicações biológicas. Os lipossomos de PC:PE:COL (52:28:20), nas concentrações lipídicas de 2,9; 14,5 e 29 mmol/L, foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico em diferentes razões Mgf/lipídeo (0,01; 0,02; 0,04 e 0,10), nos pHs 6,5; 7,0 e 7,4. Todas as formulações foram estáveis no período de 29 dias, com tamanhos ao redor de 100 nm e índices de polidispersividade ao redor de 0,3, apropriados para aplicação intravenosa. A formulação com maior capacidade de carga (3,4 %) foi a de 2,9 mmo/L de lipídeos totais e razão Mgf/lipídeo de 0,1 a qual foi mantida nos ensaios biológicos. A formulação lipossomal manteve o perfil de inibição da desgranulação observado para os bioativos livres. Este resultado é relevante para a aplicação biológica, uma vez que o bioativo está protegido de degradação química e ainda exerce suas propriedades farmacológicas. Como os lipossomos são sistemas que mimetizam a membrana biológica, a localização da Mgf e os efeitos na membrana foram estudados por anisotropia de fluorescência, DSC e RPE, no pH 7,4. Os resultados mostraram que a Mgf interage com a membrana lipídica, aumentado sua fluidez e diminuindo a cooperatividade lipídica, reforçando a bioatividade dessa molécula vinculada à sua ação em proteínas de membrana, o que é comum para moléculas polifenólicas. / Allergic diseases represent a worldwide public health issue, being asthma and rhinitis the most common ones. These diseases demand the continuous use of medications whose side effects impinge on the affected people´s quality of life, justifying the search for new drugs, or formulations, relevant to the treatment of allergies. In this context, we highlight the medicinal plant Mangifera indica L., whose aqueous extract, Vimang®, has been utilized for the treatment of several pathologies. The phytochemical study of this extract led to the isolation of various phenolic compounds, among which Mangiferin (Mgf) is predominant (~46 %) and responsible for important pharmacological properties, such as the antiallergic one. This molecule is metabolized in the intestine and transformed into its aglycone, norathyriol (Nrt), which is found in the plasma in a higher concentration than Mgf. Seeing as the structure-activity relationship of these substances is still little explored, this study proposed the synthesis of new molecules from the core structure of Mgf, with structural modifications in its substituent groups for in vitro evaluation of the antiallergic potential. Analogous molecules to Mgf were synthesized (compounds 4, 5 (Nrt) and 6), through specific modifications of hydroxyl groups of the xanthonic ring, by means of a synthesis strategy that allowed for a greater reactional yield. Nrt showed a higher antiallergic potential than Mgf, suggesting that sugar does in fact interfere in bioavailability. The presence of hydroxyl groups in the 6 and 7 positions of the xanthonic ring (catechol group) is crucial for bioavailability, because these substituents considerably influence the molecule´s water solubility. The hydroxyl groups in the 1 and 3 positions of the xanthonic ring are also important, seeing as the substitution of the hydroxyl group only in position 3 completely inhibited bioactivity. Seeing as Nrt and Mgf (the most bioactive) are slightly soluble in water and susceptible to chemical oxidation or enzymatic degradation, the incorporation in liposomal nanocarriers was planned to improve bioavailability. The study for the best formulation was developed for Mgf due to the greater quantity available and its well-earned spotlight in various biological applications. The liposomes of PC:PE:COL (52:28:20), in the lipid concentrations of 2.9, 14.5 and 29 mmol/L, were prepared by the lipid film hydration method in different Mgf/lipid ratios (0.01, 0.02, 0.04 and 0,10), in pHs 6.5, 7.0 and 7.4. All the formulations were stable in the period of 29 days, with sizes around 100 nm and polydispersity indexes around 0.3, appropriate for intravenous application. The formulation with the highest loading capacity (3.4 %) was the one with 2.9 mmol/L of total lipids, and a Mgf/lipid ratio of 0.1, which was used in the biological essays. The liposomal formulation maintained the antiallergic potential profiles observed for free drugs. This result is relevant for biological application since the drugs are protected from chemical degradation and still exerts its pharmacological properties. Seeing as liposomes are systems that mimic the biological membrane, the location of Mgf and its effects on the membrane were studied by fluorescence anisotropy, DSC and EPR, in pH 7.4. The results showed that Mgf interacts with the lipid membrane, increasing its fluidity and reducing the lipid cooperation, reinforcing the bioactivity of Mgf linked to its action on membrane proteins, which is common for polyphenolic molecules.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-20T16:04:48Z No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-07T13:34:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T13:34:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / FAPESB / Helmintos modulam a resposta imune do hospedeiro e, consequentemente, protegem contra doenças inflamatórias. Diferentes classes de proteínas recombinantes derivadas destes parasitos, produzidas em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos, têm sido capazes de inibir respostas inflamatórias em modelos experimentais de doenças imunomediadas. A identificação do conteúdo proteico de frações do extrato somático de Trichuris trichiura com efeitos imunomodulatórios foi alcançada através de análises em sistema de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em uma abordagem proteômica que indicou proteínas candidatas a serem responsáveis por esta atividade biológica. Os resultados desta abordagem foram confirmados e expandidos pela análise transcriptômica do estágio adulto de T. trichiura usando tecnologia de sequenciamento de nova geração e uma estratégia de montagem de novo, onde vinte transcritos que codificam para as proteínas previamente detectadas foram identificados, sendo que cinco desses estão entre as sequências codificadoras de proteínas mais expressas no verme adulto. Estas análises contribuirão para a anotação funcional da sequência genômica de T. trichiurarecém disponibilizada e viabilizarão a produção de proteínas recombinantes codificadas por estes transcritos que poderãolevar ao desenvolvimento de novos medicamentos para a terapia de doenças alérgicas e autoimunes. / Helminths modulate the host immune response and, consequently, protect it against inflammatory diseases. Different classes of recombinant proteins derived from these parasites, produced in prokaryotic and eukaryotic expression systems, were able to inhibit inflammatory responses in experimental models of immune mediated diseases. The identification of the protein content of Trichuris trichiura somatic extract fractions with immunomodulatory effects was achieved by liquid chromatography coupled to mass spectrometry in a proteomics approach that indicated candidate proteins to be responsible for this biological activity. The results of this approach were confirmed and expanded by transcriptomic analysis of T. trichiura adult worm using next-generation sequencing technology and a de novo assembly strategy, where twenty transcripts that code for previously detected proteins were identified, and five of whom were among the most expressed protein-encoding sequences in the adult worm. These analyses will contribute to the functional annotation of the recently released draft genomic sequence of this nematode and will enable the production of recombinant proteins, encoded by these transcripts, that may lead to the development of new drugs for the treatment of allergy, autoimmune and other inflammatory diseases.

Objetivo: Asociar el auto reporte de alergias debido al uso de materiales dentales con las características laborales de odontólogos de Lima Metropolitana, Perú. Materiales y métodos: Estudio observacional, analítico y transversal. La muestra estuvo constituida por 250 odontólogos. Se utilizó el cuestionario elaborado por Oviedo et al.1 para la evaluación de la presencia de alergias debido al uso de materiales dentales. Además, se incluyeron otras variables laborales como las horas de trabajo, especialidad y tiempo de ejercicio profesional. Se comprobó la validez interna del contenido, confiabilidad y fiabilidad del instrumento a partir de los estadísticos V de Aiken (0.9), Alpha de Cronbach (0.7) y Kappa de Cohen (1.0) respectivamente. Se obtuvieron frecuencias absolutas y relativas para el análisis univariado; y finalmente, se realizaron análisis de chi cuadrado, U de Mann Whitney para el análisis bivariado y la regresión de Poisson con estimador de varianza robusta para el análisis multivariado. Resultados: El 31.2% padecen de alergias y los materiales que causaron más alergias fueron el guante de látex (30.8%), represa de goma de látex (24.4%) y el acrílico (8%). En el análisis crudo se encontró una asociación entre la alergia con el sexo y la especialidad, encontrándose un RP de 1.65 (IC 95% = 1.14 a 2.39) y un RP de 1.90 (IC 95% = 1.32 a 2.72) respectivamente. Conclusión: La hipersensibilidad más común fue al látex y acrílico. El sexo y la especialidad fueron relacionadas a la presencia de alergias, es decir existe una asociación significativa entre la presencia de alergia relacionado al sexo y especialidad del participante. / Objective: Associate the self-report of allergies due to the use of dental materials with the work characteristics of dentists in Metropolitan Lima, Peru. Materials and methods: Observational, analytical and cross-sectional study. The sample consisted of 250 dentists. The questionnaire developed by Oviedo et al. 1 for the evaluation of the presence of allergies due to the use of dental materials. In addition, other labor variables such as hours of work, specialty and time of professional practice were included. The internal validity of the content, reliability and reliability of the instrument was verified from the Aiken's V statistics (0.9), Cronbach's Alpha (0.7) and Cohen's Kappa (1.0) respectively. Absolute and relative frequencies were obtained for the univariate analysis; and finally, chi square analysis, Mann Whitney U for bivariate analysis and Poisson regression with robust variance estimator for multivariate analysis were performed. Results: 31.2% suffer from allergies and the materials that caused the most allergies were latex glove (30.8%), latex rubber dam (24.4%) and acrylic (8%). In the crude analysis, an association was found between allergy with sex and specialty, finding a PR of 1.65 (95% CI = 1.14 to 2.39) and a PR of 1.90 (95% CI = 1.32 to 2.72) respectively. Conclusion: The most common hypersensitivity was to latex and acrylic. Sex and specialty were related to the presence of allergies, that is, there is a significant association between the presence of allergy related to the sex and specialty of the participant. / Tesis

[ES] Los fármacos pertenecientes a la familia de los ß-lactámicos son los antibióticos más usados en todo el mundo. Estudios recientes revelan que hasta un 10% de la población refiere haber presentado síntomas alérgico, esta porción de la población se considera "alérgica". En el diagnóstico de la alergia a antibióticos ß-lactámicos existen varios tipos de pruebas que sirven para orientar y confirmar la presencia de una alergia, clasificadas como ensayos in vivo e in vitro. En lo que se refiere a los ensayos in vivo, la detección de los procesos alérgicos más comunes se realiza mediante pruebas de exposición oral controladas, y pruebas intraepidérmicas e intradérmicas. No obstante, estas pruebas tienen sus limitaciones como es el riesgo de inducir reacciones alérgicas sistémicas graves. Por todo ello, su práctica requiere personal entrenado. Este requisito limitan la realización de este tipo de pruebas a centros hospitalarios especializados. La aplicación y desarrollo de técnicas de diagnóstico in vitro tiene como objetivo llegar a un diagnóstico de la alergia sin riesgos para el paciente. Entre las distintas pruebas serológicas y celulares que se pueden emplear, la detección de IgE específica es una de las más extendidas debido a que, dada su sensibilidad y especificidad, y mayor seguridad. Los sistemas de diagnóstico in vitro actuales utilizan una instrumentación analítica cara y de gran tamaño, así como materiales desechables caros, manejados por personal cualificado, por lo que este tipo de pruebas se realizan únicamente por servicios de alergia y/o análisis clínicos de grandes centros sanitarios. En consecuencia, hay una necesidad de desarrollar nuevos métodos de diagnóstico que cumplan los requisitos de sensibilidad, rapidez, sencillez, multiplexado y portabilidad, a un precio reducido para su implantación en todo tipo de laboratorios clínicos de los diferentes niveles de atención sanitaria. Por este motivo, en esta tesis doctoral se plantea como objetivo principal la puesta a punto de un inmunoensayo múltiple, utilizando la tecnología de disco compacto para la detección y cuantificación in vitro de niveles de IgE específica a un amplio espectro de antibióticos ß-lactámicos en muestras de suero humano. Las limitaciones más críticas para la determinación de IgE específica multianalito mediante métodos inmunoquímicos son las relacionados con la sensibilidad y selectividad. Por lo tanto, una parte importante de la tesis se ha centrado en la preparación y caracterización de un panel antígenos ß-lactámicos, selección de inmunoreactivos, formato y estudio de diferentes parámetros claves del inmunoensayo. Otra parte importante de la tesis se ha enfocado en abordar la mejora de la reproducibilidad de los resultados. La estrategia ha consistido en estudiar diferentes sistemas de calibración con el objetivo de estandarizar la cuantificación de los métodos in vitro de diagnóstico de este tipo de alergias. Para ello, se han evaluado las prestaciones de la calibración homóloga, heteróloga y el uso de un patrón interno, comparado sus prestaciones analíticas (relación señal ruido, sensibilidad, reproducibilidad, etc.) con el sistema de referencia. Finalmente, la validación del inmunoensayo se realizó con un conjunto de 101 muestras de suero de pacientes y controles. Los resultados obtenidos han sido comparados con los obtenidos mediante las técnicas de referencia, mostrando una mejor sensibilidad, especificidad, precisión, y linealidad. La capacidad múltiplex de la tecnología de disco compacto permitió llevar a cabo paralelamente estudios de reactividad cruzada frente a diferentes antibióticos ß-lactámicos esclareciendo el patrón de reconocimiento de los pacientes. En esta línea de trabajo, el uso de otras estrategias de conjugación de haptenos ha resultado en la mejora de la sensibilidad clínica del ensayo, identificando nuevos epítopos / [CA] Els fàrmacs que pertanyen a la família dels beta-lactams, són els antibiòtics d'us més estès a tot el món. Estudis recents posen de manifest que fins un 10% de la població ha presentat símptomes d'al·lèrgia, essent considerats població al·lèrgica als beta-lactams. En el diagnòstic de l'al·lèrgia front aquest tipus d'antibiòtics, existeixen diferents tipus de proves que serveixen per orientar i confirmar la presència d'una al·lèrgia, classificades com assajos in vivo i in vitro. Pel que fa als assajos in vivo, la detecció dels processos al·lèrgics més comuns es realitza mitjançant proves d'exposició oral controlades, i proves intra-epidèrmiques i intradèrmiques. No obstant això, aquestes proves tenen les seues limitacions com és el risc d'induir reaccions al·lèrgiques sistèmiques greus. Per tot això, la seua pràctica requereix personal entrenat. Aquests requisits limiten la realització d'aquesta mena de proves a centres hospitalaris especialitzats. L'aplicació i desenvolupament de tècniques de diagnòstic in vitro té com a objectiu arribar a un diagnòstic de l'al·lèrgia sense riscos per al pacient. Entre les diferents proves serològiques i cel·lulars que es poden emprar, la detecció d'IgE específica és una de les més esteses donada la seua sensibilitat, especificitat, i major seguretat. Els sistemes de diagnòstic in vitro actuals utilitzen una instrumentació analítica cara i de gran grandària, així com materials d'un sol ús també cars, que requereixen de personal qualificat, per la qual cosa aquest tipus de proves es realitzen únicament per serveis d'al·lèrgia i/o anàlisis clíniques de grans centres sanitaris. En conseqüència, hi ha una necessitat de desenvolupar nous mètodes de diagnòstic que complisquen els requisits de sensibilitat, rapidesa, senzillesa, multiplexatge i portabilitat, a un preu reduït per a la seua implantació en tota mena de laboratoris clínics dels diferents nivells d'atenció sanitària. Per aquest motiu, en aquesta tesi doctoral es planteja com a objectiu principal la posada a punt d'un immunoassaig múltiple, utilitzant la tecnologia de disc compacte per a la detecció i quantificació in vitro de nivells d'IgE específica a un ampli espectre d'antibiòtics ß-lactáms en mostres de sèrum humà. Les limitacions més crítiques per a la determinació d'IgE específica multianàlit mitjançant mètodes inmunoquímics estan directament relacionades amb la sensibilitat i selectivitat. Per tant, una part important de la tesi s'ha centrat en la preparació i caracterització d'un panell antígens ß-lactáms, selecció d'inmunoreactius, del format d'assaig i estudi de diferents paràmetres claus de l'immunoassaig. Una altra part important de la tesi s'ha enfocat a abordar la millora de la reproductibilitat dels resultats. L'estratègia ha consistit a estudiar diferents sistemes de calibratge amb l'objectiu d'estandarditzar la quantificació dels mètodes in vitro de diagnòstic d'aquesta mena d'al·lèrgies. Per a això, s'han avaluat les prestacions del calibratge homòleg, heteròleg i l'ús d'un patró intern, comparant les seues prestacions analítiques (relació senyal soroll, sensibilitat, reproductibilitat, etc.) amb el sistema de referència. Finalment, la validació de l'immunoassaig es va realitzar amb un conjunt de 101 mostres de sèrum de pacients i controls. Els resultats obtinguts han sigut comparats amb els obtinguts mitjançant les tècniques de referència, mostrant una millor sensibilitat, especificitat, precisió, i linealitat. La capacitat múltiplex de la tecnologia de disc compacte va permetre dur a terme paral·lelament estudis de reactivitat creuada enfront de diferents antibiòtics ß-lactáms esclarint el patró de reconeixement dels pacients. En aquesta línia de treball, l'ús d'altres estratègies de conjugació d'haptens ha resultat en la millora de la sensibilitat clínica de l'assaig, identificant nous epítops / [EN] ß-lactam antibiotics are one of the most widely used antimicrobials worldwide. However, up to 10% of the population reports having presented allergic symptoms derived from their consumption. Consequently, this portion of the population is considered "allergic". In the diagnosis of allergy to ß-lactam antibiotics there are several types of tests that serve to orient and confirm the presence of an allergy. These diagnostic methods are classified as in vivo and in vitro assays. Regarding in vivo tests, the most standardized tests are the provocation, prick and intradermal test. The aim of these assays is to observe the response produced by the different beta-lactam antibiotics in the patient after oral or cutaneous administration. Despite their wide use, these tests have their limitations, such as the risk of inducing severe systemic allergic reactions. Therefore, their practice requires specialized professionals for their indication, performance and interpretation. This requirement limit the performance of this type of test to specialized hospitals. The use and development of in vitro diagnostic techniques can overcome these disadvantages and allow the diagnosis of allergy without risks. In vitro assays are less invasive and therefore neither pose a risk of adverse reactions. Among the different serological and cellular tests that can be used, the detection of specific IgE is one of the most widespread due to its sensitivity and specificity. Current in vitro diagnostic systems use expensive and bulky analytical instrumentation and high-cost single-use materials, handled by qualified professionals. Therefore, such tests are performed only by allergy and/or clinical analysis services of hospitals or by companies specialized in clinical diagnostics. Consequently, there is a need to develop new diagnostic methods that can be implemented in all types of clinical laboratories at diverse levels of health care, meeting the requirements of sensitivity, speed, simplicity, multiplexing and portability at a reduced price. For this reason, the main objective of this doctoral thesis is the development of a multiplex immunoassay using compact disc technology for the detection and quantification of specific IgE levels to a wide variety of ß-lactam antibiotics in human serum samples. The most crucial limitations for the determination of multianalyte specific IgE by immunochemical methods are those related to sensitivity and selectivity. Hence, an important part of the thesis has been focused on the preparation and characterization of a pool of beta-lactam antigens, selection of immunoreagents, format and optimization of different critical parameters of the immunoassay. Another important aspect of the thesis has been focused on improving the reproducibility of the results. The strategy consisted of studying different calibration systems with the aim of standardizing the quantification of in vitro diagnostic tests for this type of allergy. To achieve that goal, the performance of homologous and heterologous calibration and the use of an internal standard have been evaluated, comparing their analytical performance (signal-to-noise ratio, sensitivity, reproducibility, etc.) with the reference system. Finally, the validation of the immunoassay was performed with a total of 101 serum samples from patients and controls. The results obtained have been compared with those obtained using the reference techniques, showing improved sensitivity, specificity, precision, and linearity. The multiplex capability of the compact disc technology allowed carrying out parallel cross-reactivity studies against different beta-lactam antibiotics both from the penicillin family and from other families, elucidating the recognition profile. Following this working line, the use of other hapten conjugation strategies improved clinical sensitivity of the assay by identifying new epitopes. / Juárez Rodriguez, MJ. (2022). Metodologías bioanalíticas para el diagnóstico in vitro de alergia a antibióticos ß-lactámicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/184011 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

Tesis por compendio / [ES] El diagnóstico de alergias a antibióticos ß-lactámicos incluye el uso de pruebas in vivo no satisfactorias ya que consumen mucho tiempo y conllevan el riesgo de provocar una nueva reacción alérgica. Por otro lado, los métodos in vitro basados en la inmunodetección de IgE alérgeno-específica generan una información muy valiosa, confirmando o descartando la alergia y postulándose como una alternativa de diagnóstico segura. A pesar de ello, las pruebas in vitro actuales carecen de sensibilidad y exactitud, con un 81% de falsos negativos, lo que limita su uso diagnóstico. Esto ha desencadenado una creciente demanda de nuevas pruebas in vitro basadas en la inmunodetección de IgE, el biomarcador presente en suero más estudiado en alergia. Sin embargo, la falta de estándares de referencia de IgE alérgeno-específica ha imposibilitado la validación y estandarización de los métodos, lo que hace que los resultados de las distintas pruebas no sean comparables. Además, dicha falta de estándares de referencia hace que las concentraciones de IgE específica se calculen a partir de una curva de calibración de IgE total mediante una interpolación heteróloga, lo que ha demostrado no ser totalmente correcto. Por los motivos mencionados, en esta tesis doctoral se plantea como objetivo principal el diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes con reactividad frente a antibióticos ß-lactámicos. Esta investigación comienza con la puesta a punto de un inmunoensayo en placa ELISA con detección quimioluminiscente para la cuantificación de IgE específica. El ensayo desarrollado permitió determinar IgE específica por debajo de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), permitiendo así la identificación de pacientes alérgicos con una mayor sensibilidad, utilizando solo 25 ¿L de muestra (suero). El inmunoensayo mostró una buena sensibilidad (64.6%), así como una excelente especificidad (100%), que mejoran significativamente el carácter predictivo de las pruebas in vitro existentes. A continuación, se abordó la obtención y caracterización de proteínas recombinantes similares a las IgE específicas de los ß-lactámicos utilizando la metodología Phage Display. La primera aproximación se trata de una proteína formada por dos nanoanticuerpos que mimetiza el comportamiento de una IgE específica. De esta manera, se obtuvieron proteínas recombinantes en las que uno de los nanoanticuerpos reconoce selectivamente un determinante antigénico de un antibiótico ß-lactámico, mientras que el otro reconoce específicamente al parátopo de un anticuerpo detector anti-IgE. Estas construcciones resultaron ser estables y funcionales. El papel de estas proteínas recombinantes como calibrador homólogo se estudió determinando la concentración de IgE específica a penicilina G presente en suero mediante un ensayo quimioluminiscente. El método desarrollado duplicaba la sensibilidad clínica (66%) frente al método de referencia (28%), mientras que mantenía una especificidad clínica del 100%. Alcanzado este punto, la tesis se centró en la producción de IgE específica recombinante utilizando como material de partida el ADN de un paciente alérgico a amoxicilina y penicilina G. A partir del material genético aislado, mediante Phage Display, ingeniería de anticuerpos y métodos de expresión en células de insecto se consiguió producir una IgE específica recombinante. De esta manera, se obtuvo un producto biológico que cumple con los requisitos para su adopción como material de referencia en ensayos in vitro. Igualmente, se utilizó como calibrador homólogo para la determinación de IgE específica a amoxicilina. Se alcanzó un límite de detección de 0.05 IU/mL con el que se conseguía un aumento de la sensibilidad clínica (73%) que cuadruplicaba al método de referencia (16%), manteniendo la especificidad clínica en el 100%. / [CA] El diagnòstic d'al·lèrgies a antibiòtics ß-lactàmics inclou l'ús de proves in vivo no satisfactòries, ja que consumeixen molt de temps i comporten el risc de provocar una nova reacció al·lèrgica. D'altra banda, els mètodes in vitro basats en la immunodetecció d'IgE al·lergen-específica generen una informació molt valuosa, confirmant o descartant l'al·lèrgia i postulant-se com una alternativa de diagnòstic segura. Tanmateix, a les proves in vitro actuals hi ha una manca de sensibilitat i exactitud, amb un 81% de falsos negatius, cosa que en limita l'ús diagnòstic. Tot això ha desembocat en una demanda creixent de noves proves in vitro basades en la immunodetecció d'IgE, el biomarcador present en sèrum més estudiat en al·lèrgia. No obstant això, la manca d'estàndards de referència d'IgE al·lergen-específica ha impossibilitat la validació i estandardització dels mètodes, cosa que fa que els resultats de les diferents proves no siguen comparables. A més, aquesta manca d'estàndards de referència fa que les concentracions d'IgE específica es calculen a partir d'una corba de calibratge d'IgE total mitjançant una interpolació heteròloga, un mètode que ha demostrat no ser totalment correcte ja que no es pren en consideració la interacció entre el determinant antigènic i la IgE específica. Pels motius mencionats, en aquesta tesi doctoral es planteja com a objectiu principal el disseny, l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants amb reactivitat davant dels antibiòtics ß-lactàmics. Aquesta investigació comença amb la posada a punt d'un immunoassaig en placa ELISA amb detecció quimioluminiscent per a la quantificació d'IgE específica. L'assaig desenvolupat va permetre determinar IgE específica per baix de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), el que permet la identificació de pacients al·lèrgics amb més sensibilitat, utilitzant només 25 ¿L de mostra (sèrum). L'immunoassaig mostra una bona sensibilitat (64.6%), així com una excel·lent especificitat (100%), que milloren significativament el caràcter predictiu de les proves in vitro existents. A continuació, es va abordar l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants similars a les IgE específiques dels ß-lactàmics utilitzant la metodologia Phage Display. La primera aproximació és una proteïna formada per dos nanoanticossos que mimetitza el comportament d'una IgE específica. D'aquesta manera, es van obtenir proteïnes recombinants en què un dels nanoanticossos reconeix selectivament un determinant antigènic d'un antibiòtic ß-lactàmic, mentre que l'altre reconeix específicament el paràtop d'un anticòs detector anti-IgE (Omalizumab). Aquestes construccions van resultar estables i funcionals. El paper d'aquestes proteïnes recombinants com a calibrador homòleg es va estudiar determinant la concentració d'IgE específica a penicil·lina G present en sèrum mitjançant un assaig quimioluminiscent. El mètode desenvolupat duplicava la sensibilitat clínica (66%) respecte del mètode de referència (28%), mentre que mantenia una especificitat clínica del 100%. Assolit aquest punt, la tesi es va centrar en la producció d'IgE específica recombinant utilitzant com a material de partida l'ADN d'un pacient al·lèrgic a amoxicil·lina i penicil·lina G. En combinació amb la metodologia Phage Display, enginyeria d'anticossos i mètodes d'expressió en cèl·lules d'insecte, es va aconseguir produir una IgE específica recombinant. D'aquesta manera, es va obtenir un producte biològic que compleix els requisits per ser adoptat com a material de referència en assajos in vitro. Igualment, es va utilitzar com a calibrador homòleg per a la determinació d'IgE específica a amoxicil·lina. Es va assolir un límit de detecció de 0.05 IU/mL amb què s'aconseguia un augment de la sensibilitat clínica (73%) que quadriplicava al mètode de referència (16%), mantenint l'especificitat clínica al 100%. / [EN] The diagnosis of ß-lactam antibiotics allergy involves using unsatisfactory in vivo tests that are time-consuming and carry the risk of triggering a new allergic reaction. On the other hand, in vitro methods based on allergen-specific IgE immunodetection generate precious information, confirming or ruling out allergies and postulating themselves as a safe diagnostic alternative. Despite this, current in vitro tests lack sensitivity and accuracy, with 81% false negatives limiting their diagnostic use. This has led to a growing demand for new in vitro tests based on the immunodetection of IgE, the most studied biomarker in serum allergy. However, the lack of reference standards for allergen-specific IgE has made it impossible to validate and standardize methods, which means that the results of the different tests are not comparable. Furthermore, this lack of reference standards means that specific IgE concentrations are calculated from a total IgE calibration curve by heterologous interpolation, which has been shown not to be entirely correct. For the reasons mentioned above, the main objective of this doctoral thesis is to design, obtain and characterize recombinant proteins with reactivity against ß-lactam antibiotics. This research begins with developing an ELISA immunoassay with chemiluminescent detection for quantifying specific IgE. The assay developed allowed the determination of specific IgE below 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), thus allowing the identification of allergic patients with greater sensitivity, using only 25 µL of sample (serum). The immunoassay showed good sensitivity (64.6%) and excellent specificity (100%), significantly improving the predictive character of existing in vitro tests. Next, the obtaining and characterizing recombinant proteins similar to ß-lactam-specific IgE was approached using the Phage Display methodology. The first approach deals with a protein consisting of two single-domain antibodies that mimics the behavior of a specific IgE. In this way, recombinant proteins were obtained in which one of the nanobodies selectively recognizes an antigenic determinant of a ß-lactam antibiotic, while the other specifically recognizes the paratope of an anti-IgE detector antibody. These constructs were found to be stable and functional. The role of these recombinant proteins as a homologous calibrator was studied by determining the concentration of penicillin G-specific IgE present in serum by employing a chemiluminescent assay. The developed method doubled the clinical sensitivity (66%) compared to the reference method (28%), while maintaining a clinical specificity of 100%. At this point, the thesis focused on the production of recombinant specific IgE using as starting material the DNA of a patient allergic to amoxicillin and penicillin G. in combination with the Phage Display, antibody engineering and expression methods in insect cells, a recombinant-specific IgE was produced. In this way, a biological product was obtained that meets the requirements for its adoption as reference material in in vitro assays. Likewise, it was used as a homologous calibrator for the determination of specific IgE to amoxicillin. A detection limit of 0.05 IU/mL was achieved, which increased clinical sensitivity (73%) fourfold compared to the reference method (16%), while maintaining clinical specificity at 100%. / This work was supported by CSIC 2007-348, ANII FMV 2019_156321, and ANII FMV 2018_148245. P.Q.-C. acknowledges financial support from Generalitat Valenciana through the research staff training program (GVA ACIF/2018/173). This research was also funded by Agencia Estatal de Investigación (PID2019-110713RB-I00, FEDER), program UPV-La FE 2019 (P105 VALBIOAL), and PROMETEO/ 2020/094 / Quintero Campos, P. (2022). Diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes a partir de determinantes antigénicos asociadas a reacciones alérgicas a ß-lactámicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191429 / Compendio