Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 7 uppsatser.

Legionella pneumophila est une bactérie à Gram négatif, intracellulaire facultative, responsable de la légionellose (ou maladie des Légionnaires) chez l'Homme. Les fluoroquinolones et les macrolides sont utilisés en première intention dans le traitement antibiotique de cette maladie. Cependant, les échecs thérapeutiques sont fréquents, et le taux de mortalité demeure élevé (10-15% des cas, plus de 30% chez le patient immunodéprimé). Bien qu'aucune souche de L. pneumophila résistante à ces antibiotiques n'ait été isolée à ce jour, ces échecs peuvent faire évoquer la possibilité d'une sélection in vivo de mutants résistants. Le mécanisme génétique principal d'acquisition de la résistance aux fluoroquinolones correspond à l'accumulation de mutations au niveau des gènes codant pour l'ADN gyrase et la topoisomérase IV ; en particulier celles affectant les codons en positions 83 et 87 du QRDR (quinolone resistance determining region) du gène gyrA entrainent une résistance de haut niveau à ces antibiotiques. Le première aspect de notre projet était d'élaborer un test de PCR en temps réel permettant de détecter chez L. pneumophila des mutants gyrA résistants aux fluoroquinolones et de les différencier des souches sauvages par analyse des températures de fusion des amplifias obtenus. Après optimisation, ce test nommé qPCRgyrALp amplifie spécifiquement une portion du QRDR du gène gyrA de l'espèce L. pneumophila et permet de détecter et de différencier les mutations gyrA83 et gyrA87. Nous avons ensuite utilisé ce test pour la recherche de mutants gyrA directement dans divers prélèvements respiratoires provenant de 82 patients atteints de légionellose, certains en échec thérapeutique après traitement par une fluoroquinolone. Les résultats ont montré pour quatre patients un profil de courbe de fusion semblable à celui du mutant gyrA83. Le séquençage du QRDR de gyrA à partir de ces prélèvements respiratoires a confirmé cette mutation chez deux patients. L'utilisation de la technique de séquençage à haut débit a permis de quantifier ces mutants gyrA83 chez ces deux patients, permettant de montrer un remplacement progressif in vivo de la population de L. pneumophila sensible aux fluoroquinolones par une population résistante à ces antibiotiques. Le deuxième aspect de notre travail a été de développer des tests de PCR quantitative en temps réel (qPCR) permettant de quantifier la charge bactérienne à L. pneumophila dans les prélèvements cliniques des patients infectés, avant et au cours du traitement antibiotique, dans la but de prédire l'évolution clinique et le pronostic final de ces patients. Nous avons utilisé deux tests de qPCR, ciblant soit le gène codant pour l'ARNr16s (qPCR16S) soit le gène mip (qPCRmip) dans des prélèvements respiratoires de 116 patients atteints de légionellose. Chez certains patients, nous avons pu déterminer la cinétique de la charge bactérienne au cours du temps, alors que les patients recevaient une antibiothérapie adaptée. Les premières cinétiques recueillies montrent la possibilité de différencier les patients qui répondent rapidement au traitement antibiotique et évoluent favorablement au cours de la 1ère semaine d'hospitalisation, de ceux qui présentent une réponse modeste au traitement et nécessitent une hospitalisation prolongée, voire décèdent. La PCR en temps réel semble donc représenter un outil pronostique d'intérêt au cours de la légionellose. Le type de cinétique observé chez un patient donné semble pouvoir prédire l'évolution des patients et la nécessité d'ajuster le traitement antibiotique. / Legionella pneumophila is a Gram- negative, facultative intracellular bacterium responsible for legionellosis (or Legionnaires' disease ) in humans. The fluoroquinolones and the macrolides are used as first-line antibiotic treatment of this disease. However, treatment failures are common, and the mortality rates remain high (10-15 % of cases, more than 30% in immunocompromised patients). Although L. pneumophila strain resistant to these antibiotics have never been isolated, treatment failures may suggest the possibility of in vivo selection of resistant mutants. The main genetic mechanisms associated with acquired resistance to fluoroquinolones correspond to the accumulation of mutations in the genes encoding DNA gyrase and topoisomerase IV, especially those affecting codons 83 and 87 of the QRDR (quinolone resistance determining region) of the gyrA gene, which are associated with high level resistance to these antibiotics. The first aspect of our project was to develop a real-time PCR test to detect gyrA QRDR mutants and differentiate them from wild-type strains of L. pneumophila by analysis of melting temperatures of the amplified DNA. After optimization, the qPCRgyrALp test specifically amplified a portion of the gyrA QRDR of L. pneumophila and could detect and differentiate gyrA83 and gyrA87 mutations. Then, we checked the presence of gyrA mutants directly in respiratory samples collected in 82 legionellosis patients, including some after treatment failure with a fluoroquinolone. For four patients, results corresponded to a melting curve profile similar to that of the gyrA83 mutant. Amplification and sequencing of the gyrA QRDR directly from these respiratory samples confirmed this mutation in two patients. The use of high-throughput sequencing technology allowed us to quantify the gyrA83 mutants in these two patients, allowing demonstration of in vivo gradual replacement of the fluoroquinolones susceptible population of L. pneumophila by a resistant one. The second aspect of our work was to develop quantitative real-time PCR tests offering the possibility to quantify the L. pneumophila bacterial load in respiratory specimens before and during antibiotic treatment, in order to predict the clinical course and the final prognosis of these patients. We used two qPCR tests, either targeting the gene encoding 16S rRNA (qPCR16S ) or the mip gene (qPCRmip ) in respiratory samples from 116 patients with Legionnaires' disease. In some patients, we determined the kinetics of bacterial loads over time, while patients received appropriate antibiotic therapy. The kinetics we observed allowed differentiation of patients who respond quickly to antibiotic treatment and were released from hospital within the first week following admission, from those with a modest response to treatment and requiring prolonged hospitalization or finally died. Thus, our real-time PCR tests seem to be good prognostic tools for evaluation of legionellosis prognosis. The type of kinetics observed in a given patient may allow the clinician to predict the evolution of patients and the need to adjust the antibiotic treatment.

Legionella pneumophila, o agente etiológico da doença dos Legionários, é conhecida por desencadear a formação de poro em membranas de macrófagos derivados de medula óssea (BMMs) por mecanismos dependentes do sistema de secreção do tipo IV conhecido como Dot/Icm. Neste trabalho, foram utillizados vários mutantes de L. pneumophila em combinação com camundongos nocautes para investigar os fatores bacterianos e do hospedeiro envolvidos na formação de poro em BMMs. Observamos que apesar da atividade do Dot/Icm, a formação de poro não ocorre em BMMs deficientes para caspase-1 e Nlrc4. A formação de poro foi temporalmente associada com a secreção de IL-1b e precedeu a lise celular e a piroptose. A formação de poro foi dependente do Dot/Icm, mas independente de várias proteínas efetoras, da multiplicação bacteriana e da síntese de novo de proteínas. A flagelina, a qual é conhecida em ativar o inflamassoma de Nlrc4, foi necessária para a formação de poro; a bactéria mutante flaA falhou em induzir a permeabilização celular. Consequentemente, a transfecção da flagelina purificada foi suficiente para desencadear a formação de poro independente da infecção. Utilizando 11 diferentes espécies de Legionella, nós observamos alta formação de poro em resposta à L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis e L. rubrilucens, e essa resposta estava correlacionada com a expressão de flagelina por essas espécies. Além disso, verificamos que as proteínas Asc e Caspase-11 apresentam fenótipo intermediário na formação de poro, sugerindo que outras vias podem estar envolvidas no processo. Observamos também que a formação de poro desencadeada por L. pneumophila difere daquela induzida pelo ATP. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a formação de poro não é uma resposta específica de L. pneumophila nem o resultado de dano da membrana induzido pelo Dot/Icm. Ao invés disso, a formação de poro é uma resposta do hospedeiro altamente coordenada, dependente dos componentes do inflamassoma Nlrc4 e caspase-1 e é desencadeada em resposta a bactérias que expressam o sistema de secreção do tipo IV e flagelina. / Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires disease, is known to trigger pore formation in bone marrow-derived macrophages (BMMs) by mechanisms dependent on the type IVB secretion system known as Dot/Icm. Here, we used several mutants of L. pneumophila in combination with knockout mice to assess the host and bacterial factors involved in pore formation in BMMs. We found that regardless of Dot/Icm activity, pore formation does not occur in BMMs deficient in caspase-1 and Nlrc4/Ipaf. Pore formation was temporally associated with IL-1b secretion and preceded host cell lysis and pyroptosis. Pore-forming ability was dependent on bacterial Dot/Icm but independent of several effector proteins, multiplication and de novo protein synthesis. Flagellin, which is known to trigger the Nlrc4 inflammasome, was required for pore formation as flaA mutant bacteria failed to induce cell permeabilization. Accordingly, transfection of purified flagellin was sufficient to trigger pore formation independent of infection. By using 11 different Legionella species, we found robust pore formation in response to L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis and L. rubrilucens, and this trait correlated with flagellin expression by these species. Furthermore, we found that Asc and Caspase-11 showed an intermediate phenotype in pore formation, suggesting that other pathways may be involved in this process. We also observed that the pore formation triggered by L. pneumophila differs from the pore induced by ATP. Together, the results suggest that pore formation is neither L. pneumophilaspecific nor the result of membrane damage induced by Dot/Icm activity; instead, it is a highly coordinated host cell response dependent on host Nlrc4 and caspase-1 and on bacterial flagellin and type IV secretion system.

A bactéria Legionella pneumophila é um bacilo Gram-negativo, flagelado causador da doença dos legionários e febre de Pontiac. O inflamassoma mais importante no controle da replicação desta bactéria é o composto por Naip5/NLRC4, que é responsável pelo reconhecimento de flagelina. A ativação do inflamassoma de Naip5/NLRC4 pela flagelina induz a ativação de caspase-1, induzindo a formação de poros na membrana, piroptose e controle da replicação desta bactéria. A participação da proteína adaptadora ASC é essencial para a nucleação deste complexo e secreção de citocinas inflamatórias como IL-1? e IL-18 por esta via. Além do controle da replicação de L. pneumophila pelo inflamassoma NLRC4 dependente de caspase-1, foi demonstrado que existe uma via induzida por NLRC4 independente de caspase- 1/11. Dessa forma, camundongos e células Nlrc4-/- são mais susceptíveis à infecção por esta bactéria do que as células Casp1/11-/-. Neste trabalho, nós identificamos que a via independente de caspase-1/11 é composta por Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-8 e é essencial para o controle da replicação de Legionella spp. flageladas em macrófagos e in vivo. Através da utilização de BMDMs Casp1/11-/- e Asc/Casp1/11-/- transduzidos com NLRC4-GFP ou ASC-GFP, identificamos que a formação de punctas de NLRC4 e ASC dependem do reconhecimento de flagelina e que ASC é essencial para a formação desses punctas. Também foi identificado que a infecção com L. pneumophila que expressa flagelina leva à ativação de caspase-8 de maneira dependente de ASC e Naip5, mas independente de caspase-1/11. De acordo com esses dados, o silenciamento de caspase-8 em macrófagos Casp1/11-/- aumentou a susceptibilidade dessas células à infecção com L. pneumophila flagelada. Além disso, macrófagos e camundongos Asc/Casp1/11-/- foram tão susceptíveis quanto os Nlrc4- /- e mais susceptíveis que os Casp1/11-/-. Nós observamos que o inflamassoma de NLRC4/ASC/Caspase-8 induz formação de poros e morte celular independente de gasdermina-D (GSDMD). Por meio da utilização de células de camundongos C57BL/6, foi observado que caspase-8 é recrutada para o inflamassoma de Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-1. Entretanto, a ativação de caspase-8 só ocorre na 10 ausência de caspase-1 ou GSDMD. Nossos dados sugerem que a ativação de caspase-8 no inflamassoma composto por NLRC4/ASC/Caspase-8 representa uma via alternativa que opera para garantir o controle da replicação de bactérias flageladas em situações nas quais ou caspase-1 ou GSDMD estão inibidas. / Legionella pneumophila is a flagellated Gram-negative bacillus that is the causative agent of the legionnaire\'s disease and Pontiac fever. The most important inflammasome for the control of L. pneumophila replication is the Naip5/NLRC4, responsible for the flagellin recognition. The activation of the Naip5/NLRC4 inflammasome leads to caspase-1 activation, consequently pore formation, pyroptosis and control of bacterial replication. The participation of the adaptor molecule ASC is essential for this complex nucleation and the secretion of inflammatory cytokines like IL-1? and IL-18 by this pathway. Besides the control of L. pneumophila replication by Naip5/NLRC4/Caspase-1 inflammasome, it was demonstrated there are NLRC4 responses independent of caspase-1/11. These explain why mice and macrophages Nlrc4-/- are more susceptible than Casp1/11-/-. In this work, we identified that the caspase-1/11-independent pathway is composed of Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-8 and it is essential for the control of flagellated Legionella spp. replication in macrophages and in vivo. Infection of Casp1/11-/- and Asc/Casp1/11-/- macrophages, transduced with NLRC4-GFP or ASC-GFP, showed that flagellin-positive bacteria triggered puncta formation that is ASC-dependent. Accordingly, Naip5 and ASC, but not caspase-1/11, were required for caspase-8 activation in response to flagellated bacteria. Silencing caspase-8 in Casp1/11-/- BMDMs increased the susceptibility to L. pneumophila infection. Furthermore, the macrophages and mice Asc/Casp1/11-/- are as susceptible as Nlrc4-/-, but more susceptible than Casp1/11-/-. We also found that the NLRC4/ASC/Caspase-8 inflammasome induces GSDMD-independent pore formation and cell death. Using C57BL/6 cells, we observed that caspase-8 is recruited to Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-1 inflammasome. However, caspase-8 is just activated in the absence of caspase-1 or GSDMD. Our data suggest that caspase-8 activation in the NLRC4/ASC/Caspase-8 inflammasome represents an alternative pathway that operates to ensure the control of flagellated bacteria replication in situations which either caspase-1 or GSDMD are inhibited.

Water systems in buildings have been reported to contribute to pseudomonal infection transmission and have been associated with Legionnaires’ disease (LD) outbreaks, for they provide the perfect conditions for bacteria proliferation and biofilms formation. An overview of the problem has highlighted that the economic burden, the healthcare and mortality costs of both LD and pseudomonal infections are significant. Although critical to the safe delivery of water, pathogen control continues to remain a challenge as current hot water treatments are not always effective, are often energy intensive and require expensive maintenance. This thesis was set out to evaluate the potential use of electrochemical disinfection (ED) in controlling pathogens in hot water systems of buildings. In this project, we performed a fundamental systematic study on the effect of geometrical and operational parameters in a flask, to gather an understanding of the effect of each parameter on the rate of bacteria elimination, crucial for the design and optimization of electrolytic cells. ED prototypes were then installed in in the hot water systems of two different buildings operating at 60°C, the temperature recommended for Legionella control (HSE, 2013), and their efficacy was monitored long term. In one of the buildings, 2 to 4– log reductions in total bacteria counts was observed, while Pseudomonas species counts were reduced by 3 log. The apparent failure in the other building was due to the inadequate operation of the water system. In order to achieve the 2019 zero carbon targets for new non-domestic buildings set by the UK government, the energy demand associated with heating water needs to be addressed, but maintaining systems at such high temperatures renders difficult the use of greener technologies that could further reduce the CO2 impact of heating water. Given that ED generates disinfectants and that the Health and Safety Executive advises that if hot water is treated with biocides, water temperatures can be reduced, the efficacy of the prototype device was evaluated under laboratory conditions at temperatures between 30 and 45˚C. The prototype was found to be effective both on laboratory-grown biofilm and on planktonic Legionella pneumophila serogroup 1, with 5-log reduction on bacteria counts.

Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein fakultativ intrazelluläres, ubiquitär vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilität der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen können, ist bisher noch nicht geklärt. Um etwas über noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region näher charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst kürzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide“-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adhärenz, Invasion, intrazellulärer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle für das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilitätsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gewählten Versuchsbedingungen bezüglich des Adhärenzvermögens der Stämme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz für die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgeprägt. Hinsichtlich der intrazellulären Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings führte vermutlich die Reduktion der Invasivität zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream“-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp überlappend, das Gen motB an, welches für den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilität an Vorgängen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adhärenz und die intrazelluläre Vermehrung nicht beeinträchtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst kürzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream“ auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabhängig reguliert werden. / Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires´ disease, lives as a facultative intracellular bacterium in the environment and has the capability to survive and replicate both in protozoa and human phagocytic and non-phagocytic cells. The role of flagella and motility in the infection of host cells still has to be determined. To better characterize the flaA-region of Legionella and to learn about the organisation of flagellar genes, two clones of a cosmid library harbouring this region from the genome of L. pneumophila Philadelphia I have been sequenced. Upstream of flaA, leading in the opposite direction, the metabolic genes accD and folC could be identified. Downstream of flaA the flagellar genes flaG, fliD, coding for the flagella-capping-protein, and fliS are located. Further downstream, two ORFs with homologies to the recently described Legionella genes enhA and milA have been identified. To investigate the influence of the flagella on the infection process, the flaA negative mutant strain KH3, where the flaA gene was inactivated by insertion of a kanamycin cassette, was complemented. This could be achieved, using the suicide vector pMSS704, by integration of the intact flaA gene back into the chromosome, leading to the complemented strain CD10. It could be shown by Western blotting that strain CD10 regained the ability to express the flagellin protein. Electronmicrographs also confirmed the presence of intact assembled flagella. Using the three strains, L. pneumophila Corby wild-type, the flaA mutant KH3, and the complemented flaA mutant CD10, the behaviour of the flagellated and non flagellated strains was investigated concerning encountering, adherence, invasion, intracellular multiplication and lysis of host cells. Both protozoa (A. castellanii) and human phagocytes (HL-60 cells and freshly isolated blood monocytes) have been utilized as potential host cells. It could be shown that flagellation enables the bacteria to reach the cells. In contrast, when the motility defect was artificially overcome by centrifugation, no difference in attachment of the three strains could be detected in our experiments. However, there was a significant reduction in the invasion efficiency for the flaA negative strain which was extremely relevant to the invasion of human phagocytes. Concerning the intracellular replication rate no difference could be observed, although most likely the defect in infectivity of the flaA mutant leads to a slower growth curve in the HL-60 model when using low MOIs. For the flaA mutant strain KH1, an unexpected decrease in cytotoxicity could also be observed. However, as the flaA mutant KH3 showed wildtype behaviour in this respect, the defect is most probably independent of flagellation. The sequencing of the cosmid library clone 12/44, harbouring the genes fliA and motA, showed the clustering of further flagellar genes of Legionella. Upstream of fliA two genes could be identified, showing high similarities to the putative flagellar regulator genes motR and flhF, respectively. Downstream of motA, overlapping by 26 bp, motB is located. It also plays a major role in the function of the flagellar motor and is followed by an ORF of unknown function. Still further downstream an ORF with homologies to prfB of E. coli could be sequenced. Southern blot analysis of different Legionella-strains with a motA specific probe gave positive signals for all L. pneumophila strains, as well as for some non-pneumophila strains (e. g. L. gormanii, L. jordanis, and L. bozemanii). By insertion of a kanamycin cassette into the motA gene of L. pneumophila Corby, a motA negative mutant could also be constructed. Western blot analysis and electronmicrographs confirmed that flagellin was still expressed and assembled into flagella, while light microscopy demonstrated the inability of the mutant to swim due to the impaired flagellar motor. Experiments with A. castellanii and HL-60 cells revealed the importance of motility for the finding and the invasion of host cells as already demonstrated for the flaA mutant, while intracellular replication was not affected. Recently, a gene (flaR) has been described for L. pneumophila Corby, belonging to the LysR-familiy of transcriptional regulators. It could be shown that this regulator is able to bind both to its own promotor as well as to a lower extent to the flaA promotor. Southern hybridization of different Legionella species with a flaR specific probe revealed that FlaR must be a L. pneumophila specific factor, only being present in L. pneumophila strains, together with an upstream gene (ORF234), which is leading in the opposite direction. Fusions of the promotor regions of the two genes with the reporter gene gfp (green fluorescent protein gene) demonstrated that both promotors are actually functional in Legionella, being more active at 37°C than at 30°C. Furthermore, their activity during intracellular replication in amoebae could be demonstrated. In conclusion, the flagellum and the motility, both subject to strict regulation, are of great importance to Legionella´s ability to reach and infect potential host cells

Legionella pneumophila wurde 1976 als Erreger der Legionellose, einer schweren Form von Lungenentzündung, identifiziert. Die inzwischen 42 Arten umfassende Gattung ist weltweit in aquatischen Biotopen verbreitet. Die Bakterien leben vergesellschaftet mit anderen Mikroorganismen in Biofilmen oder intrazellulär in Protozoen. Sie haben ein duales Wirtssystem, das heißt, sie sind in der Lage, sich sowohl in Einzellern als auch in humanen Phagozyten zu vermehren. Für die Erweiterung ihrer Habitate spielen verschiedene Umweltfaktoren eine Rolle. Eine exakte und schnelle Detektion und Identifikation der humanpathogenen Keime ist sowohl für die Lokalisierung der Infektionsquelle als auch für eine rechtzeitige Therapie der Patienten von großer Bedeutung. Die Technik der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) basiert auf der Bindung einer spezifischen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde an eine komplementäre Zielsequenz der ribosomalen RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde für die in situ Hybridisierung eine neue 16S rRNA-gerichtete Sonde LEGPNE1 entwickelt, die spezifisch ist für L. pneumophila. In Versuchsreihen mit verschiedenen Bakterienkulturen wurden die Spezifität und Sensitivität der Gensonde ermittelt. LEGPNE1 erwies sich als artspezifisch und erkannte alle getesteten L. pneumophila-Stämme, ungeachtet ihrer Serogruppe. Nicht-pneumophila-Referenzstämme hybridisierten nicht mit der Sonde, ein einziger Basenaus-tausch in der Sequenz war für diese Unterscheidung ausreichend. Die Anwendung der Sonde wurde auch in Amöben-Infektionsassays und Umweltproben erfolgreich durchgeführt. Unterschiedliche, intrazellulär vorliegende Bakterien wurden von der Sonde spezifisch erkannt. Eine in situ Dokumentation der Infektions- und Vermehrungsrate war damit möglich. Durch die meist fakultativ intrazelluläre Lebensweise der Legionellen ist es wichtig, auch die Wirtszellen der Keime qualitativ zu detektieren und zu identifizieren. Die Entwicklung neuer Gensonden wurde daher auf die beiden bekannten Wirtsamöben Hartmannella und Naegleria ausgedehnt. Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die gattungsspezifischen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konstruiert und in Versuchsreihen mit Referenzstämmen bei steigender Stringenz etabliert. Mit ihrer Hilfe konnten die Ergebnisse der zeit- und arbeitsaufwendigen Determination unbekannter Amöben anhand morphologischer Merkmale bestätigt werden. In situ Hybridisierungen mit einer Kombination von 16S und 18S rRNA-gerichteten Sonden wurden in Amöben-Infektionsassays mit Hartmannella vermiformis und L. pneumophila erfolgreich durchgeführt. Eine Interferenz der Sonden fand nicht statt. Die in situ Untersuchung der Struktur und Funktion komplexer mikrobieller Lebensgemeinschaften erfordert eine kultivierungsunabhängige und hochauflösende Methode, wie sie die fluoreszierende in situ Hybridisierung darstellt. Mit dem Ziel, mögliche Präferenzen der Legionellen für bestimmte Parameter, wie pH, Temperatur, elektrische Leitfähigkeit, Strömungsverhältnisse, zu erkennen und zu definieren, wurden mit Hilfe der neu entwickelten 16S rRNA-gerichteten Sonde 21 verschiedene Kaltwasserhabitate auf die Verbreitung von Legionella untersucht. Die Bakterien zeigten jedoch ein breites Toleranzspektrum gegenüber den gemessenen Parametern. Sie waren in nahezu allen beprobten Gewässern zu finden und ließen sich unabhängig von der Jahreszeit nachweisen. Die neue Sonde LEGPNE1 zeigte sich in in situ Hybridisierungen der Umweltproben als hochspezifisch. Mit ihr konnten auch nicht kultivierbare Legionellen detektiert werden. In drei Legionella-positiven Gewässern wurde außerdem das Vorkommen von Amöben untersucht. Es konnten insgesamt acht Amöbengattungen isoliert, kultiviert und bestimmt werden. Dominierend waren Stämme des nicht humanpathogenen Naegleria gruberi-Komplexes, Echinamoeba spp. und Echinamoeba-like Amöben. In einzelnen Proben wurden Acanthamoeba spp. Gruppe II, Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata und Vexillifera spp. gefunden. Durch in situ Hybridisierung mit den neuen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konnten die Ergebnisse der morphologischen Bestimmung der Amöben bestätigt werden. Auch die Amöben zeigten keine Präferenzen bezüglich der in den Standorten gemessenen Wasserparameter. Die in situ Hybridisierung mit rRNA-gerichteten Gensonden erlaubt eine Analyse der Struktur und Dynamik von Biozönosen, ermöglicht aber keine Aussage über die speziellen Aktivitäten der nachgewiesenen Bakterien. Eine Lösung hierfür könnte der spezifische in situ Nachweis von mRNA-Molekülen darstellen. Ein Problem hierbei stellt ihre, im Vergleich zu anderen Molekülen wie rRNA, sehr kurze Halbwertszeit und das Vorhandensein von nur wenigen Kopien pro Zelle dar. Daher ist im Anschluss an die in situ Hybridisierung in den meisten Fällen eine Signalamplifikation nötig, um ein detektierbares Signal zu erhalten. In dieser Arbeit sollte die für das iap-Gen in Listeria monocytogenes entwickelte Methode zum Nachweis der mip-mRNA in L. pneumophila etabliert werden. Erste Anwendungen in Dot blot- und in situ Hybridisierungen mit mehrfach DIG-markierten Polyribonukleotidsonden bzw. mit simultan eingesetzten, einfach DIG-markierten Oligonukleotiden zeigten noch nicht die gewünschte Spezifität. Diese Ergebnisse stellen jedoch eine wichtige Grundlage für zukünftige Experimente dar. / Legionella pneumophila was identified in 1976 as the causative agent of a life-threatening atypical pneumonia. Today the genus comprises about 42 species which are spread worldwide in aquatic biotopes. The bacteria live in association with other microorganisms in biofilms as well as intracellularly in protozoa. They have a dual host system which means that they are able to replicate both in protozoans and in human phagocytes. Several environmental factors are known to play a role in their distribution. The ability to quickly detect and to exactly identify these potential human pathogens is important in order to recognize reservoirs for disease as well as to treat patients in due time. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique based on the reaction of a specific oligonucleotide, labeled with a fluorescence marker, with the complementary rRNA target region. In this work a new 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe LEGPNE1 for in situ hybridization was developed, which is specific for L. pneumophila. The specificity and the sensitivity of the probe were evaluated in experiments with different bacterial cultures. LEGPNE1 was demonstrated to be highly species-specific recognizing all tested strains of L. pneumophila independently of the serogroup. Non-pneumophila reference strains did not hybridize with the probe. Only one mismatch in the sequence was shown to be sufficient for the oligonucleotide to distinguish between complementary and nearly complementary sequences. The probe was also applied successfully to infected amoebal cells and environmental samples. Different bacteria located intracellularly were recognized specifically by the probe. This allows the in situ monitoring of bacterial infection and multiplication rates in amoebae. As legionellae presumably live most of the time as intracellular parasites, it is also important to be able to detect their hosts. Therefore, the design of new probes was extended to cover two known host amoebal genera, Hartmannella and Naegleria. Based on comparative sequence analysis the genus-specific 18S rRNA-targeted probes HART498 and NAEG1088 were constructed. Subsequently they were tested in hybridization series with different reference strains and gradually increasing stringency. Amoebal strains which had been identified previously based on their morphological features could be reconfirmed using in situ hybridization with these new oligonucleotides. In situ hybridization experiments of infection assays with Hartmannella vermiformis and Legionella pneumophila using a combination of 16S and 18S rRNA-targeted probes were done successfully. Interference of the probes with the results of the tests was not observed. For the analysis of the composition of complex microbial communities a culture-independent and highly specific method is required. This can be achieved by the fluorescence in situ hybridization. In order to determine potential preferences of legionellae for water parameters such as pH, temperature, conductivity, or water current, twenty-one different cold water habitats were examined for the presence of Legionella using the newly designed 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe. The bacteria were shown to be able to tolerate a broad range of the measured parameters. They could be found in nearly all of the habitats investigated independent of the season. The new probe LEGPNE1 was proved to detect L. pneumophila in environmental samples highly specifically, even if the cells were in a nonculturable state. Three Legionella-positive sampling sites were examined for the presence of amoebae. Using traditional culture methods followed by morphological determination, eight amoebal genera could be isolated and identified. Most abundant were strains of the apathogenic Naegleria gruberi-complex, Echinamoeba spp. and Echinamoeba-like amoebae. Other species including Acanthamoeba spp. (sequence type II), Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata and Vexillifera spp. were found sporadically. In situ hybridization experiments using the new 18S rRNA-targeted oligonucleotide probes HART498 and NAEG1088 confirmed the determinations done by morphological criteria. Concomitant analysis of selected water parameters revealed no preference of the protozoa for certain environmental conditions. In situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes is a powerful tool to analyze structure and dynamics in biocenosis. However, this technique does not provide much information about the in situ function of the detected bacteria. The specific in situ detection of mRNA molecules allows to narrow this gap. One problem in the application of this method is the instability and low copy number of mRNA in each cell compared to other molecules like rRNA. Therefore, a signal amplification posterior to the in situ hybridization is required in most cases in order to generate a detectable signal. In this work the detection of the mRNA of mip in L. pneumophila was to be established using a protocol developed for the detection of iap in Listeria monocytogenes. However, first applications of dot blot and in situ hybridizations using DIG-conjugated polyribonucleotide probes and several DIG-labeled oligonucleotides applied simultaneously did not show the neccessary specificity. This technical approach will be essential for further experiments in this field of research.

Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist. / The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila was first identified in 1977 as the etiologic agent of legionellosis, a severe and atypical pneumonia. It possesses a dual host system which allows the bacteria to replicate in protozoa in aquatic habitats as well as a pathogen in human phagocytic cells. In order to analyze the complex interaction of the bacterial pathogen and its host cells, in this thesis a new GFP reporter system was established and sussessfully evaluated. It is now possible to monitor a Legionella infection in vivo and to quantify bacterial invasion influenced by different factors in a more convenient way. To analyze GFP expression in Legionella a transcriptional fusion of the gfpmut2 gene with the Legionella-specific mip (macrophage infectivity potentiator) promoter was constructed. In addition, a vector habouring the sod (super oxid dimutase) promoter derived from Listeria monocytogenes was used. Following transformation into Legionella strains strong GFP-mediated fluorescence was detected confirming the functionality of GFP in Legionella for the first time. Using fluorescence microscopy, spectrofluorimetry and flow cytometry (FACS-analysis) the strains were examined regarding differences in virulence and intracellular replication. Re-confirming results from earlier studies obtained by using enumeration of CFU values showed the validity of the method. Quantification of the mip promoter activity revealed a constitutively expression, this indicates that differences in Legionella virulene are not due to variations in mip promoter activity. Moreover, the influence of different phagocytosis inhibitors on Legionella uptake into the protozoan hosts Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis using the GFP reporter system was examined. Application of cytochalasin D had no influence on bacterial uptake in A. castellanii and H. vermiformis suggesting in microfilament-independent mechanism. Phagocytosis in H. vermiformis is mainly accomplished using receptor-mediated phagocytosis as it was evident from inhibition studies with cycloheximide and methylamine. In contrast, phagocytosis in A. castellanii is mediated by other receptors or additional mechanisms are available. This results confirm the proposed heterogeneity of uptake mechanisms by different protozoan hosts. After L. pneumophila is phagocytosed the endosomal pathway of phagosome maturation is blocked, by means of secreted but as yet unidentified effector molecules. To study a putative protein translocation C-terminal Mip::GFP fusion proteins were constructed. The stability of the proteins was rather weak which is likely due to the dimeric conformational state of the Mip protein. In addition, transport over the cytoplasmic membran was not accomplished. Therefore the fusion proteins proved not to be useful for examine translocational events. Because of the unknown in vivo function of bacterial PPIases the focus in the the second part of this work was to identify a putative interaction partner of the Mip protein and to elucidate the influence of dimerization and PPIase activity on Legionella's virulence. Using cross linking experiments a putative interaction partner could be detected. N-terminal sequencing revealed no homology to already known Legionella or other proteins. N-terminal blockade of the putative partner molecule may be the cause that hampered sequence identification. It has been shown that the isomerase activity of the Legionella Mip protein is not necessary for invasion and intracellular survival in protozoan, monocytes and U937 macrophages. Additional features of the protein are its homodimeric conformational state and the assoziation with the outer membrane. In cooperation with the group of Prof. Dr. G. Fischer in Halle a N-terminal truncated (aa 4-79) dimerization-deficient Mip protein (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) was constructed and biochemically characterized. Using site specific mutagenesis participation of the N-terminal located amino acids (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) in the dimerization of the Mip protein was confirmed. To analyze the influence on pathogenicity of the dimeric state of the Mip protein a mip negative strain was complemented by providing the gene encoding the monomeric Mip (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) in cis. The proper integration and protein expression was confirmed. The results demonstrate that the isomerase activity is dispensable for intracellular growth in protozoan hosts. Moreover, the results clearly demonstrated that dimerization and not the isomearse activity are essential for virulence of Legionella in a monocellular system. In contrast, it could be shown that the isomerase activity is necessary for full virulence in the animal model (guinea pigs). The loss of the isomerase avtivity have a more dramatic impact on the intracellular survival of Legionella compared to the monocellular system (A. castellanii). Moreover, Legionella strains replicated intracellulary dependent on their remaining in vitro isomerase activity. Using the monomeric Mip expressing strain L.p.JR32-2.4 it could be demonstrated that dimerization also plays a role in the animal model. This work provides evidence for a different role of the isomerase activity of the Mip protein in monocellular systems and during the infection of higher organisms.

Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 beschrieben, nachdem der Erreger aus dem Lungengewebe eines Patienten isoliert wurde, der an einer schweren atypischen Pneumonie erkrankt war. Das Bakterium zeichnet sich durch ein duales Wirtssystem aus und kann sich sowohl in Protozoen als auch in humanen Zellen vermehren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, wichtige Faktoren einer Legionelleninfektion seitens der Wirtszelle zu betrachten. Als Wirtsmodell diente die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum. Mit Hilfe eines von Patrick Farbrother (Universität Köln) etablierten Dictyostelium DNA-Microarrays mit 5906 genspezifischen Sonden, wurde die Genexpression von D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion durch L. pneumophila untersucht. Zur Kontrolle dienten uninfizierte Zellen, und Zellen, die mit L. hackeliae bzw. einer dotA-Mutante von L. pneumophila koinkubiert wurden. Diese beiden Stämme weisen eine verminderte Pathogenität bzw. ein deletiertes Pathogenitätsgen auf. Für den Zeitpunkt 24 h nach Infektionsbeginn wurden 140 Gene gefunden, die in D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion mit L. pneumophila differentiell exprimiert werden. Einige Gene codieren bereits bekannte Proteine von D. discoideum. Dazu gehören das RtoA (ratioA, Fusion von Vesikeln), Discoidin I, CotB (spore coat Protein SP70) und die lysosomale α-Mannosidase. Mit Hilfe von Homologie-Suchen konnte weiteren unbekannten Proteinen eine Funktion zugeteilt werden. Hierzu zählen die Chaperone ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP (coat protein) und drei calciumbindende Proteine. Nach Einteilung in funktionelle Kategorien, konnte gezeigt werden, dass viele Gene reguliert werden, deren Produkte am Aminosäure-Metabolismus beteiligt sind oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Nramp-Protein von D. discoideum näher untersucht. Nramp transportiert zweiwertige Kationen über die phagosomale Membran. Es konnte festgestellt werden, dass die Aufnahme von L. pneumophila und M. avium in eine nramp-Mutante deutlich reduziert ist. Allerdings ist eine vermehrte Replikation von Legionellen und Mykobakterien in der Wirtsmutante zu beobachten. In Zusammenarbeit mit Salvatore Bozzaro (Turin, Italien) konnte gezeigt werden, dass während einer Infektion mit L. pneumophila die nramp-Expression sinkt und bereits nach 48 h annähernd keine nramp-RNA im Northern-Blot nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu bleibt die nramp-Expression während einer Infektion mit M. avium relativ konstant. In Infektionsstudien konnte nachgewiesen werden, dass sich die Endozytobionten TUME1, UWE25 und UWC6 in D. discoideum vermehren können. Mit Hilfe von spezifischen Cy3-markierten 16S-rRNA Sonden wurde die intrazelluläre Zunahme der Bakterien über 48 h beobachtet. Zum Zeitpunkt 48 h nach Inokulation konnte eine erhöhte Anzahl der drei Endozytobionten in D. discoideum festgestellt werden. Anhand von elektronenmikro-skopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Stämme TUME1 und UWE25 im Zytoplasma des Wirtes von membranösen Strukturen eng umschlossen sind. UWC6 konnte sowohl in Vakuolen als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Lokalisierung der Endozytobionten entspricht ihrer Lokalisierung in ihren natürlichen Wirten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Funktionsanalyse des Mip-Proteins aus L. pneumophila. Das Mip-Protein von Legionella gehört in die Klasse der FK506-Bindeproteine. Es besitzt Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität und bildet Homodimere. Mip kann an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen binden, speziell an das Collagen IV. Mit Hilfe von Transwell-Versuchen konnte festgestellt werden, dass Mip für die Penetration von Legionella durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen verantwortlich ist. Die Penetrationsfähigkeit konnte nach Hemmung der PPIase-Aktivität durch FK506 bzw. Rapamycin gehemmt werden. Ebenso waren Legionellen nach Hemmung der Serinproteaseaktivitäten im Transwell-System nicht mehr in der Lage die Barriere aus Epithelzellen mit extrazellulärer Matrix zu durchwandern. Mit Hilfe von Degradationsassays mit S35-markierter extrazellulärer Matrix konnte gezeigt werden, dass mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix degradieren können. Nach Hemmung der PPIase-Aktivität bzw. Serinproteaseaktivität konnten mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix nicht mehr degradieren. / The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila is the etiological agent of Legionnaire’s disease. It was first described in the year 1977 after isolation of the lung of a patient who had a severe atypical pneumonia. The bacterium possesses a dual host system and can replicate within protozoa and human cells. The main focus of this work was to identify host cell factors which are important during Legionella infection. As a host model system we used the social amoeba Dictyostelium discoideum. In cooperation with Patrick Farbrother (University of Cologne) who established a Dictyostelium DNA-microarray we have been able to investigate the gene expression of Dictyostelium during Legionella infection. The microarray consists of 5906 gene-specific probes representing about half the genome of D. discoideum. As controls we isolated RNA from uninfected cells and cells after coincubation with L. hackeliae as well as a dotA-mutant of L. pneumophila. Both are Legionella strains with reduced pathogenicity and a deleted pathogenicity gene respectively. Approximately 24 h after infection we identified 140 differentially expressed D. discoideum genes. Some of these genes encode well characterised D. discoideum proteins like RtoA (ratioA, vesicle fusion protein), Discoidin I, CotB (spore coat protein SP70) and the lysosomal α-Mannosidase. By homology searches the functions of others could be assigned, like the chaperones ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP (coat protein) and three calcium-binding proteins. When characterising the probes by cellular processes the alteration of gene expression was analysed on functional level. A lot of genes were regulated whose products are involved in nucleotid metabolism or that are ribosomal proteins. Furthermore we investigated the role of the Nramp-protein of D. discoideum. L. pneumophila as well as M. avium were more efficiently phagocytosized from wildtype Dictyostelium than from nramp-mutants. In contrast to phagocytosis, the replication rate of both bacteria was much higher in the mutant than in the wildtype. In cooperation with Salvatore Bozzaro (Turin, Italy) we have been able to show a decrease of nramp-expression during infection with Legionella. Approximately 48 h after infection virtually no nramp-RNA was detectable by northern blots. In contrast to these results, the nramp-expression was nearly constant during an infection by Mycobacteria. By infection studies it was shown that the endocytobionts TUME1 UWE25 and UWC6 were able to replicate within D. discoideum. The intracellular increase of the bacteria within 48 h was detected by fluorescent in situ hybridisation with specific Cy3-labeled 16S-rRNA probes. By means of electron micrographs we were able to show that the strains TUME1 and UWE25 resided within the host cytoplasm closely surrounded by membranous structures. UWC6 was found in vacuoles as well as in the cytoplasm. Localisation of the endocytobionts corresponds to their localisation in their natural hosts. A further aim of this work was to investigate the function of the L. pneumophila Mip-protein. The Mip-protein of Legionella belongs to the FK506 binding proteins. Mip exhibits peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity and creates homodimers. We showed that mip binds to the extracellular matrix of lung epithelial cells especially to collagen IV. By using the transwell-system we demonstrated that Mip is responsible for Legionella penetrating a barrier of lung epithelial cells and their extracellular matrix. After blocking the PPIase-activity by FK506 or Rapamycin, the ability of Legionella-penetration was dramatically reduced. Also after inhibition of serinprotease-activities in the transwell-system, Legionella was not able to penetrate through the barrier. Degradation-assays with S35-labeled extracellular matrix indicated that mip-positive Legionella are able to degrade extracellular matrix. After inhibiting the PPIase-activity or serinprotease-activities mip-positive Legionella were no longer able to degrade extracellular matrix.

Die haploide Amöbe Dictyostelium discoideum hat sich als geeinet erwiesen für die Untersuchung der zellulären Aspekte der Legionella Infektion. Nach der Aufnahme befindet sich L. pneumophila innerhalb eines unreifen Phagosoms das weder angesäuert wird noch mit Lysosomen fusioniert. In dieser Studie wurden die Wirtzellfaktoren untersucht, die Legionella eine erfolgreiche Kolonizierung des Wirt ermöglichen. Phagozytoseversuche mit spezifischen zellulären Inhibitoren und die Analyse der Aufnahme in definierten Wirtzell-Mutanten haben gezeigt, daß das zytoplasmatische Kalziumniveau, Zytoskelettproteine und die Kalzium-bindenden Proteine des ERs, Calreticulin und Calnexin, spezifisch die Aufnahme und das intrazelluläre Wachstum von L. pneumophila beeinflussen. Mikroskopisches Untersuchungen mit GFP-markierten Calnexin und Calreticulin haben gezeigt, dass beide Proteine spezifisch in den "phagocytic cups" der L. pneumophila-infizierten Wirtszellen akkumulieren. Beide Proteine umhüllten die replikative Vakuole von L. pneumophila während der gesamten Replikation des Bakteriums. Die kumulativen Effekte intrazellulären Kalziumniveaus, die räumliche Verteilung von Calnexin und Calreticulin und die Defekte Aufnahme und intrazelluläre Vermehrung von L. pneumophila im Calnexin- und Calreticulin-minus der Zellen deuten darauf hin, daß diese Faktoren ein Teil des Regulationssystems sind, der zu der Bildung der spezifische Vakuole von L. pneumophila führt. / The haploid amoeba Dictyostelium discoideum is a versatile host system for studying cellular aspects of Legionella pathogenicity. Previous studies have shown that the internalization of L. pneumophila leads to an endoplasmic reticulum (ER)-derived organelle that supports intracellular replication of the bacteria. In this study a roadmap of host-cell factors involved in this process was developed. Phagocytosis assays with specific cellular inhibitors and the effects of well defined host-cell mutants revealed that cytoplasmic calcium levels, cytoskeleton-associated proteins and the calcium-binding proteins of the ER, calreticulin and calnexin, specifically influence the uptake and intracellular growth of L. pneumophila. Confocal microscopic time series with green fluorescent protein (GFP)-tagged calnexin and calreticulin demonstrated the accumulation of both proteins in the phagocytic cup of L. pneumophila-infected host cells. In contrast to the control experiment with Escherichia coli-containing phagosomes, both proteins decorated the replicative vacuole of L. pneumophila during the entire growth phase of the bacteria. The cumulative effects of cytosolic calcium levels, the spatial distribution of calnexin and calreticulin, and the defective invasion and replication of L. pneumophila in calnexin- and calreticulin-minus cells suggest that these factors are part of a regulatory system that leads to the specific vacuole of L. pneumophila.