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MODULATION OF HOST ACTIN CYTOSKELETON BY A LEGIONELLA PNEUMOPHILA EFFECTOR

Yao Liu (5930000) 04 January 2019 (has links)
<i>Legionella pneumophila,</i> the etiological agent of Legionnaires’ disease, replicates intracellularly in protozoan and human hosts. Successful colonization and replication of this pathogen in host cells requires the Dot/Icm type IVB secretion system, which translocates over 330 effector proteins into the host cell to modulate various cellular processes. In this study, we identified RavK (Lpg0969) as a Dot/Icm substrate that targets the host cytoskeleton and reduces actin filament abundance in mammalian cells upon ectopic expression. RavK harbors an H<sub>95</sub>E<sub>XX</sub>H<sub>99</sub> (x, any amino acid) motif associated with diverse metalloproteases, which is essential for the inhibition of yeast growth and for the induction of cell rounding in HEK293T cells. We demonstrate that the actin is the cellular target of RavK and that this effector cleaves actin at a site between residues Thr351 and Phe352. Importantly, RavK-mediated actin cleavage occurs during <i>L. pneumophila </i>infection. Cleavage by RavK abolishes the ability of actin to form polymers. Furthermore, an F352A mutation renders actin resistant to RavK-mediated cleavage; expression of the mutant in mammalian cells suppresses the cell rounding phenotype caused by RavK, further establishing that actin is the physiological substrate of RavK. Thus, <i>L. pneumophila</i> exploits components of the host cytoskeleton by multiple effectors with distinct mechanisms, highlighting the importance of modulating cellular processes governed by the actin cytoskeleton in the intracellular life cycle of this pathogen.
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Whole genome sequencing analysis of Legionella in hospital premise plumbing systems

Hottel, Wesley Johnathan 01 May 2019 (has links)
Legionella bacteria, the causative agent of Legionaries’ disease and Pontiac fever, are ubiquitous in fresh-water environments including man-made water systems. Incidence of legionellosis is increasing in the United States resulting in thousands of cases every year. Infection via aerosols generated by showers, faucets, cooling towers, spas, fountains, and other water fixtures has been identified as the primary source of transmission. Legionella bacteria pose a significant public health threat, particularly in health care and long term care settings as Legionella can readily colonize the plumbing systems and infect the vulnerable patient population. One species, Legionella pneumophila (Lp), is responsible for over 90% of the known cases of Legionnaires’ disease. The importance of genetic diversity of Lp and non-pneumophila strains in human disease remains an area of ongoing research. Little is known in regard to the phylogenetic diversity of environmental strains, particularly strains that colonize facilities with high risk populations such as hospitals. Whole-genome sequencing (WGS) analysis, is an emerging tool used to support epidemiological investigation of cases of legionellosis and can be used to describe and establish phylogenetic relationships between environmental strains and clinical cases. The advantage of this method is the ability to differentiate bacteria down to the level of single nucleotide polymorphisms (SNPs). However, it was unknown whether current WGS methods accurately represent the potential SNP diversity among Lp isolates from the same environmental sample. It is unclear as to why certain strains tend be associated with clinical cases more than others, but certain genes referred to as virulence factors may be related to the relative pathogenicity of Legionella strains. Further investigation into virulence factors and antibiotic resistance factors could be used in future risk assessment of environmental Legionella. Additionally, Legionella have the potential for high genetic diversity due to recombination events, and gene transfer can occur between distinct Legionella species and strains. There is a lack of research on the potential sharing of virulence factor genes between Legionella strains typically associated with disease and those considered to be non-virulent. The goal of the work presented in this thesis is to describe the diversity of phylogenetic relationships between Lp isolates found in hospital premise plumbing systems, to estimate the genetic diversity among Lp found in the same environmental sample, and to identify virulence and antibiotic resistance genes shared between Legionella strains. A better understanding of the genetic diversity of environmental Lp could inform future surveillance and outbreak investigations by demonstrating the need to collect samples from multiple sites within a facility, and identifying shared virulence and antibiotic resistance genes between Legionella species and strains could apprise future risk assessment. WGS was utilized to describe the phylogenetic relationships of 81 Lp isolates from five hospitals. Individual hospitals were found to have distinct strains of Lp. For some strains, highly conserved subpopulations were collected from the same room over time, whereas other strains did not cluster by room. Using prospectively collected isolates from two hospitals, the mean number of SNP differences among isolates from the same environmental sample was found to differ between hospitals (0.4 versus 7.5). The presence of virulence factors and antibiotic resistance genes in Legionella species and strains was described. An analysis of 10 virulence factor genes revealed that Lp likely did not share these genes with Legionella anisa, a species generally considered to be non-virulent. Within Lp strains there was no clear difference between the Lp strains considered to be more virulent and those considered to be less virulent. A few antibiotic resistance genes were also identified. Following an in vitro assay, only the identified genes associated with macrolide resistance, LpeA and LpeB, were found to impact a quantifiable measure of antimicrobial resistance. The results of these studies emphasize the importance of understanding the context of an individual facility in Legionella related studies. Importantly, the observations or trends of one facility should not necessarily be applied to another. Legionella genetic diversity was highly conserved in some facilities, whereas in others there was greater diversity as measured by SNP differences. Within sample SNP differences was also variable between hospitals. The virulence findings gave a clear indication of the limited virulence capacity of L. anisa. These findings could explain the limited potential of L. anisa to cause disease in humans. However, a lack of difference among Lp strains may be cause to reassess the potential risk of these other strains especially in diagnostic practices. Finally, some strains of Lp have genes that may contribute to resistance to the leading antibiotic treatments for Legionnaires’ disease. Overall, this research further demonstrates the power of WGS as multiple questions can be addressed using this methodology.
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Synthese und Charakterisierung von potenziellen Inhibitoren des „Macrophage infectivity potentiator“ (Mip) Proteins von Legionella pneumophila - Ein neuer Ansatz in der Legionellose-Therapie / Synthesis and characterization of potential inhibitors of the "macrophage infectivity potentiator" (mip) protein of Legionella pneumophila - A new approach for the therapy of legionellosis

Juli, Christina January 2012 (has links) (PDF)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung potenzieller Inhibitoren des Oberflächenproteins Mip von Legionella pneumophila. Der gramnegative Mikroorganismus ist der ursächliche Erreger der Legionellose. Die Erkrankung kann in zwei verschiedenen Formen auftreten, dem Pontiac-Fieber, einer Grippe-ähnlichen Atemwegserkrankung, und der Legionärskrankheit, einer schweren Lungenentzündung mit einer Mortalitätsrate von bis zu 30 %. Natürliche und künstlich geschaffene Süßwassersysteme bilden den biologischen Lebensraum der Bakterien. Aus dieser Umgebung werden sie über technische Vektoren wie Duschen oder Klimaanlagen durch Inhalation kontaminierter Aerosole auf den Menschen übertragen, wo sie alveoläre Makrophagen besiedeln und eine pulmonale Infektion hervorrufen. Um die Zellen in der Lunge zu erreichen, müssen die Mikroorganismen jedoch zuerst die alveoläre Barriere, bestehend aus einer Epithelzellschicht und extrazellulärer Matrix, überwinden. Dafür ist das Oberflächenprotein Mip, der Hauptvirulenzfaktor, verantwortlich. Mip ist ein Homodimer, das sich aus einer C- und einer N-Domäne zusammensetzt. Während der N-Terminus für die Dimerisierung des Proteins verantwortlich ist, weist der C-Terminus die typische Faltung einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase (PPIase) auf. Der Vergleich der Aminosäuresequenz der Mip-C-Domäne mit der Domäne verschiedener humaner PPIasen zeigte eine besonders große Homologie zu FKBP12, welches zur Familie der FK506-bindenden Proteine gehört und eine wichtige Rolle innerhalb des menschlichen Immunsystems spielt. Bemerkenswerterweise hemmen bekannte immunsuppressive FKBP12-Inhibitoren wie FK506 und Rapamycin neben der humanen PPIase ebenfalls das bakterielle Mip. Außerdem wurde beobachtet, dass die C-terminale Mip-PPIase an Kollagen IV, den Hauptbestandteil in der menschlichen Lunge, bindet und somit für die Transmigration der Legionellen in die Lunge verantwortlich ist. Mip-Inhibitoren sollten demnach eine Legionellen-Infektion verhindern können. Zur Verifizierung der Hypothese sollten daher im Rahmen dieser Arbeit neue Leitstrukturen für Mip-PPIase-Inhibitoren entwickelt werden. Mit Hilfe von Molecular-Modelling-Untersuchungen basierend auf der NMR-Struktur 2VCD wurde als eine mögliche Leitstruktur N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid identifiziert. Deshalb sollten diese Verbindung sowie Analoga hergestellt werden. Obwohl die Immunsuppressiva FK506 und Rapamycin Mip-Inhibitoren darstellen, können sie auf Grund ihrer immunsuppressiven Eigenschaften nicht in der Legionellosetherapie eingesetzt werden. Die makrozyklischen Immunsuppressiva setzen sich im Gegensatz zu N,N-Dimethylphenylsulfonsäureamid allerdings aus zwei strukturellen Einheiten, einer Binde- sowie einer Effektordomäne, zusammen. Die Bindedomäne mit dem Pipecolinsäure-Grundgerüst ist für die Wechselwirkungen mit Mip und FKBP12 verantwortlich. Die Effektordomäne hingegen ist der aliphatische Teil der Makrozyklen, der erst durch die Bildung eines ternären Komplexes eine Immunsuppression hervorruft. Somit können Verbindungen vom Pipecolinsäure-Typ keine immunsuppressive Wirkung haben und stellen demnach optimale, neue Leitstrukturen für Mip-Inhibitoren dar. Aus diesem Grund wurden die zwei literaturbekannten, nicht-immunsuppressiven FKBP12-Inhibitoren A und B ausgewählt und in verschiedenen Docking-Studien untersucht. Das Molecular-Modelling zeigte, dass nur Verbindung B reproduzierbare Interaktionen mit Mip eingehen kann und demnach ein potenzieller Inhibitor ist. Um dies zu überprüfen, sollten beide Verbindungen A und B sowie eine Mischform hergestellt werden. Neben diesen Verbindungen wurden weiterhin Variationen an der Struktur vorgenommen. Alle Verbindungen wurden in einem In-vitro-Enzymassay gezielt auf ihre Mip-Interaktion untersucht. Die In-vitro-Untersuchungen zeigten, dass nur Pipecolinsäure-Derivate vom Sulfonsäureamid-Typ B die Mip-PPIase inhibieren, die besten Verbindungen sind 22b, 23a und 24a. Neben den enzymatischen In-vitro-Testungen wurden exemplarisch für die Verbindungen 1a, 12a, 22a und 22b HSQC-NMR-Experimente zur Bestimmung der Inhibitor-Proteinbindung durchgeführt. Für Verbindung 22b wurde zusätzlich die In-vivo-Wachstumshemmung der Legionellen mittels Gentamicin-Infektionsstudien ermittelt. / The present work focused on the synthesis and characterization of potential inhibitors of the surface protein Mip of Legionella pneumophila. The gram-negative microorganism is the causative agent of Legionellosis, which may occur in two different progressive forms, the Pontiac fever, a flu-like respiratory disease, and the Legionnaires disease, a severe pneumonia with mortality rate of up to 30 %. Natural and man-made fresh water systems provide a biological habitat to the bacteria. From this environment they were transmitted into humans via technical vectors such as showers or air conditioners by inhaling the contaminated aerosols. Within the human lung, they affect alveolar macrophages and cause a pulmonary infection. Though, to affect the alveolar macrophages the microorganisms have first to cross the alveolar barrier, which consists of epithelial cells and an extracellular matrix. For this, the surface protein Mip, which represents the main virulence factor of the bacterium, is responsible. Mip forms a stable homodimer, which consists of two domains, a C- and an N-domain. While the N-terminus is responsible for the dimerization of the protein, the C-terminus exhibits the typical folding of a peptidyl-prolyl-cis/trans-isomerase (PPIase). The comparison of the amino acid sequence of the Mip-C-domain and the domain of different human PPIases shows a particularly high homology to FKBP12. This human PPIase belongs to the family of the FK506 binding proteins and plays an important role within the human immune system. Remarkably, known immunosuppressive FKBP12-inhibitors such as FK506 and Rapamycin are also able to inhibit the bacterial Mip. Furthermore, it was observed that the C-terminal Mip-PPIase binds to collagen IV, the main component of the human lung, and therefore, Mip is responsible for the transmigration of Legionella. Due to this fact, Mip-inhibitors should prevent a Legionellosis. To verify this hypothesis, the intention of this work was to develop novel lead structures for Mip-PPIase-inhibitors. By means of molecular modeling studies based on the NMR structure 2VCD N,N-dimethylbenzenesulfonamide was identified as a potential lead structure. Therefore, this compound as well as analogues were aimed to prepare. Although the macrolides FK506 and Rapamycin inhibit Mip, they cannot be used for the treatment of Legionellosis due to their immunosuppressive effects. Compared to N,N-dimethylbenzenesulfonamide the macro cyclic, immunosuppressive drugs consist of two structural domains, a binding domain and an effector domain. The binding domain with the pipecolic acid feature is responsible for the interactions with Mip and FKBP12, respectively, whereas the effector domain, the aliphatic part of the molecule, causes the immunosuppression by forming a ternary complex. Therefore, compounds of the pipecolic acid type cannot affect an immunosuppression and thus, represent optimal, novel lead structures. Due to this fact, the two common, non-immunosuppressive FKBP12-inhibitors A and B were analyzed by means of different docking studies with the result that only compound B is able to interact with Mip. Therefore, it was assumed that B must be a potential Mip-inhibitor. To verify this hypothesis, both compounds A and B as well as a hybrid of them should be prepared. In addition to these compounds, further structural variations were prepared. To determine the interaction with Mip, all synthesized compounds were analyzed by means of an in vitro enzyme assay. During the in vitro studies, it was observed that only pipecolic acid compounds of the sulfonamide type B inhibit the Mip-PPIase, the most promising compounds are 22b, 23a und 24a. To determine the inhibitor-protein binding, compounds 1a, 12a, 22a and 22b were analyzed by means of HSQC-NMR experiments. Furthermore, for compound 22b an in vivo determination of growth inhibition of Legionella by means of a Gentamicin infection assay was carried out.
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Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen und Entwurf niedermolekularer MIP-Inhibitoren / Development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses and design of small-molecule MIP inhibitors

Hein, Michael January 2014 (has links) (PDF)
Dockingbasierte Ansätze zählen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Abschätzung der Bindungsaffinität zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollständig gelöstes Problem für Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gewidmet. Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Berücksichtigung der Absättigung vergrabener Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-Lösungen. Nicht-abgesättigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinität abträglichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinitätsdaten in Scoringfunktionen vernachlässigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur Häufigkeit vergrabener nicht-abgesättigter HBA und HBD in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB“-Filterfunktion) entwickelt, die unerwünschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde für die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Absättigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen für eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abgesättigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollständige Absättigung durch entsprechende Proteinpartner wird für ca. 48 % der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 % weisen weniger als drei hauptsächlich schwache, nicht-abgesättigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolekülen in die Häufigkeitsanalyse sind sogar für ca. 61 % aller Komplexe alle wasserstoffbrückenbindenden Gruppen abgesättigt. Im Gegensatz zu DSX werden für SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erhöhte Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 Å Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power“ bezeichneten Kriteriums für die Top-3-Posen (Erfolgsrate für die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 Å Pose unter den besten drei Docking-Lösungen) von 63.1 % auf 64.2 % beobachtet. In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer Überlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-Lösungen berücksichtigt. Die adäquate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist für die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinitäts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zunächst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash“-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der Häufigkeit ungünstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der Häufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash“-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerwünschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 % der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ungünstigen Beiträge pro Komplex für 50 % aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch können diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zurückzuführen sein bzw. durch günstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash“-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power für SFCscore. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-Lösungen von 61.4 % auf 86.9 % erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). Die „Clash“-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash“- und der „vnaHB“-Filterfunktion überlegen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinitätsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gelegt. Dadurch soll eine adäquate Berücksichtigung ungünstiger Beiträge zur Bindungsaffinität ermöglicht werden, die für die Richtigkeit und Zuverlässigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden binäre Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-Lösungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verfügbarkeit von Affinitätsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash“-Deskriptor, und die Decoy-Datensätze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsfähigsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten“ RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power für das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabhängigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegenüber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatensätzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). Das „beste“ Modell zeichnet sich durch die zuverlässige Vorhersage richtig-positiver Docking-Lösungen für einige wenige Komplexe aus, für die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose für diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung für die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren für die Klassifizierung von Docking-Lösungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-berücksichtigter Beiträge zur Bindungsaffinität stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator“-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei. Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein für die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolinsäure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen günstige Wechselwirkungsbereiche für Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einführung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erhöhten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke zu Gly116 zurückzuführen ist. Selektivitätsverbesserungen gegenüber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere für das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivitätsindex (1): 45, Selektivitätsindex (2n): 4.2; mit Selektivitätsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) führt zu einer verbesserten Löslichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition. Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Größere konformelle Änderungen werden lediglich für den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien für 1 erforderlich macht. Günstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits für Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits für Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl für Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erhöhte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring führt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter Löslichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen für weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern. / Docking-based approaches belong to important virtual screening components and aim at predicting both the ligand position and conformation within the protein binding site as well as the binding affinity. To date scoring functions are still not fully reliable in correctly identifying near-native ligand conformations generated by docking. Thus, the first part of the current work is dedicated to the development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses. A first project focused on considering the saturation of hydrogen bond acceptors (HBA) and donors (HBD) for the evaluation of docking poses. Since structural and affinity data are missing, current scoring functions neglect unpaired buried HBA and HBD, which strongly disfavour high-affinity binding. Based on a detailed frequency analysis of unpaired buried HBA and HBD within high-quality protein-ligand complexes of the Hartshorn dataset, an empirical filter function (“vnaHB” filter function) was developed to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with scoring functions. The practical benefit of the filter function was investigated for the scoring functions SFCscore and DSX using pre-generated docking poses of the Cheng dataset. As shown in the frequency analysis, the saturation of buried polar groups is of utmost importance for high-affinity binding, as unpaired buried HBA and HBD are extremely rare. A complete saturation by proper protein counterparts is observed for about 48 % of all complexes under study, whereas approximately 92 % have less than three, mostly weak unpaired buried HBA or HBD (e.g. ether functions). Including also the saturation by water molecules reveals that actually for about 61 % of all complexes every hydrogen bonding group is saturated. Unlike DSX, the application of the filter function with SFCscore results in higher success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the top scored poses, a criterion termed “Docking Power”. For the best SFCscore function (SFCscore::229m) the Docking Power with respect to the top three poses increases from 63.1 % to 64.2 %. A further project focused on considering repulsive intermolecular contacts due to sterical overlap of the protein-ligand binding partners for the evaluation of docking poses. Although an inclusion of such repulsive contacts in scoring is of utmost importance for the identification of protein-bound ligand conformations, it remains challenging because of missing structural and affinity data. Based on the Lennard-Jones potential of the AMBER force field a new descriptor accounting for repulsive protein-ligand contacts (“clash” descriptor) was developed and used for analysing the frequency of unfavourable protein-ligand contacts among high-quality structures of the Hartshorn dataset. An empirical filter function (“clash” filter function) derived from the frequency distribution was applied to pre-generated docking poses of the Cheng dataset to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with SFCscore and DSX. As shown in the frequency analysis, mostly weakly repulsive contacts occur within protein-ligand complexes. For 75 % of the complexes of the Hartshorn dataset repulsive potentials of less than 0.462 kcal/mol are observed. Indeed, unfavourable contributions add up to not more than 0.8 kcal/mol to 2.5 kcal/mol per complex for 50 % of all structures; values in this range may be attributed to inaccuracies of crystal structures or could be counterbalanced by favourable protein-ligand interactions. The application of the “clash” filter function shows significant improvements of the Docking Power of SFCscore. For the best SFCscore function (SFCscore::frag) the success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the three top scored poses increases from 61.4 % to 86.9 %, which is comparable to the Docking Power of the best scoring functions (e.g. DSX, GlideScore::SP) currently available in literature (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). The “clash” filter function alone is also superior to the combination of the “clash” and the “vnaHB” filter function. Another focus of the work was the inclusion of decoy data (structure and affinity data of weakly active and inactive ligands) in scoring function development. Thus, unfavourable contributions to the binding affinity should be adequately considered, which appears essential for improving accuracy and reliability of the predictions. Within the scope of this work a binary classification model was developed for the evaluation of docking poses, allowing the inclusion of decoy poses without affinity data. The random forest algorithm (RF), SFCscore descriptors, the new “clash” descriptor, and the decoy datasets of Cheng and Huang (training data) provide the basis of the best-performing model. The practical benefit of the “best” RF model was investigated after combination with the scoring function DSX based on the Docking Power for identifying a near-native pose on rank 1 using the independent Cheng/Huang (only complexes not used for training) and the CSAR-2012 dataset. With respect to the standalone application of DSX, improvements of the Docking Power regarding both test sets are achieved (Cheng/Huang test set: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012 test set: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). A key feature of the “best” model are reliable predictions of true positive docking poses for those complexes for which DSX fails to identify a near-native ligand conformation. A visual comparison of the best RF and DSX pose highlights advantages of the RF model regarding the recognition of interactions crucial for protein-ligand binding. The importance analysis of SFCscore descriptors for the classification of docking poses as well as the investigation of failures after model application provide useful hints for further improvements. Thus, more property-balanced training data, the further development of established SFCscore descriptors, and the implementation of new descriptors accounting for neglected contributions to the binding affinity constitute possible starting points for future improvements. The second part of this work is dedicated to the application of docking-based methods for the development of new inhibitors of the "`Macrophage Infectivity Potentiator"'-(MIP) proteins of Legionella pneumophila and Burkholderia pseudomallei. The MIP protein of Legionella pneumophila constitutes an important virulence factor and thus an attractive target for the treatment of legionellosis. Within the scope of this work the pipecolic acid sulfonamide 1, one of the best small-molecule MIP inhibitors to date (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM), was systematically optimised. After hot spot analysis of the binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing MIP inhibition. The results of the hot spot analysis show favourable interaction fields for donor groups and hydrophobic substituents in meta position as well as acceptor groups in para position of the benzyl ring of 1. Introducing a nitro function in para position of the benzyl ring of 1 (2h) results in an increased MIP inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), which is likely due to the formation of an additional hydrogen bond to Gly116. An improvement in the selectivity compared to the structurally related human FKBP12 protein is achieved particularly with the para amino derivative of 1 (2n) (selectivity index (1): 45, selectivity index (2n): 4.2, where the selectivity index = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (2s) leads to improved solubility and comparable MIP inhibition. The MIP protein of Burkholderia pseudomallei plays an important role in the pathogenesis of melioidosis and thus constitutes an attractive target for the development of new drugs against this disease. Within the scope of this work the currently best small-molecule MIP inhibitor 1 was optimised. Starting with a structural comparison of Burkholderia pseudomallei MIP and Legionella pneumophila MIP, as well as a hot spot analysis of the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing for MIP inhibition. The structural comparison reveals a high homology of the two binding pockets. Major conformational changes are observed for the binding pocket region formed by Ala94, Gly95, Val97 and Ile98, which necessitates different optimisation strategies for 1. Favourable interaction fields for the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket are found for donor groups or hydrophobic substituents in para position of the benzyl ring (region A) of 1 as well as for acceptor or donor groups in para or meta/para position of the trimethoxyphenyl ring (region B). On the basis of the docking studies promising candidates could be identified for variations in both regions. Initial MIP inhibition measurements of synthesised derivatives indicate increased inhibition compared to 1. Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (yielding a more soluble derivative) leads again to comparable MIP inhibition. Further syntheses and tests of promising ligands are currently being planned by the collaboration partners. The results of the inhibition measurements should demonstrate their suitability as MIP inhibitors and provide useful information for future structure-based drug design cycles.
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Entwicklung von Inhibitoren des „macrophage infectivity potentiator“-Proteins / Development of macrophage infectivity potentiator inhibitors

Seufert, Florian January 2016 (has links) (PDF)
Die Melioidose und die Legionärskrankheit werden von den beiden Erregern Burkholderia pseudomallei bzw. Legionella pneumophila verursacht. Eine hohe Mortalitätsrate trotz langwieriger Behandlungen sowie die zunehmende Resistenz vieler Bakterien gegenüber den eingesetzten Antibiotika verdeutlichen die Notwendigkeit alternativer Behandlungsmethoden. Als neues Angriffsziel gilt das bereits in vielen Pathogenen gefundene „macrophage infectivity potentiator“-Protein, kurz Mip, das als Virulenzfaktor die Infektion forciert. Bei Legionella pneumophilia ist LpMip dafür verantwortlich, dass das Bakterium in die Lunge eindringen kann. Dabei überwindet der Erreger mit Hilfe des Mips die Epithelzellschicht und die extrazelluläre Matrix. Für BpMip ist der Sachverhalt der Invasion noch Gegenstand aktueller Forschung. Beide Mips zeigen eine hohe Sequenzhomologie zu humanem FKBP12 (FK506-bindende Proteine) und gehören deshalb zur Superfamilie der Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen), die die Fähigkeit besitzen, die cis/trans-Isomerisierung von Peptidbindungen der Aminosäure Prolin zu katalysieren. Die bereits bekannten FKBP12- und Mip-Inhibitoren Rapamycin und FK506 sind aufgrund ihrer immunsuppressiven Wirkung nicht zur Behandlung der beiden Krankheiten einsetzbar. Im Vorfeld dieser Arbeit konnte durch Synthese des literaturbekannten nicht-immunsuppressiven FKBP12-Inhibitors eine Leitstruktur gewonnen werden, die sowohl die PPIase-Aktivität von LpMip als auch von BpMip inhibiert. Zunächst konnten in dieser Arbeit durch Optimierung des Synthesewegs die Inhibitoren enantiomerenrein hergestellt werden. Ebenso wurde verifiziert, dass das S-Enantiomer das aktivere Konfigurationsisomer ist. Daneben wurde durch Synthese der Verbindung 8a/S-8a die anti-PPIase-Aktivität und die Löslichkeit im PBS-Puffer verbessert sowie die Zytotoxizität im Vergleich zu S-1a gesenkt Diese Verbindung zeigte jedoch eine schlechte Aktivität im Infektionsassay. In weiteren Kooperationen mit dem Biozentrum Würzburg und dem Dstl wurden die Inhibitoren ebenfalls erfolgreich an den Mips von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Francisella tularensis undYersinia pestis getestet. In dieser Arbeit wurden erstmals Mip-Inhibitoren an Burkholderien in einer In-vivo-Studie untersucht. Die Wirksamkeit der Inhibitoren im Tiermodell soll in Folgestudien bewiesen werden. Damit ist eine aussichtsreiche Basis für zukünftige alternative Behandlungsmethoden der gram-negativer Bakterien gelegt. / Development of macrophage infectivity potentiator inhibitors
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Plasticité fonctionnelle et structurale chez Legionella pneumophila - Impact des protéines de type histone sur la virulence et génotypage par les séquences d'insertion

Vergnes, Mike 13 December 2010 (has links) (PDF)
Le genre Legionella regroupe des bactéries pouvant causer chez l'homme une pneumonie fatale dans 10% des cas, la légionellose. Elles sont capables de coloniser tous les réseaux d'eau. Le génome de ces bactéries révèle une forte plasticité génomique, aux niveaux fonctionnel et structural. La première partie de cette thèse analyse l'impact des protéines de type histone sur la régulation de la virulence chez L. pneumophila. Ces protéines structurent le chromosome bactérien et influencent l'expression génique. Des mutants des gènes codant les protéines Dps et IHF ont été obtenus chez L. pneumophila et analysés pour leur sensibilité aux stress et leurs propriétés de virulence. Ces deux protéines sont impliquées dans la régulation de la virulence chez Legionella. De plus, Dps permet de diminuer la sensibilité au stress oxydatif et IHF régulerait l'entrée dans l'état VBNC (viable but non-culturable), un état physiologique dans lequel les bactéries sont viables mais ne sont plus cultivables. La seconde partie vise à utiliser la plasticité structurale, notamment celle induite par les éléments génétiques mobiles IS, comme outil épidémiologique. A l'heure actuelle, les méthodes d'identification ne permettent pas de discriminer les isolats de même espèce. Afin d'éviter de nouvelles contaminations, il est impératif d'identifier rapidement et avec précision l'installation contaminée, à partir des prélèvements de patients comme élément comparatif. L'utilisation d'une méthode RFLP-IS a permis de mettre en évidence une IS particulière, ISLpn11, possédant un taux de discrimination de 80% au sein de la souche L. pneumophila Paris, qui est responsable de plus de 10 % des épidémies en Europe.
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Samkörning mellan värmepumpar och fjärrvärme : Bostadsrättsföreningen Bogården

Sadik, Zidar January 2008 (has links)
<p>This diploma work covers an investigation over the heat - and hot water systems of the</p><p>tenant-owner's association, Bogården. The heat - and hot water needs of Bogården are</p><p>satisfied by both district heating as well as three heat pumps. Implemented investigation</p><p>shows that the heat pumps are not used in a profitable way. Apart from that, the reserve</p><p>possibilities are small. There is also a risk of the growth of Legionella bacterium in the</p><p>hot water system.</p><p>Since the heat pumps are already installed, HSB-Gävleborg (responsible for Bogården)</p><p>has a wish to investigate possible proposed actions for optimization of existing plant.</p><p>After completed investigation, a new proposed action is presented. The new proposed</p><p>action goes on intercepting the hot water production and using the heat pumps to only</p><p>heat production during the heating season. Why the hot water production should be</p><p>intercepted, is just in order to eliminate the risk of Legionella. Besides, the new proposal</p><p>is going to bring about a reserve of 1,534,000 SEK during a twenty-year period. This is</p><p>approximately twice as much as what the existing plant may bring during the same</p><p>period.</p><p>During the work's review, it also has been established that heat - and hot water systems</p><p>are error regulated. Since the diploma work does not cover that piece it is instead</p><p>informed as proposals subject to further investigation.</p>
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Legionella en redes de distribución de agua potable y torres de refrigeración en España

Salvador García, Carme 11 February 2011 (has links)
El primer brote de legionelosis ocurrido en España, diagnosticado retrospectivamente, se produjo en 1973 entre un grupo de escoceses alojados en un hotel de Benidorm. Desde entonces, se han originado numerosos casos y brotes de esta enfermedad en nuestro país. Entre ellos destaca el brote acontecido en Murcia a principios de julio del año 2001. Éste ha sido el brote más importante en cuanto a magnitud producido a nivel mundial, en él se confirmaron más de 400 casos de legionelosis. A pesar de considerarse como una enfermedad infecciosa potencialmente erradicable aplicando las medidas higiénico-sanitarias establecidas por la legislación vigente, la legionelosis en España cuenta con una incidencia situada por encima de la media europea. En los últimos años se está detectando un incremento de casos esporádicos comunitarios. En éstos, existe poca información acerca de las posibles fuentes de infección y se desconoce la importancia que pueda tener la red de distribución de agua de consumo humano como reservorio de estos microorganismos. Asimismo el estudio de Legionella no está contemplado en los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano establecidos por la legislación. Este trabajo pretende determinar la contaminación por Legionella tanto en torres de refrigeración, mantenidas correctamente según indica la legislación vigente (RD 865/2003) como en el agua de consumo humano, localizadas ambas en distintos puntos de la geografía española. Se muestrearon mensualmente durante tres años (2006-2008) 157 puntos de agua de consumo humano, ubicados en la acometida de edificios públicos y 309 torres de refrigeración. El análisis para la detección y recuento de Legionella se realizó mediante la técnica de cultivo según la Norma Internacional ISO 11731:1998. En este trabajo se detectó Legionella en el agua de consumo humano únicamente de la zona sur y este de España y se encontró la bacteria en el 20.3% de los puntos de muestreo de la red de distribución de agua potable y en el 37.2% de la torres de refrigeración situadas en diferentes áreas geográficas. De éstas, en el 56.5% se aisló Legionella en más de una ocasión. Los aislamientos se obtuvieron principalmente en verano y otoño, observándose además concentraciones más elevadas en estas épocas. Las concentraciones de Legionella superaron las 103 ufc/l en el 46.4% de las muestras positivas obtenidas de agua de consumo humano y en el 38.3% de las muestras positivas obtenidas de torres de refrigeración. Para conocer las especies y serogrupos de Legionella dominantes en el ambiente se realizó un test basado en la microaglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos específicos frente a los antígenos de distintas especies y serogrupos de Legionella. Tanto en agua de consumo humano como en torres de refrigeración, la especie predominante fue L. pneumophila, siendo el serogrupo 1 el más frecuente. Se llevó a cabo el análisis molecular mediante electroforesis en campo de pulsos (PFGE) con el fin de establecer la variabilidad genotípica de los aislamientos de Legionella y comprobar la persistencia de los distintos genotipos en cada una de las instalaciones durante el periodo de estudio. Se observó un patrón molecular mayoritario entre los aislados de L. pneumophila serogrupo 1. Por su parte, los aislados de L. pneumophila serogrupo 2-14 y Legionella no-pneumophila en torres de refrigeración presentaron una gran diversidad genética. En cuanto al estudio de la persistencia se detectó que L. pneumophila, principalmente L. pneumophila serogrupo 1, persistió durante varios meses en la mitad de los puntos de agua de consumo humano y de las torres de refrigeración. En este trabajo también se realizó el estudio de la virulencia de las cepas de Legionella aisladas en muestras ambientales y en muestras humanas detectando la presencia de los genes de virulencia lvh y rtxA mediante la reacción en cadena de la polimerasa y el crecimiento intracelular en Acanthamoeba polyphaga y células &quot;macrophages-like U-937&quot;. Entre las muestras ambientales se observó que en el 81% de las cepas de L. pneumophila y en el 14.3% de las cepas de Legionella no-pneumophila se detectaron los genes de virulencia lvh y/o rtxA. Como parte de este estudio se llevó a cabo una investigación clínico-epidemiológica tras la que se concluyó que el agua de consumo humano fue la fuente de infección de un caso de legionelosis mortal ocurrido en Murcia. Además, no se encontraron diferencias en la capacidad de replicación intracelular en A. polyphaga y células &quot;macrophages-like U-937&quot; entre los aislamientos procedentes de muestras clínicas y muestras ambientales, lo cual hace pensar en la posible importancia del agua de consumo humano como reservorio y fuente de infección, especialmente en pacientes inmunodeprimidos.
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Samkörning mellan värmepumpar och fjärrvärme : Bostadsrättsföreningen Bogården

Sadik, Zidar January 2008 (has links)
This diploma work covers an investigation over the heat - and hot water systems of the tenant-owner's association, Bogården. The heat - and hot water needs of Bogården are satisfied by both district heating as well as three heat pumps. Implemented investigation shows that the heat pumps are not used in a profitable way. Apart from that, the reserve possibilities are small. There is also a risk of the growth of Legionella bacterium in the hot water system. Since the heat pumps are already installed, HSB-Gävleborg (responsible for Bogården) has a wish to investigate possible proposed actions for optimization of existing plant. After completed investigation, a new proposed action is presented. The new proposed action goes on intercepting the hot water production and using the heat pumps to only heat production during the heating season. Why the hot water production should be intercepted, is just in order to eliminate the risk of Legionella. Besides, the new proposal is going to bring about a reserve of 1,534,000 SEK during a twenty-year period. This is approximately twice as much as what the existing plant may bring during the same period. During the work's review, it also has been established that heat - and hot water systems are error regulated. Since the diploma work does not cover that piece it is instead informed as proposals subject to further investigation.
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Apply the concepts of evidence-based medicine to develop the risk management strategy in hospital-acquired legionnaires¡¦ disease

Chien, Shang-Tao 12 June 2008 (has links)
Hospital-acquired Legionnaires¡¦ Disease (LD) is a bacterial pneumonia caused by the genus of Legionella. It is an opportunistic pathogen with the characteristic of widespread distribution in the environment. Its source of infection associates with potable water systems. Proactively culturing hospital water supply for Legionella as a strategy for prevention of nosocomial LD has been widely adopted in other countries. Nosocomial LDs has been hardly reported in Taiwan. In addition, environmental cultures of Legionella in potable water systems in hospitals have not been systematically implemented. Thus, the purpose of the research is to confirm if LD presents in the hospital in Taiwan, and developing risk management strategy in hospital-acquired LD. To practice one-year prospective surveillance program for LD, we choose a military hospital in Southern Taiwan, collecting the specimens from the nosocomial and community-acquired pneumonia patients for legionella investigations. In the meanwhile, we collect water samples for hospital epidemiological investigation every 3 months. Isolated Legionella pneumophila is serotyped and analyzed by pulsed-field gel electrophoresis. From Nov 1, 2006 to Oct 30, 2007, within 54 cases of nosocomial and 300 cases of community-acquired pneumonia, only one case of nosocomial LD was found. Environmental investigations detected L. pneumophila in 17(20.7%) of the 84 water samples, of which 82.4% (14/17) belonged to serogroup 1. The result demonstrated the infection source of the only positive case of nosocominal pneumonia is the potable water supply system of another hospital. In conclusion: 1. The infection source of nosocomial LD is the potable water supply system of the hospital. 2. The positive rate of distal outlets for L. pneumophila is a reasonable and reliable indicator in risk management for nosocomial LD. 3. Uncovered cases of nosocomial LD will be found in prospective clinical surveillance for LD. Suggestions: 1. Routine water-quality monitoring should be added in environmental water culture for L. pneumophila in the institution, such as hospital, nursing home, hotel, restaurant, SPA, swimming pool, hot spring, school, army, etc. 2. We advise that government health department carries out national surveillance for hospital water environment in determining the risk of hospital-acquired LD. 3. Education and training program need to be provided for medical staffs in the diagnostic skills of nosocomial LD to avoid misdiagnosing and delaying the treatment.

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