Este trabalho tem por objetivo investigar o comportamento da terapia fotodinâmica (PDT) em leveduras patogênicas. Tem sido proposto que a PDT pode inativar células microbianas e, um grande número de fotossensibilizadores e fontes de irradiação são reportados em diferentes parâmetros. Para melhor entendimento dos processos fotodinâmicos, a taxa de fluência, fluência e tempo de irradiação foram estudadas, bem como fluências iguais em parâmetros diferentes foram comparadas entre si. O papel da concentração de azul de metileno e do transporte desta droga pela membrana fúngica foram investigados. Diferentes cepas de Cryptococcus neoformans foram comparadas frente à ação fotodinâmica com fotossensibilizadores distintos. Após esta etapa, atividades metabólicas de processo de morte microbiana e produção de melanina foram avaliadas quanto a sua interferência na inativação fúngica. Por fim, um modelo de criptococose foi desenvolvido para avaliação in vivo da ação fotodinâmica. Foi observado que parâmetros de irradiação influenciam substancialmente os resultados da PDT em leveduras e que, fluências iguais em diferentes tempos de irradiação podem apresentar resultados diferentes. Em conclusão, a fluência não deve ser utilizada como parâmetro único para comparação dos resultados de fotoinativação de leveduras. Além disso, o transporte de azul de metileno pela membrana fúngica pode influenciar os efeitos da PDT. A ação fotodinâmica depende do sítio de ligação do fotossensibilizador na célula e não somente da quantidade de moléculas no interior do microrganismo. É importante ressaltar que características intrínsecas de cada cepa podem influenciar diretamente os efeitos da PDT. As células morrem geralmente por processo não lítico, e quando utilizada in vivo, a PDT mostrou-se capaz de reduzir a recuperação de células viáveis. / This study aimed to investigate the photodynamic therapy (PDT) behavior on pathogenic yeasts. It has been proposed in literature that PDT is able to inactivate microbial cells, and a number of photosensitizer (FS) agents and irradiation sources were reported with different parameters. The role of fluence rate, as well as fluence and irradiation time was studied to achieve a deep understanding of this subject and to compare equivalent fluences under dissimilar irradiation parameters. Methylene blue concentration and its transport through yeast membrane were also focused. Cryptococcus neoformans strains that present particular metabolic characteristics were used to investigate photosensitizers and their ability to inactivate yeast. Furthermore, the role of PDT in microbial death process and inhibition of killing effects by melanin production were analyzed. Thereafter, an in vivo model of cryptococcosis was developed to evaluate photodynamic effect. The main point of our results was that light parameters play an important role on yeast inactivation and the same fluence under different irradiation parameters present dissimilar quantity of cell death. In conclusion, fluence per se should not be used as the only parameter to compare photoinactivation effects on yeast cells. In addition, MB transport thought yeast membrane can change PDT effects, as well as the photosensitizer preferential bind site inside the cell. The quantity of PS uptake, under specific conditions, does not seem to present a direct relation with cell inactivation. In addition, microbial strain characteristics can directly interfere on PDT results and cells appear to be killed by an apoptotic-like effect. Finally, PDT can kill C. neoformans in vivo and reduces its recover from infected site.

Este trabalho tem por objetivo investigar o comportamento da terapia fotodinâmica (PDT) em leveduras patogênicas. Tem sido proposto que a PDT pode inativar células microbianas e, um grande número de fotossensibilizadores e fontes de irradiação são reportados em diferentes parâmetros. Para melhor entendimento dos processos fotodinâmicos, a taxa de fluência, fluência e tempo de irradiação foram estudadas, bem como fluências iguais em parâmetros diferentes foram comparadas entre si. O papel da concentração de azul de metileno e do transporte desta droga pela membrana fúngica foram investigados. Diferentes cepas de Cryptococcus neoformans foram comparadas frente à ação fotodinâmica com fotossensibilizadores distintos. Após esta etapa, atividades metabólicas de processo de morte microbiana e produção de melanina foram avaliadas quanto a sua interferência na inativação fúngica. Por fim, um modelo de criptococose foi desenvolvido para avaliação in vivo da ação fotodinâmica. Foi observado que parâmetros de irradiação influenciam substancialmente os resultados da PDT em leveduras e que, fluências iguais em diferentes tempos de irradiação podem apresentar resultados diferentes. Em conclusão, a fluência não deve ser utilizada como parâmetro único para comparação dos resultados de fotoinativação de leveduras. Além disso, o transporte de azul de metileno pela membrana fúngica pode influenciar os efeitos da PDT. A ação fotodinâmica depende do sítio de ligação do fotossensibilizador na célula e não somente da quantidade de moléculas no interior do microrganismo. É importante ressaltar que características intrínsecas de cada cepa podem influenciar diretamente os efeitos da PDT. As células morrem geralmente por processo não lítico, e quando utilizada in vivo, a PDT mostrou-se capaz de reduzir a recuperação de células viáveis. / This study aimed to investigate the photodynamic therapy (PDT) behavior on pathogenic yeasts. It has been proposed in literature that PDT is able to inactivate microbial cells, and a number of photosensitizer (FS) agents and irradiation sources were reported with different parameters. The role of fluence rate, as well as fluence and irradiation time was studied to achieve a deep understanding of this subject and to compare equivalent fluences under dissimilar irradiation parameters. Methylene blue concentration and its transport through yeast membrane were also focused. Cryptococcus neoformans strains that present particular metabolic characteristics were used to investigate photosensitizers and their ability to inactivate yeast. Furthermore, the role of PDT in microbial death process and inhibition of killing effects by melanin production were analyzed. Thereafter, an in vivo model of cryptococcosis was developed to evaluate photodynamic effect. The main point of our results was that light parameters play an important role on yeast inactivation and the same fluence under different irradiation parameters present dissimilar quantity of cell death. In conclusion, fluence per se should not be used as the only parameter to compare photoinactivation effects on yeast cells. In addition, MB transport thought yeast membrane can change PDT effects, as well as the photosensitizer preferential bind site inside the cell. The quantity of PS uptake, under specific conditions, does not seem to present a direct relation with cell inactivation. In addition, microbial strain characteristics can directly interfere on PDT results and cells appear to be killed by an apoptotic-like effect. Finally, PDT can kill C. neoformans in vivo and reduces its recover from infected site.

O objetivo deste estudo clinico duplo-cego, randomizado, controlado foi avaliar a resposta pós-operatória de pacientes após cirurgia de extração de terceiros molares inclusos que receberam a irradiação com diferentes protocolos do terapia de fotobiomodulação. Sessenta pacientes foram recrutados de acordo com os critérios de inclusão e exclusão previamente estabelecidos e distribuídos nos 2 grupos experimentais (irradiados) e no grupo placebo (não-irradiado); n=20. Para o grupo 1: ? 660nm, 100mW, 36J/cm2, 1J por ponto, 10 segundos/por ponto (3 pontos intra-oral 6 extra oralmente). Para o grupo 2: ? 808nm, 100mW, 107 J/cm2, 3J por ponto, 30 segundos/por ponto (3 pontos intra-oral 6 extra oralmente). Para todos os grupos os pacientes foram irradiados imediatamente após o procedimento cirúrgico e às 48h. No grupo placebo foi utilizado um laser com o recobrimento da ponta, não permitindo a saída da luz no tecido alvo. Depois da cirurgia todos os participantes foram orientados quanto as recomendações pós-operatórias de rotina. Os pacientes foram instruídos a preencher um diário para avaliação da intensidade da dor pós-operatória em uma escala numérica de dor do máximo ao mínimo após o término do efeito do anestésico, nos períodos de 4, 6, 8, 24 e 48 horas. Para avaliar o processo inflamatório foram usados dois parâmetros: trismo (avaliado mediante a máxima abertura inter-incisiva) e edema (avaliada mediante três medições extra-orais, por meio de uma fita métrica flexível). Para avaliar a deiscência foi realizada uma escala analógica visual e com um medidor de ponta seca com 4 escores (não existe deiscência, leve 5 mm, moderada 10 mm e grave 20 mm ou mais). As variáveis de inflamação e deiscência foram avaliadas em tres momentos diferentes por um observador calibrado no: pré-operatório, às 48 horas e aos 7 dias. Os valores obtidos foram submetidos à análise estatística para determinação da homogeneidade e normalidade da amostra. A partir desta análise foi escolhido o teste estatístico mais adequado para a comparação entre os grupos experimentais realizados. Os resultados revelaram uma correlação positiva entre a irradiação com terapia de fotobiomodulação e as variáveis estudadas. O laser infravermelho apresentou melhores resultados em termos de dor, trismo, edema e deiscência em relação ao laser vermelho, embora os resultados não forneçam dados estatisticamente significativos quando comparados ao grupo placebo. No entanto, os efeitos do laser após a cirurgia de terceiros molares requer mais estudos devido à grande aplicabilidade na área. / The objective of this random controlled double-blind clinical study, is to assess the post-operatory response of patients after a surgery of extraction of included third molars; that received radiation with different protocols of Low Level Laser. Sixty patients were recruited according to the inclusion and exclusion criteria previously established and distributed into two experimental groups (radiated) and into a placebo group (not radiated); n=20. For group 1: ? 660nm, 100mW, 36J/cm2, 1J per point, 10 seconds/per point (3 points intra-oral 6 extra orally). For group 2: ? 808nm, 100mW, 107 J/cm2, 3J per point, 30 seconds/per point (3 points intra-oral 6 extra orally). For all the groups the patients were irradiated immediately after the surgical process and 48 hours after. In the control group a covered tip laser was used; not allowing the exit of the light towards the alveoli tissue. After the surgery all the participants were learnt about the current post operatory recommendations. Patients were instructed to complete a diary to evaluate postoperative pain intensity on a numerical scale of pain from the maximum to the lowest after the end of the anesthetic effect, in the periods of 4, 6, 8, 24 and 48 hours. To assess the inflamatory process, two parameters were used: Trismus (a measure of the maximum inter-incisor separation) and edema (assessed by three extra-oral measurements done with a flexible measuring tape). To assess the dehiscence, an analogue scale with 4 data fields was used (nonexistent dehiscence, slight 5 mm, moderate 10 mm and severe 20 mm or more). The variables of inflamation and dehiscence were assessed in three different moments by a qualified observer in: pre-operatory, after 48 hours and after 7 days. The values obtained were subjected to a statistic analysis for determination of homogeneity and normality of the sample. From this analysis, the most suitable statistic test was chosen for comparison between experimental groups. The outcome showed a positive correlation between photobiomodulation therapy and the studied variables. The infrared laser showed better results in terms of pain, trismus, edema and dehiscence in comparison to the red laser, although the results did not provide meaningful statistic data when comparing to the control group. Nevertheless, the effects of laser after a surgery of third molars require further studies due to the wide application in the area.